SOLUCIN TALLER BIOQUIMICA Un estudiante asla una protena de bacterias anaerobias y la analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida que

contiene SDS (PAGE-SDS). Despus de la tincin de protenas, una sola banda aparece, lo que le parece muy importante al supervisor del estudiante. Para estar seguro, el supervisor sugiere ejecutar una segunda electroforesis en condiciones nativas (es decir, no desnaturalizante, o sin SDS). Este gel muestra dos bandas despus de la tincin. Suponiendo que no se cometieron errores durante estos experimentos, explique en detalle las observaciones. La electroforesis con SDS es un excelente mtodo para identificar y monitorear las protenas durante un proceso de purificacin; tambin se emplea para la determinacin del peso molecular de las subunidades de protenas. La estructura del detergente SDS empleado en esta variacin de la electroforesis en gel de poliacrilamida es CH3 (CH2)10 CH2 = SO3-Na+. El anin se une a las protenas por absorcin no especfica (aproximadamente una molcula de SDS por cada dos residuos de aminocidos, con una relacin SDS/protena mximo de 1,4 g/g). El SDS desnaturaliza por completo las protenas y rompe las interacciones no covalentes que determinan la estructura terciaria y cuaternaria. Los grupos alifticos dodecil se colocan en el interior, mientras que los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDSprotena toman carga neta negativa (que excede la carga intrnseca de las cadenas de aminocidos). Las protenas reaccionan con SDS a relativamente alta concentracin, pero se ha demostrado que 0,4 % de SDS es el nivel mnimo necesario para saturar los sitios de unin de la protena, sin embargo, se emplea 1 % para lograr un margen de seguridad. Al estar cargados todos los AA. Negativamente los aminoacidos se quedan en muy cerca al Anodo formando una sola banda Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la protena que les permite migrar a travs del gel de poliacrilamida en relacin directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta, existiendo una relacin carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la protena en sus subunidades. Adems, la desnaturalizacin hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migracin es proporcional al tamao y no a su estructura terciaria ni a su interaccin con otras macromoleculas. As, los ms grandes se desplazan ms lentamente.

ANALISIS DEL POLIPEPTIDO GOLT AISLADO DE LAS BACTERIAS CHROMODOPHYLA VILIDI HIDROLISIS ACIDA: RESULTADO.
(Ala4, Val, Lys2, Arg, Gly, Asp, Met, Pro, Trp)

El primer paso para determinar la estructura primaria de una protena es identificar y cuantificar sus constituyentes. La protena o polipptido a ser analizados se hidrolizan, primero, por tratamiento con cido fuerte a 110 durante 24 horas. Este tratamiento rompe las uniones peptdicas y libera los aminocidos individuales. Adems, la glutamina y asparagina se hidrolizan a glutamato y aspartato, respectivamente, mientras que el triptfano se destruye casi por completo. DIGESTIN CON CARBOXIPEPTIDASA: RESULTADO. (Lys) Esta exopeptidasa cliva, secuencialmente, los enlaces peptdicos comenzando desde el extremo C-terminal. El aminocido C-terminal ser, por lo tanto, el primer aminocido liberado por la carboxipeptidasa. TRATAMIENTO CON DINITROFLUOROBENZENO: RESULTADO. (Val) Reactivo de Sanger: Esta tcnica de secuenciamiento utiliza el compuesto, 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNF) que reacciona con el residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas. El aminocido derivado se puede hidrolizar y ser etiquetado con un grupo dinitrobenzeno que imparte un color amarillo al aminocido. La separacin de los aminocidos modificados (DNP-derivado) por electroforesis y la comparacin con la migracin de los estndares del DNPderivado permite la identificacin del aminocido N-terminal. TRATAMIENTO CON BROMURO DE CIANGENO RESULTADO. Genera dos polipptidos: Un pptido A: (Gly, Arg, Trp, Asp, Lys, Ala); El tratamiento de este pptido con DNBF y carboxipeptidasa genera: DNFB: Gly; carboxipeptidasa Lys.

Un pptido B: (Ala3, Lys, Val, Met, Pro); El tratamiento de este pptido con DNFB y carboxipeptidasa genero: DNFB: Val; Carboxipeptidasa: Met. Este reactivo causa ruptura especfica en el lado C-terminal de los residuos M. El nmero de fragmentos peptdicos que resultan de la ruptura de CNBr son equivalentes a uno o ms que el nmero de los residuos M de una protena. DIGESTIN CON TRIPSINA RESULTADO. Produce tres pptidos. Pptido C: (Lys, Trp, Ala); El tratamiento de este pptido con DNFB produce: Trp Pptido D: (Ala3, Val, Lys, Pro) Pptido E: (Met, Asp, Gly, Arg); El tratamiento de este pptido con DNFB produce: Met La capacidad de obtener pptidos de esta longitud, de las protenas de mayor longitud, se facilita por el uso de enzimas, endopeptidasas, que se rompen en los sitios especficos dentro de la secuencia primaria de las protenas. Los pequeos pptidos resultantes se pueden separar cromatogrficamente y ser sometidos a las reacciones de secuenciamiento de la degradacin de Edman. Especificidades de Varias Endoproteasas Especificidad Puntos adicionales Enlace peptdico C-terminal altamente especfico para Pncreas de Tripsina a R, K, pero no si esta al residuos cargados bvinos lado de P positivamente THERMOLYSINE RESULTADO. Val. Ala. Ala. (Ala, Lys, Pro) ANALISIS DE RESULTADOS Por medio de la hidrolisis acida, obtenemos los aminocidos de los cuales se conforma la cadena peptdica. Cuando se hace la digestin por carboxipeptidasa, el primer residuo que arroja es la lisina (Lys), lo cual nos indica que es el aminocido que contiene el carbono terminal del polipptido. De igual forma para identificar el grupo amino terminal del polipptido se utiliza el reactivo de Sanger (2,4-dinitrofluorobenceno) en un medio alcalino, asi el Enzima Fuente

aminocido derivado se puede hidrolizar y ser etiquetado con un grupo dinitrobenzeno que imparte un color amarillo al aminocido. AA. Valina (Val) Hasta ahora ya sabemos que el AA. Inicial es la Valina y el AA. Terminal es la Lisina. Cuando se trata con CNBr, en el polipptido se genera una roptura en el Cterminal de los residuos de Metionina. Cuando se generan los 2 peptidos correspondientes al tratamiento con CNBr encontramos Un pptido A: (Gly, Arg, Trp, Asp, Lys, Ala); El tratamiento de este pptido con DNBF y carboxipeptidasa genera: DNFB: Gly; carboxipeptidasa Lys. Un pptido B: (Ala3, Lys, Val, Met, Pro); El tratamiento de este pptido con DNFB y carboxipeptidasa genero: DNFB: Val; Carboxipeptidasa: Met. Con los anlisis hechos hasta el momento, se puede deducir una posible conformacin de la estructura del polipptido. Posible estructura: Val - (Ala3 Lys - Pro) Met Gly (Arg Trp Asp - Ala) - Lys Con residuos an sin identificar su posicin. Al realizar la digestin con tripsina el polipptido se rompe en regiones especificas y se producen 3 peptidos. Pptido C: (Lys, Trp, Ala); El tratamiento de este pptido con DNFB produce: Trp Pptido D: (Ala3, Val, Lys, Pro) Pptido E: (Met, Asp, Gly, Arg); El tratamiento de este pptido con DNFB produce: Met Para el pptido C cuando se realiza el anlisis con DNF tenemos el AA. Con el grupo Amino terminal es el Trp, y ya sabemos que la Lys es el ultimo AA. O el que contiene el Carbono Terminal. Conformacin Peptido C: Trp-Ala-Lys. Cuando se analiza el pptido E en condiciones igual que las del anterior tenemos que Met es el AA inicial de ese pptido y tenemos que la Asp esta en medio de la Met y la Gly, lo que no habamos identificado cuando trazamos la posible estructura. En el pptido D: vemos que en este pptido esta ubicado el residuo de Val, entonces ya sabemos que la Val es el AA con el grupo amino terminal del pptido, entonces nos queda la porcin (Ala3, Lys, Pro) por analizar. Con los nuevos datos la posible estructura del pptido cambia a la siguiente:

Val - (Ala3 Lys - Pro) Met Asp - Gly Arg Trp - Ala Lys Y los resultados de la Thermolysine, nos arroja el resultado de: Val. Ala. Ala (Ala Lys - Pro) anlisis que nos resuelve el problema de los aminocidos Ala3, Lys, Pro Por lo tanto, la estructura del Polipeptido es: Val Ala Ala Ala Lys - Pro Met Asp - Gly Arg Trp - Ala Lys.