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Reporte No.

1: Produccin de biomasa
Laboratorio de Procesos Microbiolgicos
Cynthia Aseneth Velzquez Juan Antonio Cortez Olmos

Lic. En Qumica Industrial

Semestre: 8
1

27 de Septiembre del 2013

Objetivos
El alumno obtendr por medio de una fermentacin la produccin de Biomasa. Valorar varios parmetros con lo cual observar su variacin conforme aumenta la cantidad de clulas producidas. Determinar parmetros como el pH, consumo de fuente de carbono y monitorear el crecimiento de las clulas midiendo la turbidez del medio.

Antecedentes y fundamento
Dentro de la microbiologa industrial, un producto de inters son las clulas microbianas. La produccin de estas se conoce como biomasa, protena microbiana o protena unicelular. Entre los microorganismos utilizados para este fin se encuentran las levaduras que pueden servir como alimento y en panadera, hongos comestibles cultivados y en caso de las bacterias especies de Bacilus thuringiensis que emplean para produccin de bioinsecticidas, as como Rhizobium y Bradyrhizobium producidos para inocular semillas de leguminosas. Las levaduras son los microorganismos ms importantes y ms ampliamente utilizados en la industria. Las clulas de levadura se utilizan en la fabricacin de pan, y tambin como fuente de alimento, de vitaminas y de diversos factores de crecimiento. Lo ms conocido y comercialmente significativo de las levaduras son las especies y cepas relacionadas de Saccharomyces cerevisiae. Este organismo ha sido largamente utilizado para fermentar azcares del arroz, del trigo, de la cebada y del maz para la produccin de bebidas alcohlicas y en la industria de panificacin para expandir o aumentar la masa. Saccharomyces cerevisiae es comnmente usada como levadura en el pan y para algunos tipos de fermentacin. Extractos de levadura se administran a menudo como suplemento vitamnico ya que estn constituidas en un 50% por protenas y son fuente importante de vitaminas B, niacina, y cido flico.

En la industria cervecera Saccharomyces carlsbergensis se usa en la produccin de varios tipos de cerveza. En la fermentacin del vino, esta se inicia naturalmente por las levaduras presentes en las uvas. Muchas bodegas usan aun las cepas de levaduras naturales presentes en los mismos viedos; de todos modos muchas usan los modernos mtodos de mantenimiento y aislamiento de diferentes cepas de levaduras. Una sola clula de levadura puede fermentar su propio peso de glucosa por hora. Los panaderos utilizan la levadura como agente estimulante del leudante, la masa antes de su coccin as como para conferir al pan el aroma que le caracteriza. Durante el proceso del leudado la levadura se mezcla con la masa hmeda en presencia de una pequea cantidad de azcar. As, la levadura convierte la levadura en alcohol y CO2 a continuacin de lo cual el CO2 gaseoso se expande y hace que la masa se levante y se esponje. Cuando se cuece el pan, el calor expulsa el CO2 y el alcohol, por lo que se forman agujeros dentro de la masa que le dan su textura ligera caracterstica. Bajo la simple apariencia de un hongo yace uno de los organismos ms importantes en la actualidad en la investigacin cientfica, sobre el que se estn estudiando aspectos bsicos en gentica molecular. En las dos ltimas dcadas S. cerevisiae ha sido el sistema modelo para estudiar mecanismos de divisin celular, de aplicabilidad en el cncer, y de metabolismo ya que estos procesos estn muy conservados entre las levaduras y los mamferos. Cromosomas de levaduras se utilizan como lanzaderas para introducir fragmentos de DNA modificados en diferentes organismos y estudiar la expresin de genes, datos que proporcionan grandes avances en el campo de la biomedicina. Otros aspectos menos atractivos de las levaduras seran las enfermedades producidas por hongos parecidos a levaduras como Cndida albicans que se encuentra normalmente en la boca, vagina y en el tracto intestinal. Cndida es un habitante normal en los humanos y normalmente no causa ninguna patologa. De todas formas entre los nios y entre los individuos inmunodeprimidos como los pacientes con cncer tratados con quimioterapia pueden causar diversas complicaciones.

Material y reactivos
Material:
1 Barra magntica 2 Placas Petri 1 Matraz Erlenmeyer de 1000 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 50 mL 10 Pipetas estriles 10 Tubos de 13x100 tarados 10 Tubos de 18x150 estriles con rosca Asa bacteriolgica Cubreobjetos Portaobjetos Desecador Equipo de Tincin Mechero Vidrio de reloj

Reactivos:
Sacarosa (NH4)2SO4 NH4H2PO4 MgSO4*H2O Extracto de levadura cido clorhdrico 1:1 NaOH 1:1 Cultivo de Saccharomyces cerevisiae Disolucin patrn de glucosa 1 M cido 3,5-dinitrosaliclico

Procedimiento
Preparacin del medio de fermentacin
Preparar 760 mL medio de cultivo como sigue: Sacarosa (Azcar morena) 1.5% (NH4)2SO4 .... 2.0% NH4H2PO4 . 0.04% MgSO4H2O .0.25% Extracto de levadura . 0.25% pH 4.5-5.5 Calentar bajo agitacin a 90C durante 1 h. Esterilizar el medio a 15lb/121C/15min. Agregar al matraz 3 200 mL de este medio y 50 mL al matraz 2 de este medio. Agregar 1.5% de sacarosa al matraz 1.

Matraz 1

Matraz 3

Matraz 2

A estos 200 mL de medio, agregarle 1% de sacarosa.

A estos 50 mL de medio, agregarle 0.5% de sacarosa.

Agregarles 5 mL de medio del matraz 1 a cada tubo.

Ajustar el pH de cada matraz y de los dos tubos entre 4.5 - 5.0 de unidades de pH.

Matraz 2

Matraz 3

Al matraz 2, agregar 10 mL de S. cerevisiae y guardar el tubo para esterilizar despus. (El rea tiene que estar estril). Meter el matraz en el Shaker a 200 RPM por 24 h.

Matraz 2

Esterilizar el rea de trabajo. Con pipeta estril transferir 30 mL del matraz 2 al matraz 3 y agitar este por 24 h.

Matraz 3

Matraz 1

Esterilizar el rea de trabajo. Con pipeta estril transferir 75 mL del matraz 3 al matraz 1 y mantener en agitacin.

Matraz 1

Tomar 10 mL de muestra cada 40 min. Y medirle el pH.

Tomar 10 mL de muestra c/ 40 min. Medirle la absorbancia a 665 nm.

Tomar muestra cada 40 minutos (4 muestras: 0, 1, 2, 3, 4), enfriar y a cada tubo hacerle diluciones 1:10, 1:20, 1:50 y 1:100 (0.1 mL de muestra + 0.9, 1.9, 4.9 y 9.9 mL de agua respectivamente, tomar 1 mL de cada tubo y agregarles 1 mL de 3,5-dinitrosaliclico, calentar por 5 minutos en b.a., enfriar, y agregar 8 mL de agua). Hacer mediciones de absorbancia a 540 nm en el espectrofotmetro de UV/Vis.

Sembrar en PDA (Habr crecimiento). Incubar a 28C.

Sembrar en AN (No habr crecimiento). Incubar a 35C.

Estndares Para disolucin Patrn de Glucosa Disolucin de Glucosa (mL) 1 2 3 Agua Destilada (mL) 9 8 7 Concentracin (M) 1 2 3

Teir con azul de lactofenol y observar en el microscopio.

1.5 1 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

4 5 6 7 8 9 0

6 5 4 3 2 1 1

4 5 6 7 8 9 BLANCO

Construir una curva de calibracin. 1mL de estndar de glucosa + 1 mL 3,5dinitrosaliclico, calentar por 5 minutos, enfriar, agregar 8 mL de agua y medir en el espectrofotmetro UV/Vis a 540 nm.

Resultados y
1. Turbidez y pH

discusiones

Tabla 1. Valores obtenidos de pH y absorbancia a 665nm de cada muestra tomada en cinco tiempos durante la agitacin de la biomasa producida por Saccharomyces cerevisiae.

Tiempo (min) 0 40 80 120 160

Muestra 0 1 2 3 4

pH 4.76 4.34 4.73 4.54 4.70

Abs. 0.358 0.372 0.413 0.443 0.477

Determinacin de pH
5.00 4.80 4.60 4.40 4.20 pH 4.00 3.80 3.60 3.40 3.20 3.00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 t (min)

Grfica 1. Efecto del tiempo de agitacin en el pH de la biomasa producida por

Saccharomyces cerevisiae.

Se observa en el grfico 1 como el pH se mantiene prcticamente constante despus de los 40 minutos de agitacin de la biomasa producida, en el cual no hay diferencias significativas dado que al iniciar la produccin de biomasa el pH debe rondar entre 4.3 y 4.7.

Turbidez
0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 t (min)

De acuerdo con el grfico 2 la absorbancia tiende a aumentar conforme trascurre el tiempo, esto es debido a que la turbidez debe aumentar conforme se va produciendo ms biomasa. Probablemente se debi haber tomado ms muestras despus de 120 minutos para poder observar el momento en el que la absorbancia tiende a mantenerse constante indicando que ya las clulas en el medio se mantienen constantes al acabarse los recursos del mismo para la produccin de biomasa.

2. Azcares reductores
Tabla 2. Datos para la curva de calibracin de la determinacin de azcares reductores en la produccin de biomasa a partir de Saccharomyces cerevisiae.

Absorbancia

Grfico 2. Efecto del tiempo de agitacin en la absorbancia con respecto a la turbidez de la biomasa producida por Saccharomyces cerevisiae.

Concentracin de glucosa (M)

Absorbancia

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6

0.206 0.211 0.342 0.371 0.43 0.564 0.708 0.723 0.782 0.891 0.985

y = 0.0811x + 0.0784 R = 0.9835

Absorbancia

10

12

Concentracin de glucosa (M)

Grfico 3. Curva de calibracin para la determinacin de azcares reductores (glucosa) en la produccin de biomasa a partir de Saccharomyces cerevisiae. Tabla 3. Parmetros analticos de la curva de calibracin.

Ecuacin de regresin Coeficiente de regresin (r) Lmite de deteccin (LOD) Lmite de cuantificacin (LOQ)

y= 0.0811[glucosa] + 0.0784 0.9835 1.36 M 4.53 M

Al calcular la ecuacin de regresin con los datos de la curva de calibracin, se obtiene un coeficiente de regresin de 0.9835 el cual no es muy bueno, esto se debe a que al preparar los estndares no se hizo con pipetas volumtricas, produciendo un alto margen de error en las mediciones de absorbancia, dado que esta es proporcional a la concentracin y al volumen agregado de glucosa. Se calcul los LOD y LOQ los cuales son aceptables dado que la deteccin de la concentracin de una muestra comienza en el 1.36 y de cuantificacin a los 4.53 M.

Tabla 4. Valores absorbancia a 540 nm obtenidos para diferentes diluciones con respecto al tiempo en la produccin de biomasa con Saccharomyses cerevisiae en la determinacin de azucares reductores.

Muestra 0 1 2 3 4 1:10 0.0330 0.1480 0.1560 0.5570 0.8730

Absorbancia Dilucin 1:20 1:50 0.0320 0.0410 0.0149 0.0270 0.0470 0.0200 0.0480 0.0320 0.1260 0.0230

1:100 0.0300 0.0130 0.0180 0.0020 0.0100

Al realizar las diluciones 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 de cinco muestras (0, 1, 2, 3, 4) tomadas cada 40 min. del matraz en el cual se fue formando la biomasa con agitacin constante, se obtuvieron los valores de absorbancia de la tabla 4 ledos a 540 nm.
1.0000 0.9000 0.8000 0.7000 Absorbancia 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 0 1 2 Muestra 3 4 5 '1:10 '1:20 '1:50 '1:100

Grfico 4. Efecto de la absorbancia en la formacin de la biomasa con respecto al tiempo de las diluciones 1:10, 1:20, 1:50, 1:100.

Se puede observar en el grfico 4 como en la dilucin 1:10 conforme avanz la produccin de biomasa aument la absorbancia debido al mismo aumento de partculas suspendidas en la solucin que es la biomasa, significando que si se dio la produccin satisfactoriamente. La dilucin 1:20 muestra el mismo comportamiento pero menos pronunciado. En las diluciones 1:50 y 1:100 se comienza a notar valores de absorbancia prcticamente constantes.
Tabla 5. Valores de concentraciones de azucares reductores, obtenidas a partir de la curva de calibracin de las variaciones de diferentes disoluciones con respecto al tiempo.

Muestra

0 1 2 3 4

Concentracin de glucosa (M) Dilucin 1:10 1:20 1:50 -0.0614 -0.0313 -0.0102 0.0853 -0.0422 -0.0138 0.0955 -0.0217 -0.0156 0.6070 -0.0211 -0.0125 1.0101 0.0286 -0.0148

1:100 -0.0065 -0.0087 -0.0080 -0.0101 -0.0091

En la tabla 5 se muestra como en las diferentes diluciones se obtuvieron concentraciones negativas, lo que significa que cuando la produccin de biomasa comienza es que esas concentraciones se hacen positivas indicando la presencia de las mismas.

3. Control de calidad

Imagen 1. Saccharomyses cerevisiae en azul de lactofenol vista a 100 X

Imagen 2. Saccharomyses cerevisiae en porta y cubre vista a 100 X

En las imgenes 1 y 2 se puede observar como en realidad si se obtuvo la biomasa a partir de Saccharomyces cerevisiae, stas fueron sembradas en PDA y AN, las que se muestran fueron en PDA las cuales si tuvieron crecimiento y las de Agar nutritivo no como era de esperarse.

Conclusiones
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Se logra producir biomasa, aunque a muy pequeas concentraciones, a partir de levadura de panadera. En base a los resultados se concluye que la produccin de la biomasa se lleva a cabo inmediatamente de inocular, como se muestra en los resultados de turbidez y pH. La determinacin de azucares nos muestra que es imposible conocer la concentracin de la biomasa por este mtodo en estas condiciones, esto debido posiblemente, al utilizar levadura de panadera en vez de una cepa de Saccharomyces Cerevisiae y que esta requiera ms tiempo para ser activada. Se logra aprender el proceso microbiolgico de la produccin de biomasa as como las principales variables que se deben tomar en cuenta, como la agitacin, la temperatura, la composicin del medio y el tiempo de incubacin as como el escalamiento, para realizar dicho proceso.

Referencias
Laboratorio de Procesos Microbiolgicos. Manual de Prcticas. Ediciones Internas, U.A.N.L. Biotecnologa5, Produccin de Biomasa Microbiana, Visitado el 20/09/2013 [Online] http://biotecnologiaequipo5.blogspot.mx/p/produccion-de-biomasa-microbiana.html APPA, Qu es la biomasa?, Visitado el 20/09/2013 [Online] http://www.appa.es/04biomasa/04que_es.php

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