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1. Tipos de electroforesis Existen principalmente dos mtodos electroforticos ampliamente utilizados: la electroforesis convencional y la electroforesis capilar.

La primera se lleva a cabo sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. La disolucin tampn, que ser el medio conductivo, cubre la capa de papel o de gel. Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a travs de la placa. Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso de la corriente y, si es necesario, las muestras se tien para visualizarlas. 1.1 Electroforesis de frente mvil o libre 1.2. Electroforesis de zona: Electroforesis en papel Electroforesis en gel Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categoras: a) Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo) Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) PAGE en condiciones desnaturalizante PAGE en condiciones no desnaturalizantes SDS PAGE Isoelectroenfoque Electroforesis en campos pulsantes

b) Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

1.3 Electroforesis capilar 1.3.1 Electroforesis capilar de zona (CZE) 1.3.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) 1.3.3 Isotacoforesis capilar (CITP) 1.3.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF) 1.3.5 Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC) Explicaremos ahora las electroforesis ms comunes, utilizadas en laboratorio: SDS PAGE Permite el clculo de parmetros moleculares, pues los complejos SDS-protena se separan estrictamente segn su tamao molecular. El SDS interacciona con las protenas formando complejos de caractersticas comunes independientemente de las de cada protena. Las protenas unen una molcula de SDS por cada dos aminocidos, lo que implica que las cargas propias de las protenas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la molcula de SDS proporciona una carga negativa, por lo que los complejos SDS-protena estn cargados negativamente de forma uniforme. Como se coment, la movilidad electrofortica en una PAGE es funcin del tamao y de la carga por unidad de masa; como sta es constante para todos los complejos SDS-protena, esta movilidad es solamente funcin de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la masa molecular de la protena, mayor ser la movilidad de la misma y viceversa. En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de protenas debido a:

1 La gran mayora de las protenas son solubles en SDS. 2 Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo sentido. 3 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas. 4 La separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa molecular, que se puede calcular. 5 Los complejos SDS-protena se tien fcilmente. Figura: Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforetica de proteinas monomericas. En una proteina nativa de 25 KDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS (_____) o con SDS + DTT (--------) producen identico resultado. La proteina con un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. El tratamiento con SDS + DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de la proteina.

Isoelectroenfoque Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfteros se separan segn su punto isoelctrico (pI; pH al cual la carga neta de la protena es nula) en un gradiente continuo de pH. En todos los mtodos electroforticos descritos anteriormente, la difusin es un fenmeno con efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminuyendo la resolucin. En el EEF el efecto de la difusin es mnimo y por ello posee una enorme resolucin, pudiendo llegar a separar protenas que difieran en 0.001 unidades de pI. Esto se debe a que si una protena focalizada en su pI se desplazase por difusin, adquirira carga (positiva o negativa segn hacia el polo que difundiera) y por efecto del campo elctrico volvera a la zona de su pI; esto se llama efecto focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resolucin. Adems, el EEF aumenta su resolucin al disminuir el intervalo de gradiente de pH. Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF; para ello, se emplean compuestos anfteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son pequeas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos cidos y bsicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad de tamponacin cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad. Una disolucin de una mezcla de estos anfolitos tendrn un pH prximo al promedio de los pI. Si esta disolucin se emplea para la preparacin de un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia de potencial cada molcula de anfolito migrar hacia uno u otro polo en funcin de su carga, hasta alcanzar la zona de su pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel. Si, debido a la difusin, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquiriran carga y experimentaran el efecto focalizante mencionado anteriormente. Una de las aplicaciones ms importantes del EEF es el clculo de pI (figura ..); en el pocillo I se aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea conocer. El carril III (sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Una vez corrido el gel, se trocea el carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en 1mL de agua, determinndose su pH. Finalmente, se representa el pH de cada fraccin, frente a su posicin en gel. La distancia migrada por la muestra (X) se interpola en la recta obtenida, determinndose as su pH.

Figura: Determinacin del punto isoelectrico de una muestra.

1. Desventajas presentes en la electroforesis Desventajas en la e. con papel: si el papel es fino se puede desgarrar con facilidad si el papel es grueso, las bandas se distorsionan se produce iteracin entre las proteinas y los grupos hidroxilos de la celulosa del papel, por lo tanto la migracin se frena. Calidad del papel: 90% de alfa celulosa. Absorcin de agua y conductividad electrica. Efecto electroosmotico anodo- ctodo(1) Desventajas en la e. con acetato de celulosa: puede contener algunos grupos, como acido carboxilico y sulfato, que producen fenmeno electrosmosis. Desventajas de la e. en gel: El tamao de los poros y el radio de la molcula van a producir cierta resistencia o friccio al movimiento de migracin de la muestra en el gel. Desventajas de la e. en acetato de celulosa: La tiras de acetato de celulosa tiene propiedades de adsorcion minimas, por lo que captan poco agua y son mas susceptibles a la evaporacin que el papel. Son tambien mas susceptibles al flujo electro - endosmotico (1) Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolucin inica. Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan segn su carga, pero en su migracin se encuentran con un flujo de cationes desplazndose sobre la superficie del soporte y otro de aniones hacindolo por el centro de los poros (figura 2.1). Este flujo orientado se llama flujo electroendosmtico. El EEO va en contra de la resolucin de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuir a una mejor resolucin en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis

SDS PAGE Permite el clculo de parmetros moleculares, pues los complejos SDS-protena se separan estrictamente segn su tamao molecular. El SDS interacciona con las protenas formando complejos de caractersticas comunes independientemente de las de cada protena. Las protenas unen una molcula de SDS por cada dos aminocidos, lo que implica que las cargas propias de las protenas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la molcula de SDS proporciona una carga negativa, por lo que los complejos SDS-protena estn cargados negativamente de forma uniforme. Como se coment, la movilidad electrofortica en una PAGE es funcin del tamao y de la carga por unidad de masa; como sta es constante para todos los complejos SDS-protena, esta movilidad es solamente funcin de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la masa molecular de la protena, mayor ser la movilidad de la misma y viceversa. En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de protenas debido a: 1 La gran mayora de las protenas son solubles en SDS. 2 Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo sentido. 3 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas. 4 La separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa molecular, que se puede calcular. 5 Los complejos SDS-protena se tien fcilmente. Figura: Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforetica de proteinas monomericas. En una proteina nativa de 25 KDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS (_____) o con SDS + DTT (--------) producen identico resultado. La proteina con un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. El tratamiento con SDS + DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de la proteina.

Isoelectroenfoque Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfteros se separan segn su punto isoelctrico (pI; pH al cual la carga neta de la protena es nula) en un gradiente continuo de pH. En todos los mtodos electroforticos descritos anteriormente, la difusin es un fenmeno con efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminuyendo la

resolucin. En el EEF el efecto de la difusin es mnimo y por ello posee una enorme resolucin, pudiendo llegar a separar protenas que difieran en 0.001 unidades de pI. Esto se debe a que si una protena focalizada en su pI se desplazase por difusin, adquirira carga (positiva o negativa segn hacia el polo que difundiera) y por efecto del campo elctrico volvera a la zona de su pI; esto se llama efecto focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resolucin. Adems, el EEF aumenta su resolucin al disminuir el intervalo de gradiente de pH. Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF; para ello, se emplean compuestos anfteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son pequeas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos cidos y bsicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad de tamponacin cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad. Una disolucin de una mezcla de estos anfolitos tendrn un pH prximo al promedio de los pI. Si esta disolucin se emplea para la preparacin de un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia de potencial cada molcula de anfolito migrar hacia uno u otro polo en funcin de su carga, hasta alcanzar la zona de su pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel. Si, debido a la difusin, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquiriran carga y experimentaran el efecto focalizante mencionado anteriormente. Una de las aplicaciones ms importantes del EEF es el clculo de pI (figura ..); en el pocillo I se aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea conocer. El carril III (sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Una vez corrido el gel, se trocea el carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en 1mL de agua, determinndose su pH. Finalmente, se representa el pH de cada fraccin, frente a su posicin en gel. La distancia migrada por la muestra (X) se interpola en la recta obtenida, determinndose as su pH.

Figura: Determinacin del punto isoelectrico de una muestra.