FACULTAD DE CIENCIAS

DPTO. ACAD. BIOLOGÍA, MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA

PRÁCTICA:

CURVA DE SUPERVIVENCIA DE LAS BACTERIAS FRENTE A LA

IRRADIACIÓN ULTRAVIOLETA

I. INTRODUCCIÓN

Una problemática grave para los seres vivos es la radiación ultravioleta (RUV), que llega
a la superficie terrestre, en su mayor parte es la UV-A (315-400 nm), y pequeñas
cantidades de UV-B (280-315 nm) y UV-C (200-280 nm) (Björn, 2008), los cuales
pueden liberar energía más que suficiente para romper enlaces químicos moleculares
(Hall y Giaccia, 2012). Sin duda, es un problema muy grave, ya que la radiación de tipo
UV-B y UV-C es absorbido directamente por el ADN, dando lugar a una alteración
física en su estructura molecular y ocasionando cáncer (Paulino-Lima et al., 2016).

La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de o nda.

Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas moléculas
biológicas:

 Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm,
debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a
los enlaces peptídicos.
 El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones
4 y 5 de las bases púricas y pirimidínicas.

Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las
moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas
genéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de
macromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para
paliar o eliminar estas modificacione s potencialmente lesivas.

Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad,

ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se pueden
volver a sintetizar. En cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene
efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de
acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).

FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV

Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de

alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina):

a. dímeros de pirimidina (anillo ciclobutano)

b. fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)
c. hidratos de pirimidina
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Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células
vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también se
producen T-C y C-C. Se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en
la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de ciclobutano. Su efecto
principal es la distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el
normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una
interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el
crecimiento y la respiración.

A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas de las dos
cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente
afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de daños reviste menos
significación biológica.

El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. También se forma en la

endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratación, pudiendo ejercer igualmente
efectos inactivantes.

Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis

de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de transiciones
T=A a C=G.

MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS

Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los seres
vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse
con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos
hallados en bacterias se pueden agrupar así:

1. Mecanismos prerreplicativos:

a) reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación

directa del daño en sí
b) reparación por escisión y resíntesis

2. Mecanismos posreplicativos:

a) reparación por recombinación

b) reparación inducible de emergencia (SOS)

Reparación fotoenzimática

Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante,

que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparan
directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-
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500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos prostéticos
coloreados (cromóforos):

 flavina reducida (FADH2)

 una pterina.

Mecanismo

1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce

el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz (l =300-500), se
excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina,
rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.

Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación, no está
claro cuál es su papel exacto.

No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la fotorreparación

está muy extendida entre eucariotas.

La luz UV a nivel de laboratorio, se utiliza para producir mutaciones en los

microorganismos. El efecto principal de las radiaciones UV es originar mutaciones que
suelen ocurrir durante la replicación del DNA, que mata rápidamente a las células y entre
los sobrevivientes se encuentra una elevada frecuencia de mutaciones. Estas mutaciones
ocurren por la formación de dímeros de pirimidina intracatenarios, siendo las
proporciones de lesiones en un 50 % de T -T, 40 % T-C y 10 % C-C. Estos productos más
importantes de la acción de la luz UV se forman debido a las bases pirimidinicas
adyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante la replicación
del ADN, la DNA polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en tal posición.

OBJETIVOS:

1. Determinar la curva de supervivencia a la irradiación UV que presenta

Escherichia coli en fase logarítmica media.
2. Determinar el tiempo en que se obtiene el 0,1% de sobrevivientes, usado para el
aislamiento de mutantes.

II. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

2.1. Material biológico:

1. Cultivo de Escherichia coli en fase logarítmica media.
2.2. Material y Equipo de laboratorio:
 Placas Petri
 Tubos de ensayo de 13 x 100 mL
 Pipetas de 1, 5 y 10 mL
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 Centrífuga
 Lámpara de luz UV (30Watts)
 Buffer Fosfato 0,2M pH 7.2
 Solución yodada
 Tubo Nº 1 del nefelómetro de Mc Farland
 Balanza de dos brazos
 Bolsas oscuras

2.3 Medios de cultivo:

 Agar nutritivo.
 Caldo nutritivo

2.4Procedimiento:
 Hacer una suspensión de 15 ml en SSF de la bacteria, en fase log media
equivalente al tubo Nro. 3 del Nefelómetro de Mac Farland.
 Centrifugar el cultivo de E. coli a 4500 rpm por 15 minutos.
 Eliminar el sobrenadante y resuspender en 15 mL de buffer fosfato y volver a
centrifugar.
 Eliminar el sobrenadante y resuspender en 15 mL de buffer fosfato a la
concentración del tubo N° 1 del nefelómetro de Mac Farland.
 De la suspensión anterior colocar 1.5 mL en 9 placas estériles y llevar a la fuente
de luz UV, a los tiempos que se indica en la tabla, con una potencia de 30 Watts
y a 44cm de distancia. Irradiar las placas.
 A las placas irradiadas se harán recuento de UFC por el método de incorporación
en agar nutritivo de acuerdo al siguiente esquema:

Placa Tiempo irradiación Diluciones

1 0 seg 10-7 10-8
2 10 seg 10-6 10-7
3 20 seg 10-5 10-6
4 30 seg 10-4 10-5
5 35 seg 10-3 10-4
6 40 seg 10-2 10-3
7 45 seg 10-2 10-3
8 50 seg 10-1 10-2
9 55 seg 10-1 10-2

3 Con los datos obtenidos en un mismo papel milimetrado construir la curva de

sobrevivientes y la curva de muerte experimental y corregida. Establecer la velocidad
de muerte. El Nro. de generaciones de muerte en 10 segundos. Tiempo de generación
de muerte.
4 Con dichas curvas, determinar el tiempo necesario para obtener el 0,1% de
supervivencia de la población bacteriana en estudio.

III. RESULTADOS
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Parámetro Valor con sus unidades

0.1% sobrevivientes
99.9% de muerte
Velocidad de muerte
Tiempo de generación de muerte
Nro. Generaciones de muerte en 10 seg.

IV. CUESTIONARIO

1. Comente sus resultados

2. Esquematice el fenómeno de mutación por UV y la posterior fotorreactivación.
3. ¿Qué otros mecanismos de reparación existen en las bacterias para sobrevivir a un
daño genético?

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Björn L. (2008). Photobiology: The Science of Light and Life, Springer, New
York.
1. Brock, D.; T. Madigan. MICROBIOLOGÍA. 6ta. ed. Edit. Prentice Hall
Hispanoamericana, S.A. México D. F. México. 1993.
2. Hall E.J. y Giaccia A.J. (2012). Fractionated radiation and the dose-rate effect.
Radiobiology for the Radiologist, 67-85.
3. Madigan, M. y cols. BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. 10ma. ed.
Edit. Pearson Prentice Hall S.A. Madrid. España 2006.
4. Merino, F. Y col. GUÍA PRÁCTICA DE FISIOLOGÍA MICROBIANA. Dpto.
Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Lima, Perú. 1985.
5. Mims, C. y J. Playfar. MICROBIOLOGIA MÉDICA. 2da. Ed. Edit. Hartcourt
Brace. Barcelona España. 1999.
6. Paulino-Lima I. G., Azua-Bustos A., Vicuña R., González-Silva C., Salas L.,
Teixeira, L., Rosado A., da Costa A.A. y Lage, C. (2013). Isolation of UVC-
tolerant bacteria from the hyperarid Atacama Desert, Chile. Microbial ecology,
65(2), 325-335.
7. Pelczar, M.; R. Reid y E. Chang. MICROBIOLOGÍA. 4ta ed. Edit. McGraw Hill.
México D. F. México. 1982.