UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

Departamento Académico de Química Orgánica

PRÁCTICA N°3
PROTEINAS Y AMINOÁCIDOS
Las proteínas, son compuestos orgánicos de alto peso molecular que contienen
nitrógeno, constituidos por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que se caracterizan
por tener una organización estructural compleja.
Las proteínas se dividen en: simples (o proteínas) y conjugadas (complejas). Las
primeras constan sólo de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que pueden formar
una o más cadenas polipeptídicas. Las proteínas conjugadas están asociadas, aparte de los
aminoácidos, con componentes no proteicos o grupo prostético (carbohidrato, lípido,
ácido nucleico, cofactor, etc.). Las proteínas tienen varios niveles de organización
estructural: primario, secundario, terciario y, en la mayoría de los casos, cuaternario
Las propiedades físicas, químicas, fisicoquímicas y biológicas de las proteínas dependen
del tipo de aminoácidos que las forman, de ahí que se aproveche este conocimiento para
identificar tanto a los aminoácidos como a las proteínas que los contienen. Para la
identificación de los aminoácidos se realizarán pruebas cualitativas de reacciones
químicas coloración.
I. NATURALEZA QUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS SIMPLES
La presencia de proteínas en el material biológico y en medicamentos se puede
identificar mediante reacciones cualitativas sobre los grupos componentes de la proteína
y sus grupos funcionales. Todas las reacciones de identificación de proteínas y péptidos
se pueden dividir en tres tipos:
1. Reacción sobre el enlace peptídico, específica de la cadena polipeptídica y no
propia para otras sustancias biológicas.
2. Reacciones sobre grupos terminales -amino ó -carboxilo. Esta reacción, la dan
también los -aminoácidos libres y algunos otros compuestos.
3. Reacciones sobre ciertos radicales laterales o grupos de aminoácidos, que están
en polipéptidos. Estas reacciones son específicas también para los -aminoácidos
libres y otras sustancias, que contienen el grupo funcional correspondiente en la
molécula.

Laboratorio No 3. Reacciones cualitativas de proteínas y aminoácidos

OBJETIVOS:
Caracterizar a los aminoácidos y proteínas por medio de sus propiedades
químicas.
Instrumental, reactivos. Tubos de ensayo; goteros; pipetas de 1 y 5 mL; probetas de 10
mL; baño de agua; termómetro; pinzas para tubos de ensayo; reactivo de Biuret;
ninhidrina; solución acuosa al 0,5%; ácido nítrico concentrado; hidróxido de sodio al 10
y 20%; reactivo Millon; ácido acético glacial; ácido sulfúrico concentrado y al 2,5%;
acetato de plomo al 5%; nitroprusiato de sodio al 5%; -naftol (0,2%) en alcohol;
hipobromito de sodio; ácido sulfanílico (1%) en ácido clorhídrico (5%); nitrito de potasio
(0,5%); carbonato de sodio (10%); sulfato de cobre (0,04 M);
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1. Material. 1. Solución de ovoalbúmina (la proteína de huevo fresco de gallina la

separan de la yema, la disuelven en un volumen 20 veces mayor de agua destilada, filtran
a través de varias capas de gasa y la conservan en la refrigeradora.
2. Ovoalbúmina no diluida.
3. Soluciones al 1%, de glicina, -alanina, -alanina
4. Soluciones al 0,01% de fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina, hidrocloruro
de cisteína, metionina, -alanina, -alanina, lisina, arginina, glicina, prolina.
a. Reacción de Biuret sobre el grupo peptídico. Las proteínas (polipéptidos) en
solución alcalina en presencia de sulfato de cobre (II) forman compuestos complejos de
cobre, de coloración azul-violeta con matices rojizo o azulado, la intensidad de la cual
depende del número de enlaces peptídicos en la molécula de la proteína.
Dos moléculas de la forma dienólica de Biuret interaccionan con hidróxido de cobre
(II) y forman un compuesto complejo, en el cual los enlaces de coordinación se han
formado por el par electrónico de los átomos de nitrógeno de los grupos imino.
O O O
Calentamiento
2 H2N C NH2 NH3 + H2N C NH C NH2

Urea Biuret
O O
H2N C NH C NH2 HN C NH C
NH OH OH
Biuret

Los complejos de este tipo poseen fundamentalmente color rojo (con un máximo
de absorción de 520—535 nm). En el caso de la formación de los complejos de cobre con
la participación de tres o de dos átomos de nitrógeno el color de ellos preferentemente es
violeta y azul (con un máximo de absorción en los límites de 540—580 nm y 615—670
nm correspondientemente). Por eso el color de las soluciones durante la ejecución de la
reacción de Biuret varía desde el azul hasta el rojo con predominancia del color violeta.
En medio fuertemente alcalino los grupos peptídicos de los polipéptidos pasan a la
forma enólica, en la que interaccionan con el ion Cu2+, formando el complejo coloreado
de Biuret, aproximadamente de la siguiente estructura:

R O
··· C N C N CH ···
CH CH O - R´´
R

Cu
R O R´´
··· CH C N CH C N CH
··· R O -

Con los aminoácidos libres generalmente dan reacción negativa, a excepción de los
aminoácidos histidina, serina, treonina y asparagina, los cuales, en solución y a altas
concentraciones, pueden formar el complejo coloreado de Biuret Cu2+.
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Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 5 gotas de solución de proteína

de huevo, en otro—glicina.
A cada tubo agregan dos gotas del reactivo de Biuret, agitan suavemente y observan
la aparición de la coloración.
b. Reacción de la ninhidrina sobre el grupo -amino. El método se basa en la
interacción de la ninhidrina con el grupo -amino de aminoácidos, péptidos y proteínas
con la formación de un complejo de color azul o azul-violeta.
Por calentamiento, en presencia de ninhidrina se produce la desaminación oxidativa
del grupo -amino de los aminoácidos y péptidos, y reducción de la molécula de
ninhidrina.
Al principio, como resultado de la interacción del aminoácido con la ninhidrina, se
forma la base de Shiff. Luego de la reagrupación se descarboxila y descompone a aldehído
y aminodicetohidrindeno.
O O
2 H2 O
OH H H reagrupación
+ H2N C COOH N C
OH COOH
R
O R
O O
O
O H O
H
CO2
H H +R C
H + H2 O
N C N C descomposición
NH2 H
COOH descarboxilación
O R O Aldehído
O R
Dicetohidrindeno

El compuesto aminodicetohidrindeno se condensa con una molécula más de ninhidrina,

y el compuesto obtenido, enolizándose, pasa a la forma coloreada azul-violeta denominada
“Púrpura de Ruheman”:
O O O O
H2 O
H H
+ N
O
NH2
O O
O O
O O O
O

N + H+
N

-
OH O O O

Púrpura de Ruhemann
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En presencia de solventes orgánicos (acetona, etanol, piridina, etc.), en los que

comúnmente se prepara la solución de ninhidrina, ocurre la siguiente reacción:
O
O O O-
H
N CH CH2 R + O N + H2O

O CH
O O- O
CH

El producto de esta reacción contiene en su composición el radical (R) del

aminoácido inicial, el cual determina los diferentes colores de los compuestos (celeste,
rojo, etc.) que se forman por la reacción de los aminoácidos con la ninhidrina.
Actualmente la reacción con la ninhidrina se usa ampliamente tanto para la
detección de ciertos aminoácidos como para la determinación de su cantidad.
La prolina e hidroxiprolina con ninhidrina dan un producto de color amarillo. La
reacción de la ninhidrina puede ser positiva con ciertas aminas, amidas de ácidos y algunos
otros compuestos.
O O

+
O + HN N + CO + H O
2 2

O COO O
Ninhidrin H Producto de
a Prolina color amarillo
brillante

Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 5 gotas de solución de

ovoalbúmina, en otro —-alanina, en un tercero— -alanina y en un cuarto prolina. Luego
agregan a cada tubo 2 gotas de solución de ninhidrina, calientan hasta ebullición y,
después de 1—3 minutos, observan la aparición de la coloración.
a. Reacción xantoproteica sobre el anillo aromático de aminoácidos cíclicos
El método se basa en la capacidad de los aminoácidos y, de residuos de aminoácidos
de polipéptidos que contienen anillo aromático para formar, por interacción con ácido
nítrico concentrado, compuestos dinitro-derivados de color amarillo. En medio alcalino,
estos compuestos forman grupos cromóforos con estructuras quinoideas que tienen
O
OH OH O O ONa
O 2N NO2 O 2N N O 2N N O
O
+ 2HNO3 + NaOH
2

-2H O - H 2O

CH2 CH2 CH2 CH2

H2N C COOH
H2N C COOH H2N C COOH H2N C COOH
H H H H
Tirosina Dinitrotirosina Forma Sal de sodio de la
quinoidea de estructura
dinitrotirosina quinoidea de
(color amarillo) dinitrotirosina
(color anaranjado)
coloración anaranjada. La reacción xantoproteica es característica para la fenilalanina,
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tirosina y triptófano, que tienen anillo aromático (bencénico). Estos aminoácidos, o las
proteínas que los contienen, por calentamiento con ácido nítrico concentrado dan
nitrocompuestos de color amarillo. La gelatina, por ejemplo, no contiene aminoácidos
aromáticos y no da reacción positiva.
Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 5 gotas de solución de
proteína de huevo, en otro — fenilalanina, en el tercer tubo — tirosina y en el cuarto —
histidina.
A cada tubo añaden 3 gotas de ácido nítrico concentrado, y los calientan hasta
ebullición (¡cuidado! Usar lentes protectores). Observar la aparición de la coloración.
El contenido de los tubos lo enfrían bajo chorro de agua, luego a cada uno, por gotas,
le añaden solución de hidróxido de sodio hasta que no se inicie el cambio de coloración.

b. Reacción de Millón sobre la tirosina

El método se basa en la reacción del aminoácido aromático tirosina (en forma libre
o en la composición de las proteínas), que contiene un núcleo fenólico, por calentamiento
con el reactivo de Millón (mezcla de nitratos y nitritos de mercurio (I) y (II), disueltos en
ácido nítrico concentrado) se forma la sal de mercurio de nitrotirosina, de color rojo-
púrpura:
OH O
OHg
N
2+ O
Hg ; HNO 3
+ HgNO2 + H2O

CH2 CH2
H2N CH COOH H2N CH COOH

Tirosina Compuesto de
mercurio de
nitrosotirosina

Esta reacción es también positiva para los compuestos fenólicos.

Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 10 gotas de solución de
proteína de huevo, en otro—tirosina y, en un tercero—fenilalanina. A cada uno de ellos
le añaden 3 gotas del reactivo Millón y cuidadosamente los calientan en baño de agua (no
mayor de 50o C), observando la aparición de la coloración.
c. Reacción de Hopkins-Cole (Adamkiewicz) sobre triptófano

El método se basa en la capacidad del triptófano de reaccionar, en medio ácido, con

el ácido glioxílico formando por condensación un compuesto de color rojo-violeta.
El triptófano en esta reacción se condensa con el formaldehído, que se desprende
del ácido glioxílico por acción del ácido sulfúrico:
Por calentamiento, dos moléculas de triptófano interaccionan con el ácido glioxílico
con la formación del compuesto coloreado.
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Utilizar en la reacción el ácido acético glacial, el cual como impureza tiene ácido
glioxílico. Como agente deshidratante, en la reacción se utiliza ácido sulfúrico
concentrado.
Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 2 gotas de proteína no
diluida de huevo fresco, en otro—solución de triptófano.
A cada tubo agregan 10 gotas de ácido acético glacial y, calientan cuidadosamente
ambos tubos hasta disolución del precipitado formado en el primer tubo, después de lo
O O
HOOC C H2SO4 CO2 + H C
H H
Ácido glioxálico Formaldehído
COOH COOH COOH COOH

H2N CH HC NH2 H2N CH HC NH2

CH2 CH2 CH2 CH2

O H2SO4
+ CH2 + H2 O
C + N
N N N
H H H H H
H

Triptofano bis-2-triptofanilmetano
Triptofano
cual, enfrían el contenido de este tubo.

Con mucho cuidado, después de inclinar el tubo, agregan por la pared de este, cerca
de 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, cuidando de que los líquidos no se mezclen. En
el límite de las dos capas surge un anillo coloreado característico que difunde por toda la
solución.

d. Reacción de Foly sobre aminoácidos que contienen azufre débilmente

unido (cisteína, cistina).
El método está basado en la capacidad de las proteínas, en la composición de las
cuales se encuentran aminoácidos que contienen azufre (cisteína, cistina), de formar, por
calentamiento en medio alcalino, sulfuro de sodio, el mismo que con plumbito de sodio
da un precipitado de sulfuro de plomo de color negro o pardo:
H 2C SH H 2C OH
HC NH2 + 2 NaOH HC NH2 + Na2S + H 2O

COOH COOH

Cisteína Serina
Pb(CH3COO)2 + 2 NaOH Pb(OH)2 + 2 CH3COONa

Pb(OH)2 + 2 NaOH Na2PbO2 + 2 H2O

Na2S + Na2PbO2 + H2O PbS + 4NaOH

Color negro
Curso de la determinación. En tres tubos de ensayo colocan 10 gotas de solución
de acetato de plomo y, por gotas, a cada uno de ellos añadir hidróxido de sodio hasta la
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disolución del precipitado formado al principio. A uno de los tubos, agregar 5 gotas de
solución de proteína de huevo, al segundo—cisteína, y al tercero—metionina. Hervir las
mezclas 1—2 minutos y observan los cambios de color y formación del precipitado.

e. Reacción de aminoácidos que contienen azufre con nitroprusiato sodio

El método se basa en la capacidad del sulfuro de sodio, obtenido por hidrólisis

alcalina de aminoácidos que contienen azufre, de formar con nitroprusiato de sodio un
compuesto complejo coloreado de color rojo-violeta:
H 2C SH H 2C OH
Ebullición
HC NH2 + 2 NaOH HC NH2 + Na2S + H 2O

COOH COOH
Cisteína Serina

Na2S + Na2[Fe(CN)5NO] Na4[Fe(CN)5NOS]

Nitroprusiato de sodio Complejo
coloreado
rojo-violeta

Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 5 gotas de albúmina

fresca no diluida, en otro—solución de cisteína, y en un tercero—metionina. A cada
tubo agregan 10 gotas de solución de hidróxido de sodio y hierven por 3 minutos, luego
enfrían el contenido. Después a la mezcla de cada tubo añaden 2—3 gotas de solución
de nitroprusiato de sodio y observan la aparición de la coloración.
h. Reacción de SAKAGUCHI (característica de las guanidinas como la arginina)

El método se basa en la reacción de coloración en medio básico, de la arginina con

-naftol en presencia de un oxidante. Se desarrolla un color anaranjado.
El mecanismo de la reacción consiste en la unión inicial del -naftol con el grupo
guanidínico de la arginina en presencia de hipobromito de sodio:
OH OH
NH NH2
+ NaBrO + H2N C NH (CH2)3 CH COOH
NH NH 2

naftol Arginina NH C NH (CH2)3 CH COOH + H2O

+ NaBr
Naftilarginina

Luego, por oxidación de naftilarginina se forma un compuesto del tipo

quinonimina.
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En vista de que los derivados de las quinoniminas (en el caso dado de naftoquinonimina), en
los cuales el hidrógeno del grupo imino está sustituido por un radical alquilo o arilo siempre
está coloreado de un tono amarillo-rojizo, por lo visto, el color anaranjado-rojizo de la
solución durante la ejecución de la reacción de SAKAGUCHI, se explica por la formación
precisamente del derivado de naftoquinonimina. No se excluye, sin embargo, la posibilidad
de la formación de un compuesto mucho más complejo como consecuencia de la subsecuente
oxidación de los grupos—NH del residuo guanidínico y del núcleo benzoico del -naftol:

OH O

NH NH2 NH NH2

NH C NH (CH2)3 C COOH + NaBrO N C NH (CH2)3 C COOH + H2O + NaBr

H H

Naftilarginina Naftoquinonimina

Curso de la determinación. En un tubo de ensayo colocan 2 mL de solución 0,01% de

arginina, agregan 2 mL de hidróxido de sodio al 10% y algunas gotas de solución alcohólica
de alfa naftol al 0,2%. Agitan bien el contenido del tubo y añaden 0,5 mL de solución de
hipobromito y nuevamente lo mezclan. Inmediatamente adicionan 1 mL de urea al 40% para
la estabilización de la coloración anaranjado-rojiza que se desarrolla rápidamente.
Prueba de Pauly (característica de la histidina)
El método se basa en la capacidad de la histidina de reaccionar con el ácido
diazobencensulfónico para formar un compuesto de color intenso rojo-guinda. Por
interacción de la solución ácida del ácido sulfanílico con nitrito de sodio se realiza la reacción
de diazotación y se forma el ácido diazobencensulfónico:
Por reacción de este último con histidina se forma el compuesto de color rojo- guinda:
Curso de la determinación. A 1 mL de solución al 1% del ácido sulfanílico en ácido
clorhídrico al 5% le agregan 2 mL de solución de nitrito de potasio al 0,5%. Agitan
fuertemente la mezcla e inmediatamente le añaden, al principio 2 mL de histidina al
0,01% y luego, después de agitar el contenido del tubo, 6 mL de solución de carbonato de
sodio al 10%. La reacción es positiva al aparecer un color rojo intenso, que indica la presencia
de histidina. La tirosina y el triptófano también dan la reacción, aun cuando la sensibilidad
es menor para estos aminoácidos.
SO3- COOH SO3- SO3H COOH SO3H
H2N CH H2N CH
CH2 CH2
N N
+ +
N N + + N N N N N N
NH NH
Histidina 2,5-bis-p-sulfofenilazohistidina
(Color rojo-guinda)
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-
SO3H SO

+ KNO2 + HCl + 2 H2O + KCl

+
NH2 N N

Ácido sulfanílico p-Sulfobenzoldiazonio

(ácido diazobencensulfónico)

Alternativamente, a partes alícuotas de 1 mL de las soluciones problema, patrón (al

1%) y blanco de agua se les añaden 0,3 mL de ácido nítrico concentrado; tras mezclar
bien, colocar en baño de agua hirviendo por cinco minutos para completar la reacción
xantoproteica; añadir luego 1 mL del reactivo de Pauly, tras agitar bien el conjunto añadir
2 mL de carbonato sódico al 15%; después de mezclar bien se observa la aparición de un
intenso color rojo en los tubos con histidina. Con una nitración previa de los aminoácidos
aromáticos se suprime la interferencia, dando reacción positiva sólo con la histidina.

CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son los aminoácidos básicos, ácidos y neutros?
2. ¿Cuáles son los aminoácidos esenciales?
3. ¿Qué aminoácidos dan reacción positiva con el reactivo de Biuret y por qué?
4. ¿En que se fundamentan las reacciones de coloración de los aminoácidos?