Universidad Evangélica de El Salvador, Facultad de Medicina.

Departamento de Microbiología e
Inmunología. Doctorado en Medicina.

INTRODUCCION

Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza y su

presencia puede ser constatada por una variedad de técnicas y procedimientos
empleados en el laboratorio

Este manual para prácticas de laboratorio se abordan los principios y técnicas

básicas indispensables para aislar e identificar los microorganismos mediante el
estudio de sus características morfológicas, tintoriales y metabólicas.

Por lo antes mencionado se debe familiarizar con el uso adecuado de los equipos,
instrumentos y materiales que se emplean como, por ejemplo: el uso del
microscopio, las técnicas de coloración y la siembra por el método de estrías sobre
medios de cultivo sólidos.

El cultivo de un microorganismo se basa en el conocimiento de sus necesidades

nutritivas y físicas. Entendemos por cultivo de microorganismos el proceso que
induce a la multiplicación de ellos. En el laboratorio podemos preparar o seleccionar
medios adecuados a las necesidades de crecimiento de una bacteria.

Un medio puede ser de consistencia líquida, en este caso se denomina caldo, o

consistencia sólida, si se agrega agar al caldo. El agar es un polisacárido, extraído
de algas, que funciona como sustancia solidificante e inerte, ya que no actúa como
elemento nutritivo frente a la gran mayoría de las bacterias. El agar le confiere al
medio una consistencia sólida, o si se agrega en menor cantidad se pueden
preparar medios semisólidos.

Como se clasificación de los medios de cultivo

a. Según la naturaleza de sus ingredientes:

1. Proteicos o naturales: Están constituidos por sustancias complejas de origen

animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y
otras sustancias. Contienen peptona, hidrolizados o extractos que son productos
de la lisis o hidrolisis parcial de proteínas.

2. Sintéticos: No contiene en su formulación productos de naturaleza proteica, se

preparan a partir de ingredientes químicamente puros.

3. Semisintéticos o intermedios: Llevan algunas sustancias químicas cuya

naturaleza y cantidad se conoce, junto con sustancias de naturaleza y
composición indefinida.

Se estudiarán los medios de cultivo sintéticos químicamente definidos.

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Estos medios poseen la ventaja de que se tiene un conocimiento exacto de las

exigencias de nutrición y pH que tiene un microorganismo que será cultivado.

b. Según su consistencia o estado físico los medios de cultivos:

1. Sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les

añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se preparan
añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15g/litro.

2. Líquidos: Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes

disueltos en agua.

3. Semisólidos: Tienen un menor porcentaje de agar, por lo que no solidifican

totalmente a la temperatura ambiente. Se preparan añadiendo un agar a un
medio líquido (caldo) a razón de 7,5 g de agar /litro de caldo

c. Dependiendo del uso para que estén destinados pueden ser:

1. Nutritivos: Permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos,

por ser muy generales, contienen los requerimientos nutricionales mínimos.

2. Enriquecidos: Contienen un medio basal de apoyo al crecimiento, al cual se

le agregan suplementos, como vitaminas, hemina, suero bovino, etc. y están
dirigidos a recuperar bacterias exigentes en requerimientos nutritivos.

3. De enriquecimiento: Son caldos selectivos que contienen un agente que

inhibe la microbiota acompañante y favorece el crecimiento del agente
infeccioso.

4. Selectivos: Presentan algún componente que impide el desarrollo de

microorganismos no deseados. Esto hace que el microorganismo que se
desea cultivar lo haga con mayor facilidad.

5. Diferenciales: Contienen sustancias que ponen de manifiesto alguna

característica de la especie o grupo de microorganismos, logrando
diferenciar géneros y especies

En la actualidad se cuenta con medios deshidratados o medios preparados de

acuerdo con formulaciones reconocidas lo cual no solo facilitan la preparación, sino
que garantiza la estandarización de los mismos, los medios ya preparados deberán
almacenarse en refrigeración para preservarlos de deshidratación y deterioro.
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Preparación de medios de cultivo

Material por instructor:

1. Medios deshidratados
2. Probetas
3. Cocinas eléctricas
4. Frasco Erlenmeyer
5. Baja lengua
6. Papel encerado para pesar
7. Agua destilada
8. Balanza
9. Tubos de vidrio con tapón de rosca y placas de Petri.

Desarrollo

Paso 1. Observar los medios de cultivo deshidratados y observar las cantidades

de preparación para cada uno ya sea sólido o líquido. Debe recordar que los
sólidos llevan el nombre de agar y los medios líquidos llevan el nombre de caldos.

Paso 2. Pesar la cantidad exacta del medio de cultivo según las indicaciones
de la etiqueta del frasco y colocarlo en un frasco Erlenmeyer. (Se realizará un
medio líquido y sólido)
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Paso 3. Agregar el agua destilada requerida, previamente medida en una

probeta.

Paso 4. Disolver, el medio con calentamiento llevando la suspensión hasta

ebullición.

Paso 5. Para medios sólidos:

a. Esterilizar en autoclave (por 15 minutos a 121ºC)
b. Enfriar a 50ºC
c. Verter en placas de Petri estériles, colocando aproximadamente 20 ml
por placa.
d. Tapar parcialmente las placas y después de 5-10 minutos taparlas
totalmente.
a. b. c. d.
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Paso 6. Para medios líquidos, posterior a la ebullición, distribuir en tubos con

tapón de rosca (sin apretar) y esterilizar en autoclave (por 15 minutos a 121ºC)

Paso 7. Hacer prueba de esterilidad de los medios preparados, colocando una

placa o tubo (uno por cada veinte placas o tubos) en la estufa (incubadora) de
37ºC durante 24 horas.
Imagen A: Si hay crecimiento microbiano el medio preparado no es
adecuado,
Imagen B:si no se presentan colonias se ha preparado adecuadamente
.

Técnicas básicas de laboratorio

El profesor hará una demostración de los diferentes medios de cultivo sólidos y
líquidos y su manejo en el área de trabajo.
Se mostrará el flameado del asa bacteriológica y la forma correcta de montar una
preparación al fresco, hacer un frotis microbiano y colorearlo con azul de metileno.
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1. Esterilización del asa bacteriológica

El asa microbiológica es un instrumento de trabajo para la siembra de cultivos
microbianos (bacterias u hongos). Hay tres tipos de asas:
Asa recta o en aguja (para realizar siembra por técnica de punción), asa
bacteriológica o en forma de anillo (la más usada para siembra en medios solidos
bacteriológicos) y asa en L o micológica (para la siembra de hongos).

Asa bacteriológica Asa micológica Asa recta

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2. Siembra por método de estrías.

Se denomina siembra al paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo y
su finalidad de estas técnicas es aislar colonias bacterianas o el mayor número de
bacterias posibles. La técnica de estrías se realiza con un asa bacteriológica, se
toma una muestra de la población y a continuación se hacen estrías sobre la
superficie de un medio sólido preparado en una placa. Conforme se van haciendo
estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio
menos microorganismos

3. Descripción macroscópica de las colonias

Hay ciertos parámetros que se deben tomar en cuenta para describir las colonias
microbianas en los medios sólidos:
 Color  Cantidad
 Elevación  Variedad
 Tamaño  Humedad
 Hemolisis  Bordes
 Forma
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Características macroscópicas de la morfología de las colonias microbianas .

4. Frotis microbiano.
Los frotis son suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos. Se
coloca sobre una lámina portaobjeto una asada de solución salina estéril,
emulsionar en ella una pequeña porción del cultivo. Se deja secar al aire y luego se
fija al calor, pasándolo tres veces por la llama del mechero. A continuación, los
pasos para realizar un frotis:

Colocar 1 - 2 Esterilizar el asa Tomar una Mezclar con la Fijar con cuidado
asadas o gotas de bacteriológica colonia del medio SSN en la lámina y al mechero
SSN estéril en una de cultivo solido extender
lámina en una
placa

MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO O CALDO

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Esterilizar el asa Tomar 1 o 2 asadas Colocar la muestra Fijar con cuidado al
bacteriológica con el asa del caldo en la lámina y mechero
extender

5. Examen al fresco.
Colocar en una lámina portaobjetos, una gota de solución salina estéril, emulsionar
en ella una pequeña porción del cultivo y colocar inmediatamente un cubreobjetos.
Obsérvela al microscopio con los objetivos de 10X y 40X. Anote los resultados. Se
realiza similar al frotis, solo que no se fija al calor y se le coloca una lámina
cubreobjetos.
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6. Coloración simple
Cubra el frotis preparado en el primer numeral, con el colorante azul de metileno,
dejarlo durante un minuto y luego lave con agua. Deje secar al aire y luego
enfoque con el objetivo de 100X en el microscopio. (observar las levaduras e
hifas). Observar el esquema de coloración simple.
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7. Coloración de Gram
Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a
las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram
positivas. Observar esquema de tinción de Gram
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8. Partes y manejo adecuado del microscopio.

MICROSCOPIO

El microscopio compuesto es un instrumento de precisión que consiste en una serie

de lentes diseñados y acomodados para proveer en condiciones óptimas las
amplificaciones máximas posibles, pueden ser de 1,000 a 2,000 veces el tamaño
real del espécimen observado.
El microscopio compuesto ordinario cuenta con una serie de lentes ópticas, partes
mecánicas de ajuste y estructuras de soporte para los diversos componentes.
El buen funcionamiento del microscopio depende del mantenimiento adecuado y del
uso correcto. A continuación, se dan algunas sugerencias útiles:

1. Cuando se transporte el microscopio, se debe tomar el brazo del mismo con una
mano y colocar la otra debajo de la base para sostenerlo manteniéndolo en
posición vertical.
2. Mantener el microscopio por lo menos a 15 cm del borde de la mesa de
laboratorio.
3. No tocar las lentes con los dedos, el sudor contiene ácidos grasos y otras
sustancias que pueden opacar la lente.
4. Para limpiar el sistema óptico, utilice siempre papel para lentes.
5. Limpiar las lentes del microscopio antes y después de usarlo.
6. No permitir que ningún reactivo químico entre en contacto con alguna parte del
microscopio.
7. Quitar el aceite de inmersión del microscopio con papel para lentes.
8. Antes de guardar el microscopio, asegúrese siempre que el objetivo seco débil
(10X) esté en posición de enfoque, es decir, en línea con el cilindro (tubo del
cuerpo).
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Partes del microscopio:

a. Ocular; b. Tubo del cuerpo (cilindro); c. Objetivo seco débil (10X); d. Objetivo Seco fuerte
(40X); e. Objetivo de inmersión (100X); f. Platina; g. Condensador; h. Tornillo del
condensador; i. Palanca del diafragma; j. Tornillo de ajuste grueso (macrométrico); k. Tornillo
de ajuste fino (micrométrico); l. Platina mecánica; m. Pilar.

d
l

e
j

h k

g
i
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9. Descripción microscópica
Posterior a la tinción simple y coloración de Gram
(objetivos 10X, 40 X y 100 X) se observan al microscopio y se realiza la descripción
microscópica.
 Tinción simple: Solo podemos describir morfología y agrupación.
 Tinción de Gram: Se describe morfología, agrupación y Reacción al Gram:
Gram positivo y Gram negativo

Morfología y agrupación de las bacterias

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PRÁCTICA No. 1
DISTRIBUCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE

Los microorganismos se encuentran presentes en gran cantidad y variedad

en la tierra, el aire, el agua y en general en todo el medio ambiente.

La mayoría de los microorganismos son muy buenos agentes de cambio y

por lo tanto se constituyen en elementos sumamente útiles para la vida de
los humanos, animales y plantas sobre la corteza terrestre.

Algunos microorganismos del ambiente sin embargo son capaces de

adaptarse a la vida parasitaria y producir en los seres superiores procesos
infecciosos que bajo determinadas circunstancias dan lugar a las
enfermedades infecciosas.

Otros microorganismos tienen la capacidad de alterar o destruir la materia

animada e inanimada con el consiguiente daño económico que esto
conlleva.

Competencias
Al terminar esta práctica el estudiante identifique:
1. Que los microorganismos están ampliamente diseminados en la naturaleza.
2. A través del estudio macroscópico de las colonias y microscópico de
las células microbianas, la existencia de diferentes tipos de
microorganismos en el ambiente.

Requisitos.
1. Conocimiento sobre los medios de cultivo.
2. Conocimiento sobre los métodos de siembra de los
microorganismos en un medio de cultivo sólido.

3. Conocimiento sobre la técnica de elaboración de un frotis

microbiano
4. Domine el fundamento de la coloración de Gram y la técnica de
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coloración para identificación de microorganismos.

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Material por mesa:

1. 5 placas de agar nutritivo (TSA)

2. Muestras de tierra de jardín, agua de charco, aire, pared y suelo.
3. Un tubo con dos hisopos estériles con solución salina.
4. Asa bacteriológica
5. Láminas portaobjetos.
6. Solución salina 0.85 %
7. Reactivos para coloración de Gram.
8. Microscopios
9. Lápiz graso o marcador
10. Estufa

Desarrollo
PARTE A

El profesor demostrará a los estudiantes como colectar las

diferentes muestras y como inocular y estriar las placas de agar
nutritivo con las mismas:

1. Identificar adecuadamente cada placa (ambiente, nombre, fecha y profesor).

Ejemplo:

Tierra de jardín
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2. Descubrir una placa de agar nutritivo y exponerla al aire por 15 minutos cerrarla,
para la muestra del aire)

3. Sembrar las diferentes muestras colectadas en placas de agar nutritivo

empleando el método de estrías (agua de charco, tierra de Jardín, pared y suelo):

a. Muestra de agua de Charco:

Observar la muestra de agua de charco, y esterilizar un asa bacteriológica,
se toma una asada de la muestra, hay que mezclarlo antes de obtener la
muestra, y luego colocaremos la muestra en la placa de agar rotulada con
agua de charco, y procedemos a realizar los estriados.
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b. Muestra de Tierra de Jardín:

Observar la muestra de tierra, esterilizar un asa bacteriológica y tome
unos cuantos granos de tierra con el asa y colóquelos en la placa de
agar rotulada como tierra de jardín, y procedemos a realizar los
estriados.

c. Muestra de suelo y pared:

Lleva el mismo procedimiento ambas muestras , lo único que cambia es el
sitio de donde se toma la muestra, con un hisopo humedecido con
solución salina tomar una muestra de parte de las paredes del laboratorio
y con otro hisopo tomar muestra de una parte del suelo del laboratorio, al
tener las muestras procedemos a inocularlas en las placas de agar las
cuales estarán rotuladas como pared y la otra como suelo, con el hisopo
depositamos gentilmente sobre una parte del medio de agar la muestra de
pared y en otra placa la del suelo, luego con el asa bacteriológica
previamente estéril procedemos a realizar los estriados.

Pared
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Suelo

4. Incubar todas las placas inoculadas a 37°C por 24 horas, todas deben estar
rotuladas

Parte B
1. Observar el crecimiento en las placas inoculadas en la sesión
anterior y clasificarlas por cantidad.
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2. Anotar las características macroscópicas de los diferentes tipos de colonia

aisladas y clasificadas por variedad; seleccionar una colonia de cada ambiente
para hacer la descripción.

Placa Color Textura Tamaño Humedad Forma Bordes Cantidad Variedad

Agua de
charco

Tierra de
jardín

Suelo

Pared

Aires

3. Posterior a la descripción macroscópica realizar un frotis de las colonias

descritas y colorearlas por el método de Gram

4. Observar al microscopio los frotis coloreados, anotar la morfología y coloración

tomada por los microorganismos.
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Frotis de las placas Morfología Agrupación Reacción al Gram

Agua de charco

Tierra de jardín

Suelo

Pared

Aires

PREGUNTAS

1. ¿En cuál de las muestras estudiadas en esta práctica espera usted encontrar
mayor número de microorganismos? ¿por qué?
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2. ¿Qué factores cree usted que afectarían la cantidad de microorganismos

existentes en el aire?

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3. ¿Escriba el género y especie del microorganismo que frecuentemente se

encuentra en la tierra y realice un dibujo de este?
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