DEPARTAMENTO DE GENÉTICA GRADO DE BIOQUÍMICA

FACULTAD DE BIOLOGÍA FUNDAMENTOS DE GENÉTICA, Curso 2020-21

PRÁCTICA 2: Sistemas de Reparación en levaduras

Introducción
La utilización de mutantes es una de las técnicas más habituales en Genética para
conocer la funcionalidad de las proteínas en los diferentes mecanismos moleculares de
las células. El ADN de las células está continuamente sufriendo daños procedentes de
fuentes internas (metabolismo celular, transcripción, replicación, etc) y de fuentes
externas como radiación, o compuestos químicos en el ambiente. Las células tienen
mecanismos de reparación de daños en el ADN, para evitar las mutaciones que puedan
conllevar deficiencias claves para la supervivencia, y si no son reparados completamentes
pueden conllevar mutaciones no deseadas, o bien la muerte celular.
En el laboratorio usamos métodos de obtención de mutantes basados en la
exposición de la célula a agentes físicos o químicos que interaccionan con el ADN
produciendo cambios en su secuencia. Los agentes químicos pueden actuar produciendo
alteraciones químicas en las bases (p.ej. agentes alquilantes), cambios en el número de
bases (agentes intercalantes) o reemplazando bases (análogos de bases). Entre los
agentes físicos figuran las radiaciones ionizantes, como los rayos X y los rayos gamma, o
radiaciones de menor energía, como la radiación UV.
En esta práctica usaremos la radiación UV como agente externo de daño al ADN.
La simplicidad y menor riesgo en el uso hace de la radiación UV uno de los agentes
mutagénicos más empleados. La radiación UV es aquella con una longitud de onda en el
espectro entre 100 y 400 nm. Los daños producidos por la radiación UV dependen tanto
de la longitud de onda usada (la más eficaz es 260 nm, a la que el ADN muestra su
máxima absorbancia) como de la dosis, que a su vez es función del tiempo de exposición
y de la intensidad de la radiación. Los daños más frecuentes producidos por la radiación
UV son los dímeros de timina, uniones covalentes entre parejas de timinas adyacentes
en la misma cadena de ADN. En caso de no ser reparado, la presencia del dímero bloquea
la replicación y la célula puede superar el problema mediante otros procesos de
replicación menos fieles, lo que ocasiona la inclusión de mutaciones que pueden o no
ser letales. En eucariotas, existen varias vías de reparación de daños en el ADN. El
mecanismo principal para los daños producidos por luz UV es la reparación por escisión
de nucleótidos (Figura 1). En la mayoría de los organismos que viven expuestos a la luz
(aunque no en mamíferos placentarios), existe un mecanismo adicional muy específico
para los daños generados por luz UV que consiste en el reconocimiento de los dímeros
de timina y su reparación por una enzima llamada fotoliasa. Esta enzima usa la luz blanca
como fuente de energía, hecho que tiene una evidente ventaja evolutiva, ya que la fuente
natural de radiación UV es el sol.
Por otro lado, si los daños generados por UV no son reparados y la maquinaria
de replicación del ADN se encuentra con él, se genera roturas de doble cadena en el
ADN, siendo uno de los tipos de daños más difícil de reparar. La recombinación
homóloga lleva a cabo la reparación de rotura de doble cadena (Figura 2). Este proceso
es complejo y requiere de una secuencia homóloga para realizar la reparación de una
forma fiable y libre de errores, y utiliza frecuentemente la cromátida hermana como
secuencia homóloga, por lo que solo ocurre en las fases en la que ha habido replicación
del ADN, es decir, fase S y G2 del ciclo celular, además de en la mitosis.

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Figura 1.
Representación esquemática de la vía
de reparación por escisión de
nucleótidos (NER). En S. cerevisiae, en
este proceso interviene un complejo
proteico compuesto por varias
enzimas, entre las que se encuentra
Rad2, una endonucleasa que lleva a
cabo los cortes en 3’ y que estabiliza los
complejos ADN-proteína
completamente abiertos.

Figura 2.
Representación esquemática de la vía
de reparación por recombinación
homóloga. Varias actividades
enzimáticas intervienen en este
proceso en S. cerevisiae. Entre ellas se
encuentra Rad51, una proteína esencial
para la formación de los filamentos
ADN-proteína.

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Protocolo Práctica I

Día 1

1. El profesor tiene placas de YPD con colonias de la cepa S. cerevisiae silvestre y de las
dos cepas mutantes a la disposición de los alumnos. Cada alumno resuspende una
colonia de cada estirpe en 0.5 ml de agua estéril. A partir de estas suspensiones, se
realizan diluciones seriadas aplicando los factores de dilución de 10-1, 10-2 y 10-3.

2. Depositar una gota (3 µl) de cada uno de los tubos de dilución en 3 cajas de YPD según
el esquema siguiente y dejar que las gotas se sequen completamente.

3. Irradiar dos de las cajas de YPD durante 1 minuto con luz UV. Posteriormente poner 1
caja en la oscuridad rápidamente, y otra dejarla a la luz. La caja que queda no se irradia
y será la placa control.

4. Incubar durante dos días a 30°C.

Día 2

5. Análisis de resultados y discusión: Observar la presencia o ausencia de crecimiento de

las distintas cepas en las tres cajas.

Objetivos

• Observar en el modelo genético de levaduras el efecto de la radiación UV y la

existencia de un mecanismo de reparación mediado por Rad2 y de otro
dependiente de luz.
• Evaluar el impacto del mecanismo de reparación por recombinación homóloga
con mutante de Rad51 sobre daños generados por luz UV.

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Material

S. cerevisiae BY4741 Silvestre

S. cerevisiae YGR258C rad2∆
S. cerevisiae YER095W rad51∆

Tubos de microcentrífuga estériles

Agua destilada estéril
Placas de YPD e YPD-CPT
Irradiador de luz UV