Manual de Prácticas Procesos Biotecnológicos

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

ESCUELA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
TA-0115 PROCESOS BIOTECNOLOGICOS
Manual de Prácticas de Laboratorio

segundo semestre 2015
TA-0115 PROCESOS BIOTECNOLOGICOS
Índice
1. Introducción al laboratorio……………………………………………………………………………………………………1
2. Sacarificación enzimática del almidón y estudio del efecto del pH y la temperatura sobre la
actividad enzimática de la a-amilasa…………………..………………………..……………………………………….9
3. Licuación enzimática de pulpa de banano o plátano….…………………………………………………........17
4. Efecto del tiempo y temperatura de exposición sobre la inactivación de la peroxidasa en
diferentes materiales vegetales………………………………………………………………………………………..…23
5. Preparación y manejo de cultivos de referencia……………………………………………………….………….25
6. Elaboración de sauerkraut (fermentación láctica de repollo) ………………………………………………28
7. Elaboración de cebollas fermentadas………………………………………………...………….………………….30
8. Fermentación alcohólica…………………………………………………………………..…………………………………33
9. Análisis de cerveza ………………………………………………………………………..…..……………………………… 35
10. Elaboración de cerveza……………………………………………………………………..…………………………………41
TA-0115
PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS
Formandoal
Laboratorio1: Introducción profesionales
laboratoriode calidad para la industria II ciclo 2014
alimentaria
Profesora: M.Sc. Andrea Irías Mata
Introducción
En los laboratorios de bioquímica y similares es de suma importancia que el analista o
investigador cuente con una buena habilidad para medir y transferir de manera exacta y
reproducible volúmenes pequeños de líquidos menores a 1 mL. Para estos fines se utilizan la
micropipeta1, su diseño y partes se muestra en la figura 1.
Figura 1. Micropipeta y sus partes
El uso correcto de la micropipeta es esencial para garantizar resultados confiables, por lo

que esta debe ser adecuadamente manipulada, verificada y cuando sea necesario, calibrada. Los
parámetros de precisión y exactitud son los que se evalúan en la verificación, y se comparan con
las especificaciones del instrumento.
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El método más simple es la verificación por gravimetría, que consiste en pesar el volumen
emitido por la micropipeta y relacionar esta magnitud con la densidad a una temperatura
determinada, para obtener el volumen exacto2.
La espectrofotometría es una técnica ampliamente utilizada en los laboratorios para el
análisis cuantitativo de numerosos compuestos, debido principalmente a su sencillez operativa y
a la rapidez en el análisis.
La concentración de una sustancia puede ser calculada a partir de la cantidad de luz
absorbida por una muestra, en el rango del espectro del ultravioleta (UV) y visible (Vis) aplicando
la ley de Lambert-Beer.
Para generar datos confiables es de gran importancia la verificación previa del
funcionamiento del espectrofotómetro. Los principales parámetros a controlar en estos equipos
son: la exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisión fotométrica y la linealidad
fotométrica3.
La exactitud de la longitud de onda es el grado de concordancia entre la longitud de onda
que indica el espectrofotómetro y la longitud de onda de referencia requerida. La desviación de la
longitud de onda puede causar errores en los resultados cuantitativos de la lectura de
absorbancias3,4.
El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancia en el
que el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de concentración. Para ello se
determina la respuesta del espectrofotómetro a diferentes concentraciones de una sustancia que
cumpla con la ley de Lambert-Beer.
La exactitud fotométrica se determina comparando la absorbancia de una disolución de
referencia con la medida en el espectrofotómetro a una longitud de onda específica. Para cubrir
satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se utilizan dos disoluciones de referencia
diferentes: dicromato de potasio, para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro visible.
Se denomina precisión fotométrica a la medida de la dispersión de una serie de
mediciones de absorbancia alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de variación
porcentual3.
Los estándares de calidad del espectrofotómetro deben cumplirse para garantizar un
correcto funcionamiento, si algún parámetro estuviera fuera del rango establecido como
aceptable por normativas oficiales, es conveniente realizar la calibración del instrumento a través
de un servicio técnico acreditado y luego volver a verificar su funcionamiento4.
Las micropipetas y espectrofotómetros UV-Visible son instrumentos ampliamente usados
para monitorear procesos enzimáticos y cuantificar los productos resultantes de estos procesos,
como lo es la sacarificación enzimática de almidón.
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Un ejemplo claro es en la preparación de curvas de calibración de almidón y glucosa,

necesarias para cuantificar los productos de la sacarificación enzimática.
Objetivos:
Familiarizarse con el uso correcto de la micropipeta y el espectrofotómetro UV-visible.
Adquirir destreza en la utilización de la micropipeta y el espectrofotómetro UV-visible.

Utilizar ambos equipos para la preparación de curvas de calibración de almidón y glucosa,
necesarias para la práctica de sacarificación enzimática.
Materiales, equipos y reactivos

Espectrofotómetro y cubetas de plástico
Balones aforados
Micropipetas y puntas
Beakers pequeños
Vortex
Balanza analítica
Tubos de ensayo
Baño a 37 ºC
Agua destilada
Disolución de glucosa 500 ppm
Disoluciones de almidón al 2% (20 g/L).
Disolución iodo ioduro
Disolución de HCl 0,1mol/L.
Reactivo de Trinder
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Procedimiento
A. Demostrativo: Uso correcto de la micropipeta
Ver la figura 2 donde se muestra el manejo adecuado de la micropipeta, y observar como

su profesor de laboratorio demuestra el uso correcto y verificación de la micropipeta.
Figura 2. Manejo de la micropipeta
B. Determinación espectrofotométrica de almidón5
1. Preparación de una disolución de iodo-ioduro (ya va a estar preparada)

a. Pesar 2,2 g de KI + 1,1 g de I2 y disolver en 15 mL de agua destilada. Aforar a 100 mL
con agua destilada.
b. Tomar 2 mL de la disolución anterior, 20 g de KI y disolver en 500 mL de agua
destilada.
2. Preparación de una disolución 20 g/L de almidón (ya va a estar preparada)
a. Pesar en balanza analítica 20 g de almidón de papa soluble.
b. Disolver el almidón en aproximadamente 50 mL de agua fría.
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c. Agregar la mezcla anterior en 900 mL de agua hirviendo en un beaker de 1L con

agitación constante.
d. Una vez que el almidón se ha disuelto y gelatinizado, dejar enfriar a temperatura
ambiente y ajustar el volumen a 1000 mL en un balón aforado.
e. Poner algunas gotas de la disolución de almidón en un vidrio de reloj. Agregar 1 gota
de disolución de iodo ioduro. Observar el color azul profundo formado, indicando la
presencia de almidón en la solución.
3. Curva de calibración de almidón
a. A partir de la disolución madre de 20 g/L de almidón preparar patrones de las
siguientes concentraciones: 5,0, 4,0, 3,0, 2,0 1,0, 0,5 g/L en balones aforados de 25,00
mL.
b. Tomar 0,50 mL de cada una de las disoluciones anteriores y agregar a 5 mL de HCl 0,1
mol/L.
c. Adicionar 1mL de la disolución anterior a 5 mL de la disolución iodo ioduro. Agitar en
vortex y observar desarrollo de color.
d. Preparar dos blancos: 0,5 mL agua destilada + 5 mL HCl 0,1M + 5 mL disolución
iodo/ioduro.
e. Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 620 nm. Seguir las indicaciones de uso
dadas por su profesor de laboratorio y/o asistente.
A. Determinación enzimática de glucosa (método de Trinder)5

El reactivo de Trinder es un kit enzimático formado por 4-aminoantipirina (0,25
mmol/L), p-hidroxibenzoato (20 mmol/L) (equivalente al fenol), glucosa oxidasa (40
000 U/L) y peroxidasa (2000 U/L).
La glucosa oxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de la glucosa en ácido D-
glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. A su vez la peroxidasa cataliza la
reacción de oxidación de la 4-aminoantipirina que reacciona con el fenol (o su
equivalente) para dar lugar a una quinonaimina coloreada que absorbe a 500 nm. La
intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de glucosa.
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Figura 2. Principio del método enzimático de Trinder
1. Preparación de la curva de calibración

a. Preparar en un balón aforado de 100 mL una disolución madre de glucosa con una
concentración de 500 ppm. (ya va a estar preparada).
b. Con la disolución anterior preparar patrones de 50, 100, 200, 300 y 400 ppm en balones de
25,00 mL.
c. Agregar 5 mL del reactivo de Trinder a cada tubo a utilizar.
d. Agregar 50 µL del patrón a cada uno de los tubos anteriores con reactivo de Trinder.
e. Agitar con vortex.
f. Preparar dos blancos, agregando 50 µL de agua destilada a sendos tubos con 5 mL del
reactivo de Trinder.
g. Incubar en baño a 37 ºC por 15 minutos.
h. Enfriar a temperatura ambiente.
i. Leer la absorbancia a 500 nm, dentro de los 30 min siguientes al desarrollo del color. Seguir
las indicaciones de uso dadas por su profesor de laboratorio y/o asistente.
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Resultados esperados.
Gráficas de absorbancia en función de la concentración de almidón y/o glucosa.
Ecuaciones de la recta que sigan la Ley de Beer-Lambert y coeficientes de correlación
lineal de ambas gráficas.
Cuestionario.
Comente las ventajas y desventajas del uso de enzimas como generadores de productos
coloreados, usados en la determinación de curvas de calibración de azúcares.
Comente las ventajas y desventajas; y cuidados experimentales, que existen cuando se
utiliza la espectrofotometría como método de cuantificación.
Comente las ventajas y desventajas; y cuidados experimentales, que existen al usar
micropipetas como instrumento de medición de volúmenes.
Referencias bibliográficas.
1. Contreras, J. Práctica: El uso de las micropipetas. Curso biología celular y molecular
médica. Tomado de http://jorge-contreras.webs.com/guia-
El%20uso%20de%20micropipeta-BM.pdf.
2. Cheminet, G.; Zini, C.; Núñez, M. Instructivo para la verificación de pipetas. VI Congreso
virtual iberoamericano de gestión de calidad en laboratorios. Tomado de
http://www.cequimap.com.ar/Iberolab/Verif%20pipetas.pdf.
3. Azcarate, M.; Kloster, N.; Ostinelli, M & Carreira, D. Guía para la verificación de
espectrofotómetros UV-visible utilizados en el análisis de suelo y agua. VI Congreso virtual
iberoamericano de gestión de calidad en laboratorios. Tomado de
http://inta.gob.ar/documentos/guia-para-la-verificacion-de-espectofotometros-uv-
visible-utilizados-en-el-analisis-de-suelo-y-
agua/at_multi_download/file/Guia_espectrofot%C3%B3metros_UV.pdf.
4. Duymovich, C.; Acheme, R.; Sesini, S & Mazzionta, D. (2005). Espectrofotómetros y

fotocolorímetros, guía práctica de actualización. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana.
39 (4): 529-539.
5. Bonilla, A. (2007). Determinación de la concentración de glucosa en la elaboración de
jarabe glucosado. Práctica tomada del Curso NF 6704 Enzimas en la Industria Alimentaria.
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TA-0115 II CICLO 2014

Laboratorio 2: Sacarificación enzimática del almidón y estudio del efecto del pH y la
temperatura sobre la actividadprofesionales
Formando enzimática dedelacalidad
α-amilasa
para la industria
alimentaria
Profesora: M.Sc. Andrea Irías Mata
Introducción
Los almidones son polisacáridos de reserva energética en las plantas (papa, maíz, arroz,
trigo, yuca, banano) y constituyen la base de la dieta y la principal fuente de energía para muchas
de las poblaciones del mundo.
El almidón se encuentra en las células vegetales en forma de gránulos debido a la presencia
de enlaces de hidrógeno tanto internos como entre moléculas vecinas que resisten la penetración
de agua y la acción de las enzimas hidrolíticas y por tanto es insoluble en agua a temperatura
ambiente. Estos enlaces se debilitan al calentar una suspensión acuosa de almidón: los gránulos
comienzan a absorber agua y se hinchan hasta que se romperse. Este proceso se denomina
gelatinización, debido a que la solución formada es de consistencia gelatinosa y viscosa.
Las moléculas de almidón son polímeros de la glucosa unidos entre sí por enlaces
glicosídicos α-1,4 y α-1,6. Para utilizar esta fuente energética, los organismos utilizan sistemas
enzimáticos dentro de los que se encuentran las α-amilasas y las amiloglucosidasas.
Las α-amilasas hidrolizan los enlaces internos α-1,4 de las cadenas de amilosa y
amilopectina del almidón de forma más rápida que los enlaces presentes en las partes terminales
de la molécula. Por ello, la hidrólisis enzimática del almidón produce una mezcla de productos
formados en su mayoría por moléculas de tamaño intermedio (dextrinas) y un menor número de
moléculas sencillas como la glucosa y la maltosa.
Figura 1. Componentes del almidón y sus enzimas

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Las amiloglucosidasas por su parte hidrolizan los enlaces glicosídicos, tanto los α-1,4
como los α-1,6, comenzando por el extremo no reductor de las moléculas de los carbohidratos
dando lugar a la formación de moléculas de glucosa.
Objetivos:
 Realizar y evaluar el proceso de sacarificación enzimática del almidón
 Determinar el contenido de glucosa mediante un procedimiento enzimático
 Evaluar el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática de la α-amilasa
Materiales y equipo
 Baños con temperatura controlada a 25, 37, 40, 50, 60, 70 y 85 ºC
 Balanza analítica
 Espectrofotómetro
 Vortex
 Almidón pregelatinizado
 Amilasa fúngica en polvo, Aspergillus oryzae (Validase FAA40, Valley Research, Inc)
 Disolución de amiloglucosidasa, Rhizopus sp, (A-7255, Sigma) o Aspergillus niger (A9913)
 Disoluciones de almidón al 1% (10 g/L)
 Disolución iodo ioduro
 Disoluciones HCl 0,1mol/L, CaCl2 2,5 mmol/L y NaCl 10 mmol/L
 Disoluciones amortiguadoras de fosfatos 0,1 mol/L de pH= 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 y 8,0
 Reactivo de Trinder
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Parte experimental
A. Sacarificación de una disolución de almidón: Tratamiento enzimático secuencial para

la obtención de jarabe glucosado.
Se realizará un tratamiento enzimático secuencial para la obtención de un jarabe
glucosado. Inicialmente se utiliza una α-amilasa de origen fúngico (Aspergillus oryzae) para
dextrinizar las moléculas de almidón y en una segunda etapa se utiliza una amiloglucosidasa
para la producción de moléculas de glucosa.
Procedimiento
1. Preparación de disolución de -amilasa (ya está preparada)

a. Disolver 0,0400g de la enzima α-amilasa de Aspergillus oryzae (Validase FAA-40) en
25 mL de cloruro de calcio 2,5 mM, y llevar hasta un volumen final de 50 mL.
2. Preparación de disolución de amiloglucosidasa (ya está preparada)
a. Si es amiloglucosidasa, Rhizopus sp: Disolver 0,2 g de amiloglucosidasa en 10 mL de
NaCl 10 mM.
b. Si es amiloglucosidasa, Aspergillus niger: Disolver 0,5 mL de amiloglucosidasa en 10
mL de NaCl 10 mM.
3. Preparación de disolución de almidón al 1% (10 g/L) (Ya está preparada)
a. Mezclar 1g del almidón asignado en aproximadamente 5 mL de agua fría.
b. Hervir 90 mL de agua en un beaker de 250 mL
c. Con agitación constante agregar la suspensión de almidón sobre el agua hirviendo.
d. Una vez que el almidón se ha gelatinizado y disuelto, dejar enfriar y ajustar su
volumen con agua a 100 mL.
4. Determinación de la concentración inicial de almidón

a. Hacer una dilución 1:5 de la disolución de almidón preparada, (disolviendo 1 mL de
la disolución de almidón en 5 mL de agua).
b. Tomar 0,5 mL de la disolución del punto anterior y agregar a 5 mL de HCl 0,1M.
c. Agregar 1 mL de esta mezcla (HCl) a 5 mL de disolución de yodo-yoduro. Agitar en
Vortex y observar desarrollo de color.
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d. Preparar dos blancos: 0,5 mL agua destilada + 5 mL HCl 0,1M + 5 mL disolución

iodo/ioduro.
e. Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 620 nm.
5. Determinación de glucosa inicial (método de Trinder)

a. Agregar 5 mL del reactivo de Trinder a tres tubos de ensayo.
b. Agregar 50 L de la muestra de almidón al 1% al primer tubo de ensayo con
reactivo de Trinder.
c. Preparar 2 blancos de calibración, agregando 50 L de agua destilada a cada uno de
los tubos de ensayo restantes con reactivo de Trinder.
d. Agitar brevemente cada tubo con agitador Vortex.
e. Colocarlos en un baño de agua a 37ºC por 15 minutos.
f. Sacarlos del baño y agitarlos brevemente con Vortex.
g. Leer la absorbancia a 500 nm dentro de los 30 minutos siguientes al desarrollo de
color.
6. Tratamiento enzimático
a. Preparar 2 muestras (M1 y M2) de 25 mL de la disolución de almidón al 1% en
tubos de ensayo grandes y agregar 0,5 mL de disolución de α-amilasa a cada uno.
b. Incubar a 50°C por 10 min.
Muestra 1
a. Ajustar el volumen a 50 mL con agua destilada en un balón aforado.
b. Determinar la concentración de almidón espectrofotométricamente en la
disolución de la muestra y en una disolución de la muestra con dilución 1:5 (1 mL
en 5 mL de agua destilada).
NOTAS:
 Al hacer la medición en la muestra sin diluir, si el valor esta dentro de la curva de
calibración del almidón no es necesario medir la dilución.
 Para medir la concentración de almidón seguir el procedimiento utilizado para
medir la concentración inicial de almidón, a partir del punto 2.
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c. Determinar la concentración de glucosa de la disolución de la muestra por el

método enzimático de Trinder, siguiendo los pasos indicados en la medición de la
glucosa inicial.
Muestra 2
I. Si es amiloglucosidasa, Rhizopus sp:
a. Ajustar el pH a 4,7 con HCl 0,02mol/L.
b. Agregar 0,5mL de la disolución de amiloglucosidasa
c. Incubar por 30 min a 50 °C.
d. Pasado el tiempo de incubación, retirar la muestra del baño. Si la disolución está
turbia, filtrarla.
e. Aforar con agua destilada a 50 mL en un balón aforado
f. Determinar la concentración de almidón de la disolución de la muestra
espectrofotométricamente, siguiendo el procedimiento utilizado para medir la
concentración inicial de almidón, a partir del punto 2.
g. Hacer dos diluciones de 1:10 (1 mL en 10 mL de agua) y de 1:20 (1 mL en 20 mL de
agua) a partir de la disolución de la muestra, y determinar el contenido de glucosa
por el método enzimático de Trinder.
NOTAS:
 Al hacer la medición en la muestra con dilución 1:10, si el valor esta dentro de la
curva de calibración de glucosa no es necesario medir la dilución 1:20.
 Para medir la concentración de glucosa seguir los pasos indicados en la medición
de la glucosa inicial.
II. Si es amiloglucosidasa, Aspergillus niger:

a. Ajustar el pH a 4,5 con HCl 0,02mol/L.
b. Agregar 0,5mL de la disolución de amiloglucosidasa
c. Incubar por 30 min a 60 °C.
d. Pasado el tiempo de incubación, retirar la muestra del baño. Si la disolución está
turbia, filtrarla.
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e. Aforar con agua destilada a 50 mL en un balón aforado

f. Determinar la concentración de almidón de la disolución de la muestra
espectrofotométricamente, siguiendo el procedimiento utilizado para medir la
concentración inicial de almidón, a partir del punto 2.
g. Hacer dos diluciones de 1:10 (1 mL en 10 mL de agua) y de 1:20 (1 mL en 20 mL de
agua) a partir de la disolución de la muestra, y determinar el contenido de glucosa
por el método enzimático de Trinder.
NOTAS:
 Al hacer la medición en la muestra con dilución 1:10, si el valor esta dentro de la
curva de calibración de glucosa no es necesario medir la dilución 1:20.
 Para medir la concentración de glucosa seguir los pasos indicados en la medición
de la glucosa inicial.
B. Efecto del pH en la actividad enzimática

a) Tomar 5 tubos de ensayo y agregar en cada uno 5,0 mL de la disolución de almidón al 1%
b) Adicionar 5,0 mL de cada una de las disoluciones amortiguadoras a los tubos de ensayo
con almidón (cada tubo debe quedar con una disolución de pH diferente). Se obtienen
disoluciones de almidón amortiguadas de 5 g/L.
c) Agregar 0,5 mL de la disolución de amilasa al tubo de pH=4,0, agitar con el Vortex e
hidrolizar por 10 minutos exactos a la temperatura óptima (50 ºC).
d) Finalizado el tiempo de hidrólisis, sacar el tubo del baño. Se obtiene la disolución de
almidón hidrolizado.
e) Agregar 0,5 mL de la disolución de almidón hidrolizado sobre 5,00 mL de disolución
inhibidora de HCl 0,1 mol/L contenida en otro tubo de ensayo.
f) Agregar 0,5 mL de la disolución anterior a 5,00 mL de disolución iodo/ioduro, contenida
dentro de otro tubo de ensayo, para desarrollar color. La disolución se tornará azul si hay
presente almidón no hidrolizado, café rojizo se está parcialmente degradado e incoloro si
la degradación es completa.
g) Medir la absorbancia a 620 nm. Recuerde que debe restar esta absorbancia a la medición
de un blanco. Preparar dos blancos como los utilizados en la determinación inicial de
almidón.
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h) Seguir el mismo procedimiento para los demás tubos a los diferentes valores de pH.
Puede ir trabajando secuencialmente, si se familiariza con el procedimiento. Deje un
tiempo prudencial que le permita la manipulación y preparación.
C. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

a) Utilizar 5 baños a temperaturas de 25, 40, 50, 70 y 85 ºC.
b) Tomar 5 tubos de ensayo y agregar en cada uno 5,0 mL de disolución amortiguadora de
pH 6.
c) Adicionar 5,0 mL de la disolución de almidón al 1% a los tubos de ensayo con la
disolución amortiguadora. Se obtienen disoluciones de almidón amortiguadas de 5 g/L.
d) Colocar los tubos en los diferentes baños y dejar que alcancen equilibrio con la
temperatura del baño.
e) Agregar en el tubo ubicado en el baño a 25 ºC, 0,5 mL de la disolución de amilasa, agitar
con Vortex e hidrolizar por 10 minutos exactos.
f) Finalizado el tiempo de hidrólisis, sacar el tubo del baño. Se obtiene la disolución de
almidón hidrolizado.
i) Agregar 0,5 mL de la disolución de almidón hidrolizado sobre 5,00 mL de disolución
inhibidora de HCl 0,1 mol/L contenida en otro tubo de ensayo.
g) Agregar 0,5 mL de la disolución anterior a 5,00 mL de disolución iodo/ioduro, contenida
dentro de otro tubo de ensayo, para desarrollar color. La disolución se tornará azul si hay
presente almidón no hidrolizado, café rojizo se está parcialmente degradado e incoloro si
la degradación es completa.
h) Medir la absorbancia a 620 nm. Recuerde que debe restar este valor a la medición de un
blanco. Preparar dos blancos como los utilizados en la determinación inicial de almidón.
i) Seguir el mismo procedimiento a las diferentes temperaturas. Puede ir trabajando
secuencialmente, si se familiariza con el procedimiento. Deje un tiempo prudencial que le
permita la manipulación y preparación.
Resultados esperados.
a. Concentración de almidón y glucosa inicial y después de cada tratamiento enzimático.
b. Porcentaje de glucosa producido después de cada tratamiento enzimático a partir del
equivalente inicial de glucosa (calculado a partir almidón inicial).
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c. Porcentaje de almidón hidrolizado después de cada tratamiento enzimático.

d. Curva de % de hidrólisis de almidón en función de la temperatura
e. Curva de % de hidrólisis de almidón en función del pH
Cuestionario
a. Compare el porcentaje (m/m) de Validase FAA 40 agregado en el laboratorio por
masa del almidón, con las recomendaciones dadas por el fabricante.
b. Compare la cantidad de almidón presente que se dextrinizó con la cantidad que
teóricamente se podía hidrolizar de acuerdo con la actividad (SKBU) de la enzima.
c. Compare los valores de temperatura y pH óptimos obtenidos con los indicados por la
hoja técnica.
Bibliografía
 Bonilla, A. (2007) Determinación de la concentración de glucosa en la elaboración de

jarabe glucosado. Laboratorio del curso de posgrado de enzimas en los alimentos.
Universidad de Costa Rica, San José.
 Bonilla, A. (2009) Hidrólisis de almidón utilizando varias fuentes de alfa amilasa.

Laboratorio del curso de posgrado de enzimas en los alimentos. Universidad de Costa
Rica, San José.
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TA-0115
Formando
Laboratorio: Licuación profesionales
enzimática de pulpa dedebanano
calidado plátano
para la industria
alimentaria
Profesor: Ing. Eduardo Thompson Vicente
Introducción
La pulpa del banano maduro posee un contenido de agua entre un 72-74% y de sólidos solubles
entre 22-23 ºBrix, en tanto que la pulpa de plátano tiene un 65% de agua y 28-30 ºBrix de sustancias
solubles. Además, se encuentran presentes una cantidad importante de polisacáridos (pectinas,
celulosas, almidón y otros) que dificultan la obtención de un jugo de interés comercial. El contenido
de fibra dietética del banano es aproximadamente de 2% en tanto que para el plátano puede variar
entre 2.0-3.4% (Aurore et al, 2009). La cantidad de pectina en una pulpa del banano o de plátano
varía entre 0,7-1.2 %.
El proceso de licuación se utiliza en pulpas que no proporcionan jugo por prensado como es el
caso de estas musáceas. Se denomina licuación al proceso enzimático donde la pulpa es
prácticamente desintegrada de forma que no hay necesidad de una operación de prensado para la
extracción del jugo. Industrialmente se recurre al uso de enzimas pectinolíticas para aumentar el
rendimiento del jugo, reducir su viscosidad y clarificarlo además del uso de celulasas para mejorar los
rendimientos y de amilasas para hidrolizar el almidón y obtener una buena clarificación.
El tratamiento enzimático de la pulpa provoca la degradación de las pectinas y otros
polisacáridos presentes en las paredes celulares con liberación de los fluidos contenidos. Esta
degradación provoca la solubilización de los componentes de los polisacáridos en el medio acuoso y
un aumento en la cantidad de sólidos solubles. Como resultado se genera también una disminución
de la viscosidad y de los sólidos insolubles suspendidos (% SIS) de la pulpa. El valor % SIS
corresponde al peso húmedo de los coloides centrifugables, que representan esencialmente los
fragmentos de las paredes celulares del banano (Gazania, 2003). Los preparados comerciales son
mezcla de pectinasas y otros tipos de carbohidrolasas, cuya acción sinérgica provoca una importante
reducción de la viscosidad de la pulpa tratada la cual se torna fluida.
En la presente práctica se realizará la licuación enzimática de una pulpa de banano maduro. Se
evaluarán los cambios producidos en las propiedades de la pulpa tratada y la influencia que tiene la
temperatura de proceso y la concentración enzimática que se utilice.
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Objetivos
Realizar un proceso de licuación enzimática de pulpa de banano y/o plátano
Evaluar los cambios producidos en la pulpa por el tratamiento enzimático
Evaluar las mejoras en los procesos de prensado y centrifugación del jugo de banano tratado
enzimáticamente
Analizar el efecto de la temperatura y la concentración enzimática en las propiedades de la
pulpa licuada.
Material y equipo
Bananos/plátanos maduros (grado de madurez 6-7)
Crystalzyme® PMLX, Valley Research.
Baños con temperatura controlada a 35 y 50 ºC
Cronómetros
Molino Hobart
Refractómetro y Centrífuga
Prensa Carver
Micropipetas de 100-1000 μL
Disolución Crystalzyme PMLX

Disolver 1 mL de enzima en agua destilada en un balón aforado de 10 mL.
Procedimiento
Para todo el grupo se tomará una muestra de 700 g para realizar el prensado de la pulpa inicial
Tratamiento enzimático
Obtener aproximadamente 800 g de pulpa molida utilizando una licuadora o un procesador de
alimentos.
Medir el pH de la pulpa.
Tomar muestra para la determinación del % SIS y del contenido de sólidos solubles.
Determinar la consistencia del producto inicial a 25 °C.
Pesar 700 g de pulpa en un recipiente o beaker.
Consultar el cuadro 1 para la distribución de temperaturas y concentraciones a utilizar por
cada grupo de trabajo.
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Precalentar de forma cuidadosa la pulpa en un baño de agua a la temperatura de proceso T

(puede ayudarse con el uso del en microondas). La pulpa de banano es muy viscosa y por tanto
la transmisión de calor es deficiente. Por tanto se debe mezclar muy bien con la ayuda de una
cuchara para homogeneizar la temperatura.
Poner la pulpa en un baño a la temperatura T.
Agregar el preparado enzimático a una concentración A µL/kg de pulpa. Distribuirlo bien con
la ayuda de una cuchara y dejarlo actuar por 45 minutos con agitación periódica.
Observar los cambios que se produzcan en la pulpa.
Finalizado el periodo de licuación, enfriar a temperatura ambiente
Determinar la consistencia, el % de SIS y el contenido de sólidos solubles finales
Por último, tomar una muestra de 600 g y prensar en el texturómetro, 1800 ton, por un
tiempo de 3 minutos.
Cuadro 1. Condiciones de tratamiento enzimático por grupo
Concentración enzima Temperatura
Grupo
(µL/kg) (ºC)
1 100 35
2 100 50
3 200 35
4 200 50
Análisis de resultados
% Rµ: reducción de consistencia:
Variación del %SIS, ºBrix y %Rµ y el rendimiento en función de los diferentes tratamientos
aplicados
Efecto de la temperatura de tratamiento enzimático en las variables respuesta
Efecto de la concentración enzimática utilizada en las variables respuesta
Comparar la cantidad de preparado enzimático utilizado con los niveles recomendados por el
fabricante en la hoja técnica.
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Contenido de sólidos insolubles suspendidos (%SIS) y de sólidos solubles (ºBrix)

Realizar la determinación por duplicado
Se tubos de centrífuga de 60 mL (P1)
Se agrega pulpa de banano para ajustar el peso a 40,00 g (P2)
Se centrifuga por 5 minutos a una velocidad de 3000 g
Se decanta el líquido supernatante al que se le miden los ºBrix en el refractómetro.
Se pesa el tubo con el sólido residual centrifugado (P3)
El valor del %SIS corresponde a:
Prensado de la pulpa
El prensado de la pulpa se efectúa en la prensa hidráulica Carver
Se pesa la manta filtrante húmeda, y se coloca en el recipiente con orificios.
Se pesan dentro de la bolsa de manta 600-700 g de pulpa.
Se va subiendo de forma lenta el pistón de la prensa para permitir la salida lenta del jugo de
prensado y evitar que la bolsa de manta se rompa. Aplicar al final una carga de prensado
entre 1600 y 1800 lb por 3 minutos
Luego de prensado, se pesa la torta prensada+ manta filtrante
El rendimiento de jugo se calcula como:
Rendimiento = Peso de puré inicial- Peso puré prensado x 100
Peso puré inicial
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Bibliografía
AURORE, G, PARFAIT, B & FAHRASMANE, L. 2009. Bananas, raw materials for making processed food
products. Trends in Food Science & Technology, 20 (2): 78-91.
FORSYTH, G. C. 1980. Banana and Plantain. In Nagy, S. & Shaw, P. E., eds. Tropical and subtropical
fruits: composition, properties and uses. AVI, Connecticut. p. 258-278.
GAZANIA, F. 2003. Etude de l’immobilisation sur support chitosane pour la liquéfaction du jus de
banane. Thèse de Master of Science en génie agroalimentarie méditerranéen et tropical. ENSIA-
SIARC. Montpellier.
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Procesos Biotecnológicos
Efecto del tiempo y temperatura de exposición sobre la inactivación de la

peroxidasa en diferentes materiales vegetales.
P. Esquivel
Introducción
La peroxidasa (POD) (donor: hydrogen peroxide oxidoreductase, EC 1.11.1.7) cataliza

reacciones de oxidación utilizando peróxidos u oxígeno como receptores de hidrógeno.
El mecanismo de la peroxidasa se basa en la formación de un complejo enzima-
donador de hidrógeno (Hemeda & Klein, 1991). Los donadores de hidrógeno pueden
ser fenoles, aminas u otros compuestos orgánicos y los productos que se forman
durante la oxidación dependen del tipo de donador de hidrógeno.
La cinética de la POD se ve afectada por la concentración de donadores, pero se ve

afectada levemente por cambios en la concentración de peróxido de hidrógeno
(Bergmeyer, 1974). POD se caracteriza por ser la enzima más termoestable en
alimentos, por lo que se utiliza ampliamente como índice de escaldado. (Güneş &
Bayındırlı, 1993; Ling & Lund, 1978; Morales-Blancas, Chandia, & Cisneros-Zevallos,
2002; Naveh, Mizrahi, & Kopelman, 1982).
El objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de la temperatura y tiempo de

escaldado sobre la inactivación de la POD en diferentes materiales vegetales.
Materiales y métodos
Materiales
Licuadora, beakers, agitadores de vidrio, gasa, embudos de espiga, centrifuga, tubos

cónicos para centrifuga, termómetro, micropipeta, tubos de ensayo, espectrofotómetro
UV-visible (marca Jasco), celdas. Como reactivos se usará buffer de fostato de
potasio, guayacol y peróxido de hidrógeno. Diferentes materiales vegetales tales como
brócoli, papa, y zanahoria.
Preparación del extracto
El material vegetal se lava y se trocea en pedazos pequeños, luego se licúa con agua
a 4ºC en una licuadora 74% (w/v). El licuado se filtra utilizando una tela y luego se
centrifuga durante 15 minutos a 12000 rpm (Hemeda & Klein, 1990).
Determinación de actividad de la POD
La determinación de la actividad enzimática se realiza en un buffer de fosfato de

potasio a un pH de 6.0 y a temperatura ambiente. Para determinar la actividad se
utilizará el espectrofotómetro marca Jasco. La actividad de la POD se determinará
como el cambio de absorbancia a 470 nm. La mezcla de la reacción debe contener
2.15 mL de buffer 0.01 M KP (pH 6.0) con 1.0% (v/v) guaiacol; 0.25 mL de 0.1% (v/v)
H2O2 y 0.1 mL del extracto enzimático (Flurkey & Jen, 1978).
24
Tratamiento térmico
El tratamiento térmico se realizará variando temperatura de exposición entre 40–90 °C

con tiempos variables entre 1 to 60 min. Tubos de ensayo con el extracto crudo (2 mL)
se calientan en baños de agua a temperaturas definidas y se toman alícuotas a
diferentes intervalos de tiempo.
Referencias
Bergmeyer, H.U. Methods of enzymatic analysis (2nd ed.), Academic Press, Newyork
(1974) pp. 685–690.
Flurkey, W.H. and J.J. Jen, Peroxidase and polyphenoloxidase activities in developing
peaches, Journal of Food Science 43 (1978), pp. 1826–1828 1831.
Güne, B.S. and A. Bayındırlı, Peroxidase and lipoxygenase inactivation during

blanching of green beans, green peas and carrots, Lebensmittel-Wissenschaft und-
Technologie 26 (1993), pp. 406–410.
Hemeda, H.M. and B.P. Klein, Effects of naturally occurring antioxidants on peroxidase
activity of vegetable extracts, Journal of Food Science 55 (1990), pp. 184–187.
Hemeda, H.M. and B.P. Klein, Inactivation and regeneration of peroxidase activity in
vegetable extracts treated with antioxidants, Journal of Food Science 56 (1991), pp.
68–71.
Ling, A.C. and D.B. Lund, Determining kinetic parameters for thermal inactivation of
heat-resistant and heat-labile isozymes from thermal destruction curves, Journal of
Food Science 43 (1978), pp. 1307–1310.
Morales-Blancas, E.F., V.E. Chandia and L. Cisneros-Zevallos, Thermal inactivation

kinetics of peroxidase and lipoxygenase frım broccoli, green asparagus and carrots,
Journal of Food Science 67 (2002), pp. 146–154.
Naveh, D., S. Mizrahi and I.J. Kopelman, Kinetics of peroxidase deactivation in

blanching of corn on the cob, Journal of Agricultural and Food Chemistry 30 (1982), pp.
967–970.
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TA-0115
Práctica Preparación yFormando profesionales

manejo de cultivos de calidad para la industria
de referencia
alimentaria
Profesora: M. Sc. Carmela Velázquez Carrillo
Las cepas de los microorganismos utilizados en procesos industriales deben mantenerse en condiciones que
garanticen la viabilidad de las mismas y que eviten la pérdida de sus características. Para este propósito se han
diseñado una serie de técnicas de laboratorio para la preparación y manejo de cultivos de referencia. El
seguimiento estricto de las instrucciones de manipulación y mantenimiento de estos procedimientos son de
vital importancia debido a que ello afecta profundamente el rendimiento y la naturaleza del proceso y del
producto final.
Objetivo
Llevar a cabo procedimientos básicos de laboratorio para la preparación y mantenimiento de cepas de

referencia.
Materiales
- Incubadora a 35°C
- pHmetro
- Baño a 35°C
- Baño a 41°C
- 5 tubos con 9 mL de APE
- 15 pipetas de 5 mL
- 10 placas de petri estériles
- 1 Botella con 300 mL de Agar Estándar
- 10 portaobjetos
- Kit de tinción de gran
- 1 frasco con 200 mL de BB-12-PROBIO-TEC crecido en MRS o 200 mL de Cultivo láctico para
fermentación crecido en agua destilada con 1% de azúcar.
- 15 Tubos estériles con rosca
- 5 Pipetas de 10ml
- 5 Pipetas de 1ml
- 1 cultivo lácteo congelado de Cultivo láctico y uno liofilizado deBB-12-PROBIO-TEC
- 10 mL de buffer de fosfatos 0,1 M y pH 7,0
- 5 tubos con 10 mL de caldo MRS o agua destilada con 1% de azúcar
- Botella con 100 mL de NaOH al 1N
- Fenolftaleína para valorar
- 1 bureta
- Soporte para bureta
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Procedimiento
1 Estudio de la pureza del cultivo suministrado

a. Realice 5 diluciones seriadas a partir de la suspensión suministrada, utilizando agua peptonada estéril como
diluente.
b. Usando una pipeta estéril de 5 mL deposite 1 mL de cada dilución en cada una de 2 placas de petri estériles
identificadas.
c. Adicione de 12-15 mL de AST (mantenido a 44-46ºC) en una placa
d. Mezcle inmediatamente la dilución de la muestra con el agar. Espere a que el agar solidifique.
e. Invierta las placas con el agar solidificado e incube por 48 ± 2h a 35 ± 1ºC.
f. Pasado el período de incubación seleccione la dilución en la que haya obtenido una mayor separación de
colonias. Seleccione de cada morfotipo observado tres colonias similares y realice una tinción de Gram y una
prueba de catalasa como se describe en el siguiente apartado.
g. Comente las diferencias obtenidas en estas pruebas y la importancia del medio de cultivo seleccionado.
Tinción diferencial de Gram
a. Prepare un frotis delgado, translúcido y homogéneo de la muestra a estudiar. Deje secar al aire. Fije al calor de
la llama.
b. Cúbralo con cristal violeta por un minuto.
c. Lave con agua del tubo por un par de segundos y escurra. Cubra con lugol por un minuto. Lave con agua del tubo
y escurra.
d. Decolore con alcohol etílico de 95 º hasta que no aparezca color en el lavado. Escurra y seque la lámina. Aplique
safranina por 10 segundos. Lave con agua del tubo, escurra y deje secar la preparación.
e. Observe con el objetivo de inmersión. Anote, comente y relacione los resultados con la pureza del cultivo
examinado.
1.2 Elaboración de una curva de pH.

a. Dispensar el cultivo preparado, midiendo 15 ml con pipeta estéril en 12 tubos de ensayo estériles (para tener
muestras por duplicado), con cuidado de no agitar muy fuerte.
b. Incubar los tubos y el Erlenmeyer con el cultivo restante a la temperatura y durante el tiempo requerido por el
microorganismo suministrado.
c. Hacer mediciones de pH a los siguientes tiempos: 0, 30, 60, 90 y 120 minutos.
d. Con los datos obtenidos hacer una gráfica de valores de pH vs. tiempo de incubación.
e. Utilizar los datos obtenidos por el otro grupo que trabajó con el mismo cultivo de microorganismos y otro medio
de cultivo.
f. Discutir los resultados obtenidos.
1.3 Determinación de la actividad acidificante del cultivo lácteo.
a. Descongelar el cultivo suministrado introduciéndolo en un recipiente con agua a 37 C.

b. Agitar para mezclar su contenido.
c. Preparar 10 mL de una dilución 1:1 del cultivo con un buffer de fosfatos 0,1 M y pH 7,0.
d. Agregar 0,3 ml de la dilución a 2 tubos de ensayo estériles conteniendo 10 mL del medio de cultivo indicado.
e. Incubar los tubos a la temperatura indicada por 1,5 horas.
f. Titular con Na0H, 1N usando 3 gotas de fenoftaleína como indicador.
g. Expresar los resultados como mL de NaOH requeridos para neutralizar el ácido formado.
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h. Repetir el procedimiento con un blanco.

i. El resultado final consiste en la diferencia entre los mL gastados en la titulación de la muestra analizada
y los gastados en el blanco.
De acuerdo con esta prueba los iniciadores capaces de producir cambios de 0,35 mL o mayores se consideran
activos. Un cambio de 0,30 a 0,35 mL se considera como baja producción de ácido, cambios menores de 0,3
mL se consideran como de muy baja producción de ácido.
Discutir los resultados obtenidos en esta prueba, relacionándolos con el método de conservación aplicado al
cultivo de microorganismos.
Cultivos utilizados:
NOMBRE DEL MICROORGANISMOS MEDIO DE TEMPERATURA DE

CULTIVO CULTIVO INCUBACIÓN
BB-12 Bifidobacterium lactis Caldo MRS
37 C
Lactobacillus casei
Cultivo proyecto Caldo MRS
(rhamnosus)
fermentación láctica 37°C
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TA-0115
Práctica ElaboraciónFormando profesionales

de sauerkraut de calidad
(fermentación lácticapara la industria
de repollo)
alimentaria
Objetivo:
Conocer el proceso de elaboración de repollo fermentado para ilustrar un proceso de fermentación

láctica de vegetales.
Procedimiento:
1. Prepare una curva de calibración de sal contra °Brix haciendo soluciones de 1, 3, 5, 7 y 9% de

sal y determinando los grados Brix en un refractómetro.
2. Determine la recta de mejor ajuste (y = mx + b) donde: x es el valor medido en el
refractómetro, m = pendiente de la curva, b es el punto de intersección de la curva con el eje
x, y = al % de sal.
3. Lave los repollos que se le suministran para eliminar hojas deterioradas y contaminación
superficial. Utilice únicamente agua, no use desinfectantes.
4. Trocee en 4 partes cada uno de los repollos
5. Rebane en Hobart con aditamento de rallado con trozos de aproximadamente 8 mm de ancho.
Ajuste el equipo para lograr esta apertura en la cuchilla.
6. Pese el repollo rallado obtenido
7. Pese la sal para lograr un 2,25% del peso del repollo
8. Coloque el producto rallado en un balde blanco de 20 kg de capacidad y mezcle con la sal
pesada
9. Coloque un sello de agua con una bolsa plástica lavada y revisando que no esté rota. Llene la
bolsa con agua para asegurar que cubra toda la superficie del repollo. Cierre la bolsa con un
nudo fuerte.
10. Fermente a temperatura ambiente durante 8 días. Mida los grado brix de tal manera que los
pueda convertir en % de sal aplicando la curva de calibración desarrollada. Determine el % de
sal en al salmuera que exhuda el repollo.
11. Saque el producto del balde y póngalo tapado en la cámara de refrigeración a 5°C
12. El siguiente día de práctica empaque en bolsas de HDPE
13. Coloque en refrigeración el producto.
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Control durante fermentación:

Balde 1 Balde 2
Peso de repollo iniciales
Peso de repollos rebanados
Peso de repollo después de
fermentación
ºBrix pH
Líquido de fermentación a 1 día (L)
Líquido de fermentación a 3 días (M)
Líquido de fermentación a 5 días (V)
Líquido de fermentación a 8 días (L)
Apariencia general y sabor a 8 días
Listado de materiales para cada sesión de laboratorio
Sal 4 kg
repollos grandes 20 unidades
Paquete de bolsas de basura medianas 1 paquete de 10 bolsas
Bolsas de HDPE 24 bolsas
Cebollas pequeñas escogidas 8 kg
Chile dulce 1 kg
Vinagres al 4% 2 litros
Azúcar 4 kg
Pimienta en grano 100 g
Cayena o chile picante en semilla 100 g
Orégano en hoja 100 g
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Práctica Elaboración de cebollas fermentadas

Objetivo:
Conocer el proceso de elaboración de fermentación de vegetales aplicando la técnica de inmersión en

salmuera.
Procedimiento:
1. Prepare una curva de calibración de sal contra °Brix haciendo soluciones de 0, 1, 3, 5, 7 y 9%

de sal y determinando los grados Brix en un refractómetro.
2. Lave las cebollas con suficiente agua. No aplique desinfectantes
3. Coloque las cebollas en baldes para fermentación
4. Prepare una salmuera al 3% de sal utilizando la curva de calibración desarrollada en el punto 1.
5. Adicione la salmuera a las cebollas en una relación 1: 2,5 (producto:líquido)
6. Lave una bolsa con suficiente agua y revise que no tenga huecos.
7. Coloque la bolsa sobre el producto y llene agua tratando de ejercer presión sobre los vegetales
para que se mantengan en inmersión dentro del líquido.
8. Fermente a temperatura ambiente durante 21 días y 2 periodos de incremento de sal de
acuerdo al Punto B de este procedimiento (aproximadamente a los 4 y a los 11 días). Cada
incremento de 1% ajustándolo diariamente para mantener el porcentaje de sal deseado.
9. A los 19 días drene la salmuera y póngale agua fresca a cada balde y deje durante 48 horas en
refrigeración (T de 5°C)
10. Coloque el producto en los frasco de vidrio o bolsas plásticas
11. Adicione la salmuera que se indica en la siguiente fórmula
12. Escalde el producto en los frascos durante 2 minutos hasta alcanzar 75°C
13. Aplique el sellado del producto
14. Aplique un tratamiento térmico adicional de 5 min en agua a 90°C
15. Aplique un enfriamiento gradual
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A) Preparar curva de calibración ºBrix vs. % sal
% sal ºBrix
1
3
5
7
9
Calcular recta de mejor ajuste y definir ecuación: % sal = m (ºBrix) + b
B) Seguimiento a la fermentación y ajuste de concentración de sal
GRUPO MIERCOLES:
Fecha y días % ºBrix % sal pH gramos sal ºBrix % sal

de sal antes de antes de adicionada después después
fermentación teórica ajuste ajuste de ajuste de ajuste
Miércoles (0) 3%
Viernes (2) 3%
Lunes (4) 4%
Miércoles (7) 4%
Viernes (9) 4%
Lunes(11) 5%
Miércoles (14) 5%
Viernes (16) 5%
Lunes (19) Desalar
Miércoles (21) Procesar
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GRUPO VIERNES:
Fecha y días % ºBrix % sal pH gramos sal ºBrix % sal

de sal antes de antes de adicionada después después
fermentación teórica ajuste ajuste de ajuste de ajuste
Viernes (0) 3%
Lunes (3) 3%
Miércoles (5) 4%
Viernes (7) 4%
Lunes(10) 4%
Miércoles (12) 5%
Viernes (14) 5%
Lunes (17) 5%
Miércoles (19) Desalar
Viernes (21) Procesar
Si salmuera debe estar a 4% y la medición me indica que está a 3%. La fórmula a aplicar sería:
X =V1 (C2 – C1) / (1 – C2)
Donde:
X = cantidad de sal (g)
V1 = Volumen de salmuera inicial (g)
C 1 = Concentración de V1 (g/g) Ejemplo: si el porcentaje es de 4% = 0.04 g/g
C2 = Concentración de V2 (g/g)
C) Graficar pH contra tiempo

D) Análisis sensorial de producto final
Formulación de salmuera:
• Vinagre (4%) 15%

• Azúcar 5%
• Pimienta/tomillo 0.15%
• Sal 2%
• Cayena o chile serrano 0.2%
• Orégano 0.05%
• Agua 77.5%
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Práctica Fermentación alcohólica

Objetivo:
Conocer el proceso de elaboración de vinos a través de la evaluación de la fermentación alcohólica
Procedimiento:
Los estudiantes del día miécoles harán un vino de mora y fresa y los del viernes de frutas tropicales
(piña y papaya. Cada grupo seguirá el procedimiento que a continuación se detalla:
1. Preparación del mosto

Preparar una pulpa de cada una de las frutas utilizando la malla 0.033 para cada caso. Cada
grupo deberá hacer una mezcla de frutas: grupo del miércoles con Mora 40% y Fresa 60% y
para el grupo del viernes Piña 50% y Papaya 50%
Colocar la pulpa producida en un balde de 20 litros para completar una formulación que
contenga 5 litros de la mezcla de pulpas y 5 litros de agua.
Medir a esa misma muestra el contenido de sólidos solubles expresado como Brix, haciendo
uso de un refractómetro manual, antes de hacer esta medición corroborar la calibración del
equipo en cero con una muestra de agua destilada
Ajustar el contenido de azúcar adicionando azúcar en polvo hasta alcanzar 21 – 22°Brix.
Tomar una muestra del jugo de aproximadamente 25 mL y medir el pH. El pH del jugo a
fermentar debe estar entre 3,00 y 4,00, su fuera necesario ajuste con ácido cítrico hasta
alcanzar este valor.
Calentar el jugo a 50 C para disolver completamente el azúcar en la marmita Groen
Enfriar rápidamente hasta temperatura ambiente (25 C)
Medir de nuevo los sólidos solubles y anotar este valor como los Brix del mosto
Pesar 0,1% p/p de levadura seca activa de panificación (Saccharomyces cereviseae) marca
Fleishman y 10 g de azúcar
Reconstituir con aproximadamente 100 mL de agua a 30 C y 100 mL de la mezcla de pulpas,
en un recipiente pequeño.
Dejar en reposo a 30-35 C por aproximadamente 5 minutos hasta que la levadura dé señales
de actividad (formación de espuma)
Trasvasar la pulpa preparada (mosto) al balde limpio donde se llevará a cabo la fermentación
Agregar la levadura al mosto
Agregar 1,0 g/L de gelatina sin sabor para ayudar a la decantación posterior
Tapar el recipiente y agitar vigorosamente
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Tapar herméticamente el recipiente con un tapón de hule el cual posee tres salidas con
mangueras para colocar un filtro de aire, escape de CO2 la cual se sumerge en agua y una
jeringa de 10 mL para extraer muestras.
Incubar a temperatura ambiente colocando la manguera de salida del balde en un recipiente
con agua para asegurar que no ingrese aire al interior del balde
2. Fermentación
Extraer tres veces por semana aproximadamente 20mL de muestra sin agitar mucho el
recipiente y medir sólidos solubles haciendo uso de un refractómetro manual. La
fermentación finaliza cuando se tengan 10-12 Brix
3. Eliminación de residuos
Quitar el tapón hermético, tapar con papel aluminio y dejar en reposo el vino durante 2 días
en refrigeración (5-7 C) para que sedimenten todos los residuos
Decantar el líquido supernatante
Hacer una filtración utilizando el Filtro Prensa
Empacar el vino resultante en botellas de vidrio lavadas y guardar el vino en refrigeración.
4. Resultados
Con los datos obtenidos hacer una gráfica de valores de Brix vs. tiempo de fermentación y
discutir la evolución del proceso de fermentación, comparar con los resultados obtenidos por
el otro grupo
Determinar la tasa de consumo de sustrato máxima y la total
Incluir en el reporte los cálculos realizados
Observaciones:
Listado de materiales para cada sesión de laboratorio
Azúcar 4 kg
Frutas 5 kg por grupo
Levadura seca 50 g
Gelatina sin sabor 15 g
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TA-0115
Formando
PRÁCTICA ANáLISIS DE CERVEZAprofesionales de calidad para la industria
alimentaria
Profesora: Andrea Irías Mata, M.Sc.
Objetivo general
Realizar análisis significativos para la caracterización fisicoquímica de una cerveza
Objetivos Específicos
Comprobar el efecto de la fermentación en la densidad de la cerveza (efecto sobre densidad e
índice de refracción).
Reafirmar los criterios del uso apropiado de equipos de medición de densidad e índice de
refracción en mezclas complejas.
Calcular el % de alcohol en diferentes cervezas utilizando la densidad y el IR.
Analizar las propiedades de color y amargo en los diferentes tipos de cerveza.
Realizar un prueba sensorial de las cervezas analizadas.
1. Análisis de muestras
Los métodos oficiales para análisis de cervezas son los de la ASBC (American Society of Brewing
Chemist).
1.1 Determinación de extracto original y aparente (°Plato)
°Plato es una medida empleada en la industria cervecera para definir la cantidad de azúcares
fermentables presentes en el mosto o en la cerveza. La medición se hace generalmente a través de
densímetros graduados para obtener directamente el valor. En caso de no poseer un densímetro
graduado en esta escala se puede utilizar un densímetro graduado para gravedad específica y utilizar
la siguiente fórmula:
°P = - 463,37 668,72 GE - 205,35× GE 2 [1]
1.1.1 Determinación de extracto original (EO)
NOTA: Esta determinación se le hará al mosto original en la práctica de elaboración de cerveza.

El extracto original (E.O) se refiere a la cantidad azúcares presente en el mosto original; esta es la
cantidad de azúcares de la cual se parte para hacer la fermentación. Se busca tener valores altos de
EO porque esto implica un mayor rendimiento de la fermentación por kilogramo de cereal.
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Reactivos y equipo:
i. Densímetro de rango 9-12 ° Plato (GE: 1,040-1,060) o hidrómetro Baumé.
ii. Cilindro para medición con densímetro
Procedimiento
a. Acondicionar la muestra a una temperatura apropiada (20°C) para la lectura con el
densímetro.
b. Realizar enjuague del cilindro de medición con la muestra.
c. Realizar la lectura de la GE (densímetro) o ºBaumé (hidrómetro) (Escoger el valor más cercano
a la parte posterior del menisco del líquido). Calcular el ºPlato.
1.1.2. Extracto aparente (EA):
El extracto aparente es el dato obtenido directamente de la lectura con densímetro sobre la cantidad
de azúcares presente en la cerveza. Se le llama aparente porque el dato se encuentra alterado por el
alcohol que se formó durante la fermentación. El extracto aparente es menor al extracto original
porque ya hubo fermentación. Al incrementar el contenido de alcohol, la cantidad de sólidos solubles
disminuye y la densidad también.
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + calor + otros (ácidos, esteres, alcoholes, carbohidratos)
Reactivos y equipo:
i. Densímetro rango 0-3 ° Plato (GE: 1,000-1,015) o hidrómetro de Baumé.
ii. Probeta de 250 mL para medición con densímetro.
Procedimiento
a) Descarbonatar la muestra: Agitar la muestra, abrir la botella o lata, trasvasar de un recipiente a
otro varias veces para liberar el gas, colocar dentro de una botella de vidrio y poner en un baño
ultrasónico durante 20 minutos. La cerveza está lista cuando no tenga espuma o la poca cantidad
de espuma restante sea grande.
La muestra descarbonatada también se necesitará para la medida de color y pH. En caso de mucha
levadura centrifugar 10 min.
b) En probeta verter 250 mL de cerveza. Realizar lectura de GE (densímetro) o ºBaumé (hidrómetro).
Escoger valor más cercano a la parte posterior del menisco del líquido. Calcular el ºPlato.
Si se mide el extracto aparente en ºBaumé se debe convertir a GE como se detalla a continuación:

Relación entre gravedad específica (densímetro) y ºBaumé (hidrómetro).
La gravedad específica se puede medir en hidrómetros que miden en unidades de grados Baumé
(ºBe). Para calcular el valor de la GE a partir de los ºBe se utiliza la siguiente fórmula:
145
GE
145 Be
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1.2 Estudio del efecto del alcohol sobre la determinación de °Plato (densidad)
El objetivo de este apartado es poder ejemplificar el efecto del alcohol sobre la densidad, para
entender mejor el concepto de extracto aparente.
a) Tomar 250 mL de las siguientes dos disoluciones de azúcar al 3% m/m en: (1) en agua y (2) en una
disolución de alcohol al 5% v/v, verter en una probeta.
c) Medir el extracto aparente con un densímetro o hidrómetro. Calcular el ºPlato. Determinar la
diferencia en densidad entre las dos disoluciones. ¿Hay diferencias? ¿A qué se deben?
b) Medir el índice de refracción de la disolución con alcohol. Utilizar las fórmulas de la sección 1.3
para determinar el % de alcohol. Analizar el resultado
1.3 Cálculo del porcentaje de alcohol

a) Medir el índice de refracción de las muestras que se le proporcionen.
b) Junto con los datos de GE de las muestras, calcule los porcentajes de alcohol en cada muestra
utilizando las siguientes fórmulas:
% Alcohol (m/m) = 1018- (277,4× GE) + IR × [(937,8× IR) - 1805] [3]

GE
% Alcohol (v/v) = % Alcohol (m/m) x
0,79661 [4]
1.4 Cálculo de color
El color de la cerveza se debe a reacciones de carbohidratos, como Maillard y caramelización. Se

define por estándares ya establecidos que se conocen como valores SRM (Standard Reference
Method, Estados Unidos), °Lovibond (describe el color de los granos de malta) o valores EBC
(European Brewing Convention, Europa).
El valor se define por la lectura de la absorbancia de la muestra a 430 nm. La siguiente escala muestra
la relación entre el valor y el color definido:
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Procedimiento
a) Medir la absorbancia de la muestra de cerveza descarbonatada (si la muestra es turbia debe
centrifugarse o filtrarse hasta obtener una disolución cristalina) Usar como blanco agua destilada.
Calcular el color con la siguiente fórmula:
SRM = 12,7 x A 430
[5]
A430 es la absorbancia a 430 nm en 1 cm
NOTA: Cuando el valor SRM de la cerveza es mayor a 30, las mediciones en cubetas de plástico de 1
cm son aproximadas. En esos casos hay que diluir la muestra a medir con agua desionizada. Para
establecer el dato de color el valor obtenido se debe multiplicar por el factor de dilución (FD), por
ejemplo, si la dilución es 1:1 será igual a 2.
SRM = 12,7 x FD x A 430
[6]
Los valores medidos en SRM y EBC se relacionan a través de las siguientes fórmulas. Calcular también
el color en la escala EBC:
EBC = SRM x 1,97 [7]
EBC
SRM =
1,97 [8]
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Si no se cuenta con un espectrofotómetro, se puede medir color usando tarjetas de referencia de

color (guía Davidson) o usando patrones de color conocidos de cervezas comerciales (ver a visual
guide to beer colour SRM).
1.5 Unidades de amargo
El amargor de la cerveza lo imparte el lúpulo, por sus aceites esenciales y resinas amargas. Las
humulonas (ácido α lupulínico) y lupulonas (ácido β lupulínico).
Durante el calentamiento a ebullición del mosto se da la isomerización de los ácidos α a ácidos iso α.
Estos compuestos son los responsables del amargo y son lo que se extraen al medir el amargor.
Como método oficial de la ASBC se usa la determinación de unidades BU (Bitterness Units), que
corresponde a la absorbancia del extracto de cerveza en iso-octano a 275 nm, previa acidificación con
HCI. Se mide la concentración de ácidos iso α por volumen de cerveza en ppm. 1 unidad BU equivale a
1 mg ácidos iso α/L de cerveza.
Se ha encontrado que algunos preservantes, adjuntos o colorantes pueden contribuir a la absorbancia
que se mide a la longitud de onda de 275 nm, dando un falso positivo a la medición de amargor. Los
posibles efectos de estos materiales deben revisarse antes de reportar el valor de amargor.
Reactivos y equipo:
i. 2,2,4-trimetil pentano (iso-octano) grado espectrofotométrico (debe dar una absorbancia
no mayor a 0,005 a 275 nm.
ii. Acido clorhídrico 3 mol/L (248 g/L)
iii. Alcohol Octílico (grado reactivo)
iv. Espectrofotómetro y cubetas de cuarzo.
v. Agitador horizontal.
Procedimiento:
a. Medir con pipeta aforada 10 mL de cerveza carbonatada a 10ºC y colocar en un tubo
de centrífuga de 50 mL.
b. Adicionar 1 mL de HCl 3 mol/L y agitar suavemente.
c. Adicionar por la pared del tubo 20 mL de iso-octano y 50 µL de alcohol octílico. Cerrar
herméticamente.
d. Agitar por 20 min con agitación vigorosa en un agitador mecánico horizontal.
e. Esperar que se dé la separación de capas
f. Tomar con pipeta pasteur o gotero de la capa superior el volumen necesario para
llenar una cubeta de cuarzo 1 cm (debe hacerse con mucho cuidado para no arrastrar
parte de la capa inferior).
g. Preparar un blanco formado por 20 mL de iso-octano y 50 µL de alcohol octílico.
h. Leer la absorbancia a 275 nm, ajustando primero el equipo con la medición del blanco
y posteriormente midiendo las muestras.
i. Con la siguiente ecuación determinar las unidades BU:
BU = Abs 275 * 50
[9]
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1.6 pH de las muestras de cerveza descarbonatadas

Las cervezas deben mantener un pH ácido para el óptimo trabajo de las enzimas. Los minerales del
agua son indispensables en el control del pH.
a. Con un pHmetro medir el pH de las muestras de cerveza. Recordar calibrar previamente el equipo.
2. Prueba sensorial de las cervezas analizadas evaluando color, amargo y cuerpo: Establecer una
escala del 1 al 10, siendo 10 el máximo, para evaluar cada parámetro en todas las cervezas
analizadas por el grupo.
3. Tratamiento de los datos:
i. Elaborar una tabla de comparación de las diferentes cervezas analizadas por todo el grupo,
donde se comparen los análisis químicos con las pruebas sensoriales: Amargor (sensorial) y pH
con amargor, color sensorial con color, y cuerpo con extracto aparente y % alcohol.
Elaborar una tabla con el tipo y composición de las cervezas analizadas por todo el grupo y comparar
con los resultados experimentales.
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41
CURSO
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS TA-0115
PRÁCTICA
ELABORACIÓN DE CERVEZA
OBJETIVOS
 Realizar una cerveza a nivel artesanal
 Comparar diferentes tipos de cerveza
 Analizar el papel de las enzimas involucradas en el proceso de maceración
 Analizar el producto final obtenido
PROCEDIMIENTO
a) Maceración
1. Mezcle 3 litros de agua con 1 Kg de la malta elegida (en caso de la cerveza fuerte se mezclan 3,5 litros de
agua a 50ºC con 1,3 kg de malta). Mezcle bien y deje reposar durante 10 minutos. Verifique que el pH se
encuentra entre 5,4 y 5,6 (sino ajústelo con ácido fosfórico)
2. Aumente la temperatura hasta 65ºC y deje reposar durante 30 minutos
3. Aumente la temperatura a 72°C y deje reposar durante 30 minutos.
4. Realice una prueba de yodo-yoduro para asegurarse que no hay presencia de almidón
Nota: es importante que la temperatura se verifique cada 10 minutos para asegurar que no ha
disminuido
b) Filtración
1. Para esta etapa deben prepararse 4 litros de agua a 78ºC con anterioridad
2. Aumente la temperatura del producto de maceración hasta 78ºC
3. Con ayuda de un colador filtre la mezcla, de manera que las cáscaras de la malta se queden atrapadas
4. Agregue las cáscaras que quedan en el colador a la olla con agua a 78°C, mezcle un poco y filtre. Una los
filtrados
c) Cocción
1. Aumente la temperatura de la mezcla hasta que comience a hervir. En este momento agregue 2/3 partes (4g)
del lúpulo y deje en ebullición durante 45 minutos
2. Cuando se cumplan los 45 minutos agregue el lúpulo restante y deje ebullir por 15 minutos más
Nota: Después de la cocción se debe trabajar lo más aséptico posible para evitar recontaminación. Lo
más recomendable es desinfectar todo con una solución que contenga unas 50 gotas de cloro por litro
de agua
d) Clarificación y enfriamiento
1. Con la ayuda del colador y la manta filtre el mosto por porciones (para evitar que se bloquee la manta) hasta
obtener un líquido con muy poca turbidez
2. Caliente hasta ebullición y enfríe el mosto en un recipiente cerrado hasta la temperatura de fermentación.
3. Determine el extracto original y pH del mosto obtenido
4. Agregue la levadura (40 ml) y mezcle bien
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E-mail: tecnologia.alimentos@ucr.ac.cr
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e) Fermentación
Ponga el recipiente en la cámara asignada. Y deje por 6 días.
f) Envasado
1. Lave y desinfecte las botellas que se van a usar.
2. Prepare un almíbar mezclando 30 g de azúcar en 350 mL de agua.
3. Caliente el almíbar hasta disolución completa del azúcar y agregue 20 mL de esta mezcla a cada botella de 350
mL (la idea es que se agreguen 4,5 g de azúcar por cada litro de cerveza)
4. Agregue la cerveza y cierre herméticamente
5. Deje fermentar en cámara asignada 2días
6. Enfríe a 1°C y almacene durante una semana como mínimo antes de probar.
ANÁLISIS
Analice la cerveza obtenida:
1. pH
2. Extracto final
3. % de alcohol
4. Sensorial
43
Maceración
3 l agua + 1 Kg de malta (marmita groen) - mezcle bien – 10 min.

pH entre 5,4 y 5,6 (sino ajústelo con ácido fosfórico)
65ºC / 30 minutos (Simultáneamente calentar agua a 80ºC en otra marmita)
72°C / 30 minutos (verificar temperatura cada 10 minutos)
Realizar prueba de yodo-yoduro para asegurarse que no hay presencia de almidón

Filtración
Preparar 4 litros de agua a 78ºC con anterioridad
Subir temperatura a 78ºC
Filtre la muestra (colador)
Lave cáscaras de colador con agua a 78ºC
Mezcle y filtre a través de manta (una filtrados)

Cocción
(Después de la cocción se debe trabajar de forma aséptica )
(Desinfectar todo con solución con 50 gotas de cloro por litro de agua y agua hirviendo)
Hervir la mezcla y agregar 2/3 partes (4g) del lúpulo
Deje en ebullición 45 minutos
Agregue el lúpulo restante
Deje ebullir por 15
Clarificación y enfriamiento
Con colador y manta filtre el mosto por porciones (para evitar que se bloquee la manta) hasta poca turbidez
Ebullición y enfríe en recipiente cerrado hasta temperatura de fermentación.
Determine el extracto original y pH del mosto obtenido y agregue la levadura (40 ml) y mezcle bien
Fermentación
6 días
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Envasado
Lave y desinfecte las botellas que se van a usar.

Prepare un almíbar mezclando 30 g de azúcar en 350 mL de agua.
Caliente el almíbar hasta disolución completa del azúcar y agregue 20 mL de esta mezcla a cada botella de 350
mL (la idea es que se agreguen 4,5 g de azúcar por cada litro de cerveza)
Agregue la cerveza y cierre herméticamente

Deje fermentar en cámara asignada 2días
Enfríe a 1°C y almacene durante una semana como mínimo antes de probar.
ANÁLISIS
1. pH
2. Extracto final
3. % de alcohol
4. Sensorial
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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

Manual de Prácticas de Laboratorio

Profesora: M.Sc. Andrea Irías Mata

Figura 1. Micropipeta y sus partes

El uso correcto de la micropipeta es esencial para garantizar resultados confiables, por lo

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Un ejemplo claro es en la preparación de curvas de calibración de almidón y glucosa,

Adquirir destreza en la utilización de la micropipeta y el espectrofotómetro UV-visible.

Materiales, equipos y reactivos

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Ver la figura 2 donde se muestra el manejo adecuado de la micropipeta, y observar como

Figura 2. Manejo de la micropipeta

B. Determinación espectrofotométrica de almidón5

1. Preparación de una disolución de iodo-ioduro (ya va a estar preparada)

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

c. Agregar la mezcla anterior en 900 mL de agua hirviendo en un beaker de 1L con

A. Determinación enzimática de glucosa (método de Trinder)5

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Figura 2. Principio del método enzimático de Trinder

1. Preparación de la curva de calibración

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

4. Duymovich, C.; Acheme, R.; Sesini, S & Mazzionta, D. (2005). Espectrofotómetros y

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

TA-0115 II CICLO 2014

Figura 1. Componentes del almidón y sus enzimas

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

A. Sacarificación de una disolución de almidón: Tratamiento enzimático secuencial para

1. Preparación de disolución de -amilasa (ya está preparada)

4. Determinación de la concentración inicial de almidón

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

d. Preparar dos blancos: 0,5 mL agua destilada + 5 mL HCl 0,1M + 5 mL disolución

5. Determinación de glucosa inicial (método de Trinder)

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

c. Determinar la concentración de glucosa de la disolución de la muestra por el

II. Si es amiloglucosidasa, Aspergillus niger:

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

e. Aforar con agua destilada a 50 mL en un balón aforado

B. Efecto del pH en la actividad enzimática

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

C. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

c. Porcentaje de almidón hidrolizado después de cada tratamiento enzimático.

 Bonilla, A. (2007) Determinación de la concentración de glucosa en la elaboración de

 Bonilla, A. (2009) Hidrólisis de almidón utilizando varias fuentes de alfa amilasa.

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Disolución Crystalzyme PMLX

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Precalentar de forma cuidadosa la pulpa en un baño de agua a la temperatura de proceso T

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Contenido de sólidos insolubles suspendidos (%SIS) y de sólidos solubles (ºBrix)

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Teléfono: 2511-35-04 Fax: 2511-47-10

Efecto del tiempo y temperatura de exposición sobre la inactivación de la

La peroxidasa (POD) (donor: hydrogen peroxide oxidoreductase, EC 1.11.1.7) cataliza

La cinética de la POD se ve afectada por la concentración de donadores, pero se ve

El objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de la temperatura y tiempo de

Licuadora, beakers, agitadores de vidrio, gasa, embudos de espiga, centrifuga, tubos

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Determinación de actividad de la POD