Resumen Inmuno

Tema 1:Conceptos básicos de Biología Molecular I Estructura y Función de

ácidos nucleicos.

Ácidos Nucleicos:¡biomoléculas increíbles!

• La capacidad más remarcable de las células y los organismos vivos es su capacidad de
reproducirse con fidelidad casi perfecta a lo largo de incontables generaciones.
• Esta continuidad de rasgos heredados indica que a lo largo de los miles de millones de años,
la estructura de las moléculas que contienen la información genética han permanecido
constantes.
• Pocas huellas históricas de la civilización han sobrevivido un millón de años.
• Muchas bacterias tienen aproximadamente la misma forma, tamaño, estructura interna y
mecanismos enzimáticos, que las que vivieron hace mil millones de años.

Un poco de historia:
• 1928 Grifith descubre un factor o principio transformante
• 1944 Avery, MacLeod y McCarthy descubren que el ADN es el factor transformante.
• 1950 Chargaff enuncia las “Leyes de Chargaff” las cuales indican que un organismo dado
tendrá la misma composición de ADN en todas sus células, que diferentes especies tienen
diferente composición de ADN y el numero de residuos de adenina es igual al de timina en
todas las especies y lo mismo sucede con los residuos de citocina y guanina.
• 1952 Hershey y Chase realizaron un experimento con bacteriófagos marcados
radiactivamente, donde demostraron que el ADN marcado con 32P era la molécula que
ingresaba a la célula y reproducía la progenie viral y no las proteínas marcadas con 35S.•
1950-53 Franklin toma la primera imagen por cristalografía de rayos x de una molécula de
ADN.
• 1953 Watson y Crick postulan el modelo que conocemos de la molécula de ADN

Principio o Factor Transformante de Griffith 1928

Ácidos nucleicos
Constituyen el material genético de los organismos (tienen carga negativa neta por
hidrolización del grupo fosfato). Son necesarios para el almacenamiento y la expresión de la
información genética. Existen dos tipos de ácidos nucleicos química y estructuralmente
distintos, ambos se encuentran en todas las células procariotas,eucariotas y virus:
- El ácido desoxirribonucleico (ADN): se encarga del almacenamiento de la información
genética, y se localiza en: los cromosomas del núcleo, mitocondrias y cloroplastos de las
células eucariotas. Único cromosoma y plásmidos en células procariotas. Virus ADN.
Formado por A, G, T y C
- El ácido ribonucleico (ARN): se encarga de la transferencia y expresión de la
información contenida en el ADN hacia los compartimentos celulares. LOCALIZACIÓN:
Núcleo, citoplasma, matriz mitocondrial y el estroma de cloroplastos de células eucariotas.
Citosol de células procariotas. Virus ARN.
Formado por A, G, C y U

Funciones:
- Replicación:La información genética se transfiere de una célula a otra.
- Transcripción: Expresar la información contenida en el material genético. -
- Traducción: Síntesis de una proteína a partir de la información genética usando como
molde ARNm

Estructura de células procariotas y eucariotas

En las células eucariotas el material genético está envuelto por una membrana que está en
el núcleo. Membrana con poros por lo que está compartimentalizado dentro de la célula,
dentro del núcleo está el ADN (formando cromatina) y un nucleolo que tiene ARN y ADN.
En las células procariotas no hay membrana nuclear ni núcleo formado. El ADN lo
encontramos en el núcleoide, y formando plásmidos (fragmentos de ADN más pequeños) que
están en el citosol.

Composición de ácidos nucleicos:

- Base nitrogenada: purina o pirimidina (siempre vamos a tener la misma cantidad de
ambas)
- Pentosa: Ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN)
- Grupo fosfato
Bases Nitrogenadas:
- Purinas (9 átomos): Adenina y Guanina

- Pirimidinas (6 átomos): Citosina, Timina y Uracilo

A + T (unidos por dos enlaces de Hidrógeno)

G + C (unidos por 3 enlaces de Hidrógeno)

Se sintetizan en el hígado. las purinas se sintetizan ya asociadas a un ribosoma fosfato.Las

pirimidinas se sintetizan solas.
Se utilizan para sintetizar nuevas moléculas de ADN o ARN.

Un NUCLEÓTIDO se forma con la unión de una base

nitrogenada, una pentosa y un grupo fosfato. Estos son las
unidades que componen los ácidos nucleicos
Los nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster para
dar lugar a cadenas de polinucleótidos o ácidos nucleicos.
Por convención las cadenas de polinucleótidos se leen de 5’ a
3’
El grupo fosfato se une al carbono 5´. Siempre el nuevo
nucleótido se va a unir al carbono 3´de la ribosa con el grupo fosfato.
Las cadenas de polinucleótidos siempre van a tener un extremo 5 ́ donde está el fosfato libre,
y un extremo 3´que es donde se siguen uniendo los nucleótidos.

ADN
Estructura del ADN
Estructura primaria:Está dada por la secuencia de nucleótidos que la conforman. La
información genética está contenida en el orden exacto de las bases nitrogenadas.
5’ATGCCGTAAGCTATTTCG3’
Estructura secundaria: En las células eucariotas el ADN se encuentra formando una cadena
doble de polidesoxirribonucleótidos.
- Es antiparalela: el extremo 5’ de una cadena se asocia con el
extremo 3’ de la otra
- complementaria:Adenina-Timina (2 puentes de Hidrógeno) y Guanina-Citosina (3
puentes de Hidrógeno)
- forma un giro helicoidal dextrógiro (formas A y B) o levógiro (forma Z)

Doble hélice de ADN

La forma B de ADN es la más conocida. Fue descrita por Watson y Crick en 1953 basada en
las cristalografías de rayos X tomadas por Franklin y Wilkins.
B DNA predomina en cromosomas, giro de medida específica que va a formar un surco mayor
y uno menor (es fisiológico)
A DNA In vitro,forma B deshidratada, con más acceso a bases nitrogenadas
Z DNA función de regulación de expresión. Zonas ricas en GC; es fisiológico, no patológico.

ADN circular
El ADN mitocondrial y el de células procariotas se
encuentran en forma de molécula circular, sin
extremos, donde no hay interrupción de los enlaces
fosfodiéster. Puede estar en una estructura relajada, o
superenrollada.
Gracias a las enzimas topoisomerasas que provocan
cortes en las hebras para que se puedan seguir
enrollando.

Empaquetamiento del ADN eucariota

El ADN se asocia a nucleoproteínas (histonas y no-histonas) para formar la cromatina y dar
origen a los cromosomas.
Niveles de empaquetamiento= Nucleosoma-Solenoide-Cromatina-Asas
cromáticas-Cromosoma
Nucleosoma: Histonas (carga +) + ADN (carga -)
Dos moléculas de Histonas H2A, H2B, H3 y H4 se unen para formar un Octámero de
Histonas; un segmento de ADN de doble cadena (146pb) se enrolla dando 1,6 vueltas al
octámero formando lo que se llama Nucleosoma.
Varios fragmentos de ADN + varios octámeros= cadena de nucleosomas (conocida como
collar de perlas)
Entre medio de los nucleosomas queda un espacio de 56pb llamado ADN linker.
La función del nucleosoma es condensar el ADN en una fibra de 11nm que se parece al “collar
de perlas”, en donde cada nucleosoma sería una perla y el ADN linker el cordón que las une.
El ADN linker se asocia a una histona H1 y ayuda al empaquetamiento, facilitando la
formación de una estructura llamada Solenoide.
Solenoide: Los nucleosomas se compactan para formar un poli-nucleosoma de 6 unidades,
mediante la interacción entre H1 y los nucleosomas, lo que genera esta estructura compacta
llamada Solenoide, que a su vez va a formar una hebra de 30nm llamada Cromatina
Cromatina: ADN compactado 100 veces; puede encontrarse de forma transcripcionalmente
activa (en donde se descompacta), llamada Eucromatina; y de forma transcripcionalmente
inactiva (compacta), llamada Heterocromatina.
Asas Cromáticas: Cromatinas plegadas y más condensadas, formando asas amplias super
enrrolladas que se anclan sobre proteínas de anclaje (300nm)
Cromosoma: Asas cromáticas compactadas (700nm)

Desnaturalización y renaturalización del ADN:

• La desnaturalización es la pérdida de la estructura helicoidal (estructura secundaria). Ocurre
por la rotura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas. Puede ocurrir por:
• exposición a agentes químicos (urea, formaldehido, formamida), físicos (calor) cambios de
pH y enzimas.
• Temperatura: el calentamiento gradual del ADN hasta llegar a los 100°c desestabiliza la
doble hélice y se desenrolla hasta separarse totalmente las 2 hebras de ADN. La temperatura
de fusión Tm se define como la temperatura necesaria para desnaturalizar el 50% de una
molécula de ADN . Una molécula con alto contenido de GC (3 puentes de H) necesitará mayor
temperatura para desnaturalizarse que una con alto contenido de AT(2 puentes de H)
ARN
El ARN es el ácido nucleico más abundante dentro de la célula eucariota. Hay 3
características que lo diferencian del ADN:
- El ARN suele ser monocatenario.
- Contiene Uracilo en lugar de Timina
- Contiene ribosa en lugar de desoxirribosa (lo cual lo hace una molécula más inestable)

Estructura del ARN

- Estructura primaria: secuencia de nucleótidos. Sentido 5’-3’.
- Estructura secundaria: asociación intra o intercatenaria (apareamiento de secuencias
complementarias entre la misma cadena de ARN); virus ARN doble cadena. Formación de
horquillas y loops (Parte de la cadena de ARN es complementaria y origina puentes de
hidrógeno con la no complementaria; Asa de bases que no se unen, como G y G).
“La complementariedad ocasional de bases en el ARN da origen a las estructuras de pasador
(hairpin), formaciones típicas, en las cuales parte de la cadena de ARN es complementaria y
origina puentes de hidrógeno entre ésta y la parte no complementaria dando origen a un loop”
- Estructura terciaria: Algunos tipos de ARN como los ARNt poseen estructuras terciarias
más complejas relacionadas con sus funciones.
Estructura terciaria de ARNt

Tipos de ARN
- ARN heterogéneo nuclear o transcripto primario (ARNhn).
Es el producto inicial de la síntesis de la ARN polimerasa en el proceso de transcripción.En el
núcleo de las células eucariotas actúa como precursor de los demás tipos de ARN
- ARN mensajero (ARNm).
Sirve de molde para la síntesis de proteínas en el proceso de traducción, ya que contiene la
información génica para la formación de uno o varios polipéptidos. Contiene, además, las
señales necesarias para el inicio y la terminación de la traducción.
- ARN ribosomal (ARNr).
Forma parte de los ribosomas y participa en el proceso de síntesis proteica.
- ARN de transferencia (ARNt)
Intervienen en la síntesis de proteínas
- ARN pequeño nuclear.
Forma las riboproteínas pequeñas nucleares que se encargan de la maduración del ARNhn.
Ribozimas.

Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son los depositarios moleculares de la INFORMACIÓN
GENÉTICA. La estructura de cada una de las proteínas y de cada uno de los componentes
celulares, es producto de la INFORMACIÓN programada en la secuencia de nucleótidos de
los ácidos nucleicos.
La existencia de cualquier especie requiere el mantenimiento de su información genética de
una forma estable y a la vez que esta información genética se exprese con el mínimo de
errores.El almacenamiento y expresión del mensaje genético define a las especies
individuales, permite distinguirlas entre ellas y asegura su continuidad a lo largo de las
sucesivas generaciones.
Funciones:
- Replicación:La información genética se transfiere de una célula a otra.
- Transcripción: Expresar la información contenida en el material genético. -
- Traducción: Síntesis de una proteína a partir de la información genética usando como
molde ARNm
-
Dogma central de la biología molecular
Replicación del ADN
Su objetivo es conservar la información genética y transferirla a las células hijas.
Una molécula de ADN dará origen a dos idénticas. Las dos hebras deberán separarse y
mediante una enzima se crearán nuevas hebras de ADN complementarias a las originales.

Características:
- Semiconservativa: Cada nueva molécula de ADN formada contendrá una hebra del
ADN original y una hebra nueva sintetizada.. •
- Bidireccional: se forman horquillas de replicación. Multifocales en eucariotas y
monofocales en procariotas.
- Discontinua: Hebra lider y hebra retrasada. Se copia en pequeños fragmentos de
Okazaki siempre en sentido 5’-3 y luego se unen.

Proteínas que participan en la replicación:

Diferencias en la replicación entre procariotas y eucariotas

¿Qué son las mutaciones?
Una mutación es un cambio en la secuencia del ADN. Las mutaciones pueden ser el resultado
de errores en la copia del ADN durante la división celular, la exposición a radiaciones
ionizantes o sustancias químicas denominadas mutágenos, o infección por virus.

Transcripcion del ADN

Es el primer paso para expresar la información contenida en el material genético. Se sintetiza
una cadena de ARN complementaria y antiparalela a una de ADN llamada hebra molde. Este
ARN es idéntico a la hebra codificante. La secuencia de ADN que se copia se denomina gen.
La transcripción tiene tres etapas:
- Iniciación
- Elongación
- Terminación

¿Qué es un Gen?
Las secuencias de ADN que se copian en cada proceso de transcripción se denominan
GENES
- GEN:Secuencia lineal de nucleótidos, en la molécula de ADN, que contiene la
información necesaria para la síntesis de una molécula de ARN funcional. (ARNm, ARNt,
ARNr)
Los genes en procariotas están organizados en operones, esto es, un conjunto de genes
situados en el mismo fragmento de ADN que se transcriben como una unidad y que generan
varios productos funcionales que participan de una vía metabólica común.
(POLICISTRÓNICO). En eucariotas generalmente se transcribe un solo producto génico con
mayor complejidad en su regulación. (MONOCISTRÓNICO)

-Reconocimiento de un sitio promotor.

-Regulación de expresión génica. Potenciadores y
silenciadores.
-Cadena codificante y hebra molde.
-Reconoce el sitio de finalización. Región rica en GC
El reconocimiento del ARN polimerasa del sitio promotor hace que comience la transcripción.
La regulación de esa expresión genética está dada por sitios que se encuentran potencia
arriba que son POTENCIADORES Y SILENCIADORES que permiten que determinado gen se
transcriba en un momento dado del ciclo celular. ARN polimerasa se va a unir porque la
helicasa separa las hebras, ARN polimerasa copia el molde de ADN. ARN complementario o
hebra molde, iguales a hebra codificante (que no se copia), sólo que en lugar de Timina tiene
Uracilo. Reconoce el sitio de finalización, región rica en GC y se libera el ARN copia del ADN.

Maduración ARN: en eucariotas es necesario un proceso de maduración de ARNhn para

tener ARNm funcional.
- Adición de la caperuza 5´(agrego una G en el extremo 5´)
- Modificación 3´poliA (agrego cola, muchas A unidas)
- Corte y empalme (splicing): Elimino todos los intrones (parte de ADN que no tiene una
secuencia que forme parte de la proteína)
En procariotas el ADN no tiene intrones y exones, solo tiene secuencias codificantes (+ fácil).
Los ribosomas se unen al ARNm empezando a producir la proteína.

Traducción del ADN

Es la síntesis de proteínas de acuerdo a la información genética codificada en el ADN y se
emplea como molde de una molécula de ARNm. Interpreta la información contenida en el gen
utilizando un código genético. El mensaje se “decodifica” leyendo el ARNm de 5’ a 3’.
El proceso de traducción incorpora 20 aminoácidos diferentes en la secuencia precisa dictada
por los codones de tres bases constituidos a partir de un alfabeto de 4 bases. El proceso en el
ribosoma constituye las cadenas de polipéptidos que se convertirán en proteínas.

Código genético: secuencia de bases nitrogenadas que tengo

- Es específico y continuo. Los codones tienen un significado único.
 - Degenerado. Redundante. Hay aminoácidos codificados por más de un codón.
- Casi universal. Muy pocas excepciones en mitocondrias humanas, otros mamíferos y
algunas bacterias.
3 bases nitrogenadas=codón, cada 3 va leyendo el ribosoma y determina cual es el aá que
debe colocar. Esto sucede en el citosol (procariotas) y RER (eucariotas)
Stop: donde termina la proteína, la traducción

Tema 3: Bases de las técnicas de Biología Molecular para detección de

ácidos nucleicos I y II

Extracción de ácidos nucleicos

Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
LAMP
RFLP-PCR
PCR en tiempo real
PCR digital
Secuenciación

Métodos de extracción de ácidos nucleicos.

Casi todas las técnicas de biología molecular necesitan un paso previo de extracción de los
ácidos nucleicos a estudiar. El método de extracción utilizado dependerá del agente que se
busque, tipo de muestra a utilizar, de la técnica en la cual serán analizados, de la complejidad
del laboratorio, los recursos económicos y el tiempo del que se disponga.
Los grupos fosfatos de los nucleótidos están cargados negativamente y son polares, lo que le
confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son
aprovechadas para su extracción.
Métodos tradicionales:
Utilizan solventes orgánicos (Fenol-cloroformo) para separar las proteínas del ADN y, una vez
suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol.
En métodos tradicionales cuando tenemos la mezcla de fenol-cloroformo se quedan 2 fases
(en fase orgánica quedan las proteínas y en fase acuosa quedan los ácidos nucleicos).
Separo por pipeteo la parte orgánica de la acuosa, y por centrifugación me quedo con el ADN
con el agregado de alcohol, el cual lo deshidrata y hace que precipite (me queda solo el ADN
en el fondo).Luego de que evaporó, resuspendo el ADN con agua o Buffer y así lo conservo.
Muy poco utilizado porque los solventes orgánicos son tóxicos.

Métodos comerciales:
Utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente (membranas de silice o
perlas magnéticas) capaces de retener el ADN y separarlo del resto de las biomoléculas,
permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores.
Los métodos de extracción comerciales están automatizados mediante el uso de kits y
extractores automáticos robotizados.Con mínima intervención de operadores permiten mejorar
la precisión, obtener resultados reproducibles y reducir el tiempo de extracción para un gran
número de muestras.

En métodos comerciales tenemos membrana de sílice que está colocada dentro de un

microtubo, está cargada positivamente. Al colocar mi muestra queda retenido el ADN o ARN
en la membrana, y el resto de proteínas y lípidos que no tienen afinidad por la membrana se
filtran a través de ella. Con el agregado de diferentes soluciones de lavado todo lo que no es
ácido nucleico pasa la membrana una vez que lo centrífugo.
Coloco un buffer con pH adecuado para liberar el ADN de la membrana.
Perlas magnéticas: perlas con centro de metal rodeadas por una matriz cargada
positivamente. A estas perlas se les pegan los ácidos nucleicos. Metodología similar al de
columnas pero con ayuda de imanes o magneto, separo las perlas cubiertas de ácidos
nucleicos del resto de líquidos del medio y con buffer de lavado separo todo lo que no son
ácidos nucleicos y con un buffer dilución libero los ácidos nucleicos para que queden solos.
Tanto los métodos tradicionales, como los comerciales, requieren de un paso previo, la lisis
celular. Para esto uso detergentes, agentes caotrópicos, para romper las células y liberar los
ácidos nucleicos.

Etapas de los métodos:

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

La PCR se basa en la replicación celular del ADN, en la que actúan varias proteínas para
sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde.
La síntesis de nuevas cadenas de ADN se lleva a cabo mezclando:
- el ADN que contiene el o los fragmentos que se van a amplificar
- la ADN polimerasa
- los cebadores (fragmento de ADN de 15-30 nucleótidos que flanquean la región a
amplificar y que aportan el extremo 3’ libre para que inicie la transcripción)
- desoxiribonucleotidos (dNTPs)
- cloruro de magnesio (MgCl2) u otro co-factor necesario para que trabaje la polimerasa
- y una solución amortiguadora que mantenga el pH apropiado para que se lleve a cabo
la síntesis
En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular. Esta mezcla se
somete a la repetición de varios ciclos a diferentes temperaturas (ciclo de PCR) que sustituye
a la mayoría de las proteínas que actúan en la replicación celular.
Los cebadores serán los responsables de la especificidad de nuestra PCR,
El sitio blanco que se elija amplificar deberá ser lo más específico posible del agente que
queremos detectar. Se utilizan 2 cebadores para amplificar un fragmento de ADN, uno para
cada hebra de ADN. En el diseño de los cebadores debemos tener en cuenta el largo de los
mismo, el porcentaje de bases G y C, ya que esto modificara su Tm y evitar la
complementariedad entre ellos para que no se formen dímeros de
cebadores.

“La hebra original del ADN sufre un proceso de desnaturalización por calor, caliento la
muestra a 90°C para que se separen las hebras y allí los cebadores que puse, si encuentran
una región complementaria, van a unirse cuando alcancen la temperatura de hibridación (se
pega el primer con la cadena molde). Luego cambio la temperatura para que la ADN
polimerasa pueda copiar ese molde y generar una nueva cadena. Estos ciclos se repiten
(desnaturalización, hibridación, amplificación), en el 2do ciclo tengo 4 copias, y así
exponencialmente por 20-30 ciclos.”

Etapas de la PCR
Desnaturalización: Se rompen los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias
exponiendo las 2 hebras de ADN (a 90-95º)
Hibridación: Los cebadores hibridan con el sitio blanco. A una temperatura que va a depender
del par de cebadores que tengo (% GC, largo del primer, etc); unión de ADN blanco y el
cebador (complementarios)

Extensión: La ADN polimerasa sintetiza la nueva hebra de ADN agregando dNTPs.

Temperatura a la que la ADN polimerasa copia la hebra (72°C); paso de 2 a 4

¿Cómo vemos el resultado de nuestra PCR?

Electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es
un polímero que se utiliza para hacer migrar
moléculas de ADN sometidas a un campo
eléctrico. Aprovechando la carga negativa del
ADN se someten los productos de PCR a una
corriente eléctrica y ellos migran dentro de la
agarosa hacia el polo positivo. Utilizando agentes
intercalantes del ADN como el bromuro de etidio
o el gel red se visualizan las bandas de ADN bajo
luz ultravioleta
Los productos de la PCR se llaman Amplicones y los veo al colocar la muestra en gel de
agarosa luego de la migración del ADN del polo - al +.
Fondo negro del gel, detecto presencia de bandas.
Mido la longitud de la molécula de ácido nucleico según la cantidad de pares de bases (pb)
M: marcador de peso molecular que tiene bandas conocidas de diferentes pesos moleculares.
No tiene automatización, es a ojo.
Bromuro de etidio: cancerígeno. Este proceso se usa en el laboratorio de investigación;
detecto presencia o ausencia, es una técnica cualitativa.

Factores que afectan la sensibilidad y especificidad de la PCR

- Diseño de Primers: Complementariedad con otras regiones del genoma.
- Temperatura de hibridación: A > Temperatura > especificidad
- Concentración de cofactores: Cuanto > es la concentración de Mg > es la tasa de
replicación.

Variaciones de la PCR
PCR anidada: Es más sensible ya que aumenta el número de moléculas de
ADN molde antes de amplificar el segmento específico.
Tiene 2 pares de primers. Un par externo que amplifica como en la PCR común y un par
interno que se pega dentro del primer fragmento y copia un fragmento más interno (unido al
amplicón).
2 porciones amplificadas, una más grande, del segmento externo, en la primera reacción, y
una más chica, del segmento interno en la segunda reacción.
Más sensible porque lo que quiero copiar lo amplifico primero por los primers externos y más
específica por si tengo patógenos similares que puedan reaccionar ambos (gracias al primer
interno)
PCR multiplex: Tengo varios pares de primers para buscar cosas diferentes, los mezclo con mi
ADN molde de la muestra y veo cuál de ellos amplifica según la cantidad de pares de bases,
por la altura a la que quedan.
Rt PCR (retrotranscripción): Uso como molde ARNm, la retrotranscriptasa lo copia a una
molécula de ADN copia, hago PCR común con ADN polimerasa termoestable y sigo
amplificando (ej: COVID, Virus ARN)
Técnicas de amplificación isotérmica
LAMP
La efectividad de LAMP se basa en el diseño de cebadores que deben ser muy específicos.
Requiere de 4 a 6 cebadores. El método utiliza una ADN polimerasa con actividad de
desplazamiento de cadena. No requiere el paso de desnaturalización de la PCR convencional
(90°C). Es isotérmica, es decir la reacción ocurre a una misma temperatura 60°C en forma
continua, lo que es una importante ventaja sobre PCR tradicional. Tiene una alta eficiencia de
amplificación: ADN se amplifica 109 – 1010 veces en 15 a 75 minutos; y una de sus grandes
ventajas está relacionado con la mayor tolerancia a inhibidores.

Propiedades del método:

- Simplicidad: Amplificación isotérmica en un solo paso. Detección visual de productos
amplificados
- Rapidez: resultados de las pruebas entre 15-60 min
- Especificidad: Uso de 4 cebadores que reconoces 6 regiones distintas del ADN blanco;
Amplificación- resultados positivos de la prueba
- Rentabilidad: No requiere ningún reactivo especial ni equipo sofisticado
- Productos amplificados: Cantidad extremadamente grande (109-1010 veces dentro de
15 a 60 min) Diversos tamaños de las estructuras de repeticiones invertidas de forma alterna
de la secuencia diana de la misma cadena
- Amplificación del ARN: Amplificación isotérmica del ARN en un solo paso con solo
añadir la transcriptasa inversa

Ventajas y desventajas de PCR Y LAMP

LAMP:
- Bajo costo
- Rápida (1 hora aprox)
- No requiere instrumental costoso
- Se revela por cambio de color o turbidez
- No se puede analizar más de un blanco a la vez
- No permite utilizar control interno
- No puedo distinguir si se amplifica el blanco específico o algo inespecífico.
PCR:
- Costo regular
- Requiere entre 3 a 4 horas
- Requiere termociclador
- Requiere paso posterior de análisis
- Permite analizar diferentes blancos con productos de diferente tamaño
- Se puede colocar un control interno de la muestra
- Permite utilizar el fragmento amplificado para otros estudios.
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
RFLP– PCR
Los fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLPs) son un tipo de polimorfismo que
resulta de la variación en la secuencia de ADN reconocida por las enzimas de restricción.
Estas son enzimas bacterianas que se utilizan para cortar moléculas de ADN en lugares
conocidos. Este método es útil para detectar pequeñas inserciones o deleciones en
determinados fragmentos de restricción de un gen, ya que el tamaño de los mismos se verá
aumentado o disminuido, respectivamente. En otros casos, ciertas mutaciones puntuales en
un gen, que alteran la secuencia de nucleótidos del mismo, pueden crear nuevos sitios de
restricción o hacer desaparecer aquellos presentes en el gen normal, lo que altera el patrón
de los fragmentos de restricción observables en electroforesis.

PCR en tiempo real o cuantitativa

QPCR
Se basa en el mismo principio que la técnica de PCR pero unifica la amplificación con la
detección del producto en el mismo paso al correlacionar los productos de PCR de cada ciclo
con una señal de intensidad de fluorescencia. Tiene mayor sensibilidad que la PCR
convencional y mayorespecificidad ya que pueden utilizarse sondas que reconocen el
fragmento amplificado por los cebadores.
El termociclador que se utiliza debe estar equipado para poder medir fluorescencia. El sistema
fluorométrico consiste en una fuente de energía para excitar a los fluoróforos y un sistema de
detección, que permite monitorear la señal emitida.
Se pueden utilizar 2 tipos de fluoróforos.
- Fluoróforos con afinidad por el ADN (Ej. Syber green)
- O sondas específicas marcadas que solo emiten fluorescencia si hibridan con el
fragmento de interés. (ej. sondas tipo taq man)

Sistemas de sondas
Los sistemas de detección específicos para una secuencia de interés se pueden dividir en
tres tipos:
a) sondas de hidrólisis
b) sondas de hibridación
c) sondas de horquilla
Todas se basan en el principio FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer por sus
siglas en inglés), que consiste en la transferencia de energía entre dos fluoróforos: un donador
(reportero) y un aceptor (apagador o quencher), los cuales emiten fluorescencia a diferente
longitud de onda. Cuando el reportero y el apagador se encuentran próximos, el apagador
absorbe toda la fluorescencia del reportero. Cuando este par de moléculas se separa, la
fluorescencia del reportero no puede ser absorbida por el apagador y en consecuencia puede
ser detectada por el fotodetector.
Cinética de amplificación de la PCR.

Durante los ciclos iniciales de la PCR no hay cambios significativos en la intensidad de la

fluorescencia emitida, por lo que es indistinguible el ADN amplificado y el ruido basal, pero
permiten fijar la línea base. En la siguiente etapa, aumenta la cantidad del ADN amplificado y
la señal fluorescente. El punto donde se observa un sensible incremento en la fluorescencia
se conoce como fase inicial, la cual es el origen de la fase logarítmica o geométrica.
Posteriormente, inicia la fase lineal en la cual la eficiencia de amplificación no es constante.
Finalmente, se llega a la fase estacionaria donde el producto obtenido permanecerá constante
aunque se aumente el número de ciclos.

Análisis de curvas de fusión o temperatura de melting

Es de gran utilidad para observar mutaciones ya que nos permite ver la diferente temperatura
de melting de los fragmentos amplificados. También es útil para determinar si un ensayo
amplificó el fragmento esperado ya que mi blanco tendrá una Tm específica. Sobre todo en
ensayos con SYBER GREEN. Algunos ensayos multiplex, que colocan más de un blanco con
el mismo fluoróforo, requieren este análisis para determinar qué fragmento amplifico.

Características de ambos métodos de detección

PCR cuantitativa:
Para realizar la cuantificación absoluta en la PCR de tiempo real es necesaria la construcción
de una curva estándar. Para ello necesitamos una muestra de concentración conocida. Se
realizará la PCR en tiempo real de diluciones seriadas de dicha muestra para poder extrapolar
la concentración de nuestra muestra incógnita.
Controles para PCR
- Positivo
- Negativo:Hay 2 tipos, el control negativo total, en el cual se coloca la mezcla de
reacción más agua tri destilada en lugar de muestra; y el control negativo de extracción.
Donde se toma una alícuota extraída sin muestra donde se puede observar el Control interno
(Si es exógeno)
- Interno:Hay 2 tipos, el control Interno endógeno el cual amplifica un gen que debe
estar en la muestra aportada por el paciente, Ej betactina y control Interno exógeno, el cual es
un fragmento de ácido nucleico agregado en el kit por el fabricante.
CONTROL INTERNO ENDÓGENO O EXÓGENO?
- Endógeno:Valora calidad de la muestra; controla extracción y PCR; no sabemos qué
cantidad está presente en la muestra; puede darnos una falsa idea de calidad de la muestra si
hay contaminación.
- Exógeno: No es posible conocer la calidad de la muestra; controla extracción solo si se
agrega a las muestras antes de extraerlas. Sino controla solo PCR; está estandarizado,
sabemos exactamente qué cantidad le agregamos y qué resultado esperar.

PCR digital

Secuenciación de ácidos nucleicos

sangeR - NGS

La secuenciación consiste en determinar la secuencia completa de ADN (orden de las bases

Adenina, Citosina, Guanina y Timina). Es muy útil para el diagnóstico de enfermedades y la
detección de mutaciones y resistencias a tratamientos farmacológicos. Los métodos de
secuenciación se basan en la actividad de la enzima ADN polimerasa.
Sanger
Se basa en el empleo de didesoxinucleótidos que están marcados por una molécula
fluorescente. La adn polimerasa irá añadiendo de forma inespecífica didesoxinucleótidos e irá
alargando los fragmentos. Cada vez que se añade un didesoxinucleótido la reacción se
detiene y se emite una señal fluorescente, que será diferente en función del nucleótido que se
haya incorporado.
Tras múltiples ciclos de amplificación, se obtendrán gran cantidad de fragmentos con
diferente número de nucleótidos. Posteriormente se lleva a cabo una electroforesis capilar y
se detectan las diferentes señales que se producen por la molécula fluorescente. Con esto se
obtiene la secuencia final del fragmento.

Secuenciación de ácidos nucleicos nueva generación (NGS) masiva o paralela

Permite amplificar un genoma completo en un solo día,con esta técnica no se examinan

genes o regiones específicas. Esta técnica permite detectar mutaciones
puntuales,inserciones, deleciones y variantes estructurales.
El ADN o ARN previamente extraído se fragmenta y estos son amplificados en una superficie
sólida, donde se agrupan para secuenciarse. La secuenciación se realiza en múltiples ciclos,
en los cuales se van añadiendo nucleótidos marcados con fluorescencia, que serán
fotografiados y traducidos en la secuencia o el orden que corresponda.

Características:
- PARALELAS: Ocurren muchas reacciones de secuenciación al mismo tiempo.
- MICROESCALAS: Pequeñas reacciones que se realizan en un chip con poco volumen
de reactivos.
- RÁPIDAS: al ser paralelas los resultados son más rápidos. •
- MENOR COSTO: En 2001 un genoma humano costó 100 millones de
dólares.Actualmente 1245 dólares.
- FRAGMENTOS CORTOS:Todos los métodos NGS leen fragmentos cortos

SANGER VS NGS
Organización del laboratorio de biología molecular

El principal agente contaminante es el usuario! (áreas 3 y 4 son “sucias”)

Tema 4: Diagnóstico de coronavirus SARS CoV-2: Técnicas de uso en el

laboratorio clínico.

SARS-COV-2
- Virus envuelto de ARN monocatenario sentido positivo (30.000pb)
- Betacoronavirus de la familia coronaviridae.
- Hasta 2019 había 7 coronavirus causantes de enfermedad respiratoria en humanos.
-SARS-CoV (síndrome respiratorio agudo severo).
-MERS-CoV (síndrome respiratorio del medio oriente).
- Diciembre de 2019 en Wuhan, China aparecen los primeros pacientes de covid-19.
- Forma esférica o irregular,
diámetro aproximado de 125 nm.
- Poseen una cápside de simetría
helicoidal, constituida por la
proteína de nucleocápside (N)
asociada al ARN monocatenario
(forma de rosario).
- Los coronavirus tienen una
envoltura lipídica con tres
proteínas ancladas en ella, E
(envoltura), M (membrana) y S
(del inglés, spike, o espícula).

A- Microscopía electrónica. → (Estructura roja de la imagen B) ARN unido a proteína de la

nucleapside (N), forma de rosario.

Manifestaciones clínicas de los pacientes con COVID-19

- Asintomáticos o síntomas tanto sutiles como graves
- Más frecuentes Fiebre, tos seca, mialgias, fatiga, anosmia y ageusia
- Menos frecuentes rinorrea, producción de esputo, odinofagia, cefalea, mareos,
hemoptisis conjuntivitis
- También se han evidenciado síntomas gastrointestinales como náuseas, vómitos y
diarrea.

Organización genómica de SARS

COVID:

La proteína S de la espícula es
reconocida por el receptor de la célula
ACE2 y junto con la participación de la
proteína TMRSS2 de membrana de la
célula, generan el endosoma e ingresan
el virus a la célula. Luego de esto, se
fusiona la membrana externa con el
adenoma y pierde la envoltura,
liberando así la nucleocápside con el ARN codificado con los genes que necesita para su
producción.

ARN con capuchon 5° y cola polia en 3°, por lo que es parecido a los ARNm de la célula
huésped, por esto las proteínas lo toman como un ARNm propio y empiezan a sintetizar las
proteínas codificadas en esa secuencia.

Las dos primeras proteínas que se van a secuenciar son 2 poliproteínas que después de la
acción de proteolisis, generan muchas pequeñas proteínas no estructurales que se utilizan en
el resto de la replicación viral.

Otras proteínas que se sintetizan más adelante son N (nucleocápside), S (Espícula, M

(Membrana), E (Envoltura). luego de que se sintetizan, se unen a la replicación del ARN viral y
forma una nueva nucleocápside y esta dentro de un reticulo endoplasmatico que genera un
nuevo “Viron” (Vesicula) que es liberado al exterior de la celula.

La cadena de ARN se asemeja a un ARNm de células eucarióticas presenta un capuchón

metilado en el extremo 5’ y una cola poli-aen el extremo 3’

• Su genoma se puede dividir en tres tercios.

2/3: gen de la replicasa viral (2 marcos de lectura abierta ORF1a y ORF1b). 2 poliproteínas
que forman 16 proteínas no estructurales.

3/3: proteínas estructurales E, M, S ,N y otras accesorias.

Diagnóstico molecular de covid-19

Las muestras recomendadas para realizar el diagnóstico molecular son: el hisopado
nasofaríngeo y/o orofaríngeo y/o nasal, presentando el primero mejor sensibilidad y siendo el
de preferencia.
Se pueden utilizar otras muestras como el aspirado nasofaríngeo, expectoración, aspirado
traqueal y lavado bronquioloalveolar.

Recolección de la muestra
1. oportunidad. El virus del SARS-coV-2 puede detectarse en muestras de HNF 2 días antes
del inicio de los síntomas y durante siete a doce días después.Se han reportado persistencia
de prueba positiva durante más de 20 días. En pacientes graves se recomienda toma de
muestra de tracto respiratorio profundo si el primer estudio de HNF fue negativo.
2. Calidad de la muestra. El HNF tiene un protocolo establecido. Es un procedimiento molesto,
puede provocar lagrimeo. El hisopo debe ser flexible y su punta debe ser de poliéster con eje
de material plástico. No está recomendado el uso de hisopos de algodón o con palo de
madera, ya que pueden contener sustancias que inactivan virus o inhiben las pruebas
moleculares.

3. transporte y almacenamiento. El hisopo se coloca en un tubo con medio de transporte viral.

Alternativas para el transporte serían: soluciones tamponadas o suero fisiológico. Si se colecta
muestra orofaríngea (OF), ambos hisopos (HNF y OF) deben combinarse en un solo tubo con
líquido de transporte. Las muestras deben transportarse a una temperatura entre 2 ºC y 8 °C
debe procesarse antes de las 72 h desde recolección.
Si usamos control interno exógeno, pierdo información de como es la calidad de la muestra.

Diagnóstico de covid-19
Hasta ahora el diagnóstico de COVID-19 se puede realizar de 3 maneras.
- La detección molecular de ARN viral. PCR en tiempo real o LAMP
- Métodos rápidos de detección de Antígeno.
- Métodos serológicos que buscan anticuerpos.
La extracción de ARN dependerá del nivel de complejidad del laboratorio. Métodos
comerciales: de membrana de sílica o perlas magnéticas. Manuales o automatizados.

Blancos moleculares para RT-PCR en tiempo real.

Los principales son:
- RdRp (Retro transcriptasa dependiente de ARN)
- Gen N (Nucleocapside)
- Gen E (Proteína de envoltura)
- ORF1ab
- Gen S (Spike)
- ORF 8

Específicos de coronavirus

No especifico de SarsCov2, pero si de coronavirus.

Empieza a dar positivo antes y demora en irse.

PCR en tiempo real

Si el límite de detección (LoD) es demasiado alto, los pacientes infectados con SARS-CoV-2
pueden no dar positivo: alta tasa de falsos negativos.
Si el LoD es demasiado bajo, la contaminación es un problema importante, la prueba
detectará las cantidades más pequeñas de ARN viral: resultados positivos falsos

Diagnóstico molecular de covid - 19

La recomendación de la OPS es realizar el diagnóstico utilizando más de un blanco molecular.
En momentos de alta tasa de circulación la amplificación de un solo gen puede ser tomada
como positivo.
De todas maneras siempre hay que apoyarse en los datos clínico-epidemiológicos (Cuando
están disponibles) a la hora de analizar los resultados.

Resultados negativos con alta sospecha valorar falsos negativos.

- Recolección inadecuada del HNF.
- Retraso o pérdida de cadena de frío durante el transporte.
- Error preanalítico en el etiquetado de la muestra a lo largo del proceso.
- Poca eliminación de virus por el paciente dado el estadio de la infección o por la
gravedad de ésta.
- Presencia de mutaciones del virus en las regiones a las que se dirigen los ensayos.
- Presencia de inhibidores en la muestra (Importancia Control Interno)
-
Controles de rt pcr tiempo real

Cada Kit tiene un CT máximo del

cual voy a saber el valor, muchos
tienen CT menor a 35 de control
interno, válida la muestra.

El kit dice que las muestras

negativas tienen que tener un control
interno con un CT menor a 30 para
ser tomadas como válidas (la
muestra estaba bien sin inhibidores).
Si tengo una muestra negativa que no amplifica el control interno, no puedo saber si es
negativa por no tener el ARN del sarcov2 o si es negativa por la presencia de inhibidores, por
una extracción incorrecta.

Los CT de una infección reciente son más bajos. Tengo mayor cantidad de ARN, se hacen
positivos más temprano en la PCR.
Si la infección es de más tiempo, los CT son más altos, por lo cual dan positivo más
tardíamente en la reacción siempre que la muestra se tome y transporte correctamente.

Hay 2 tipos de control negativo: • El control negativo total, en el cual se coloca la mezcla de
reacción más agua tri destilada en lugar de muestra.

• Control negativo de extracción. Donde se toma una alícuota extraída sin muestra donde se
puede observar el Control interno (Si es exógeno).
Todas las muestras negativas deben de ampliar el control interno.

Posiblemente tuvo un
coronavirus pero ya hace
semanas, ya que el gen N
es el último en irse.

Se informa positivo, si no
tiene PCR reciente
positiva, lo repito con otro
Kit.
 1- Amplifica un solo
control, pero podemos ver
que el control interno no
es correcto, ya que no da
una curva sigmoidea
(línea azul) y por
consiguiente debemos de
repetir la muestra.

2- Un correcto control
interno, pero el gen
específico (linea roja, gen N), no atraviesa el umbral, por lo cual es una muestra negativa.

1- Un incorrecto control
interno, ya que la curva no
es sigmoidea y por lo tanto
debemos de repetir la
muestra.

2- Un correcto control
interno, un gen específico
que no supere el umbral y
por lo tanto es una muestra
negativa.

Orf1 (línea verde), atraviesa el umbral pero lo hace en línea recta, cuando tiene que ser
sigmoidea.

No amplifica el control interno.

Si vemos que el gen

específico superó el umbral,
debemos de repetir la
muestra.
 PCR positiva, ya que el gen
específico superó el umbral y el
ORF1 (una de las específicas de
covid) también lo hizo en una correcta
curva sigmoidea.

PCR multiplex sars-cov-2 /virus respiratorio

Existen muchos kits multiplex que detectan SARS-CoV-2 más otros virus respiratorios
estacionales como ser Influenza A, Influenza B y Virus Sincicial Respiratorio.
Los blancos moleculares de para SARS-CoV-2 son los mismos que estuvimos viendo hasta
ahora.
Los blanco moleculares para los otros virus respiratorios pueden ser de proteínas
conservadas de la matriz, nucleocápside o proteínas de exportación de los diferentes virus.

LAMP
¿Qué significa?
Loop-mediated isothermal amplification Amplificación isotérmica mediada por bucle. Es un
método de amplificación de material genético (ADN) isotérmico, existen otros: WGA,
SDA,HDA,RPA,NASBA
.
Desarrollo
Primer trabajo: desarrollado por Notomi et al. en 2000

Particularidades de la técnica
1-Amplificación a temperatura simple, en termobloque. No necesidad de termociclador.
2- Polimerasa diferente a la Taq polimerasa de PCR.
3- Amplificación en poco tiempo.
4- Se puede utilizar ARN con el agregado de una RT + polimerasa

LAMP ventajas y desventajas con respecto a PCR

1. Isotérmica, temperatura única en termobloque mientras que PCR necesita termociclador (
60-65°C)
2. Requiere 6 primers, considerablemente más complejo que los 2 primers necesarios para la
PCR
3. Tiempo de reacción 30 min aprox, PCR > 60 min
4. Menor sensibilidad que PCR, se necesita mayor concentración para detección
5. Existen métodos de detección a simple vista
6. Menos sensible a inhibidores que la PCR
7. Muy complicado el desarrollo de LAMP multiplex

Fundamento:
Mediante la reacción LAMP se produce una amplificación del material genético específico (
Amplicón ) a una temperatura fija
Mezcla de reacción: ADN polimerasa,Primers, DNTPs, MgCl-, Muestra (ADN) en caso de
ARN se agrega RT, Agua free

Fundamento: ADN polimerasa

Extraída de Bacillus stearothermophilus ( Bst polimerasa ) Esta enzima tiene un T° óptima de
actividad a 60-65°C Además tiene actividad de desplazamiento de hebra ,diferencia
fundamental con Taq polimerasa ( NO NECESIDAD DE CAMBIOS DE TEMPERATURA) Se
inactiva a altas temperaturas 80°C Existen derivados comerciales mejorados de la enzima. Ej
mejorando desplazamiento en regiones con alto contenido de C-G

Fundamento primers: 6 primers

El diseño de cebadores es complejo se evalúa: Largo, temperatura, contenido de C-G, otros.
Existen programas destinados a esto donde se cargan secuencias y se evalúan la calidad de
los primers diseñados
Paso 1 En condiciones de equilibrio a una T° de 65°C aprox, se une uno de los primers y
comienza el proceso de amplificación LAMP. Se inicia el desplazamiento y síntesis por medio
de la polimerasa sin necesidad de desnaturalización. El FIP se hibrida con el ADN molde
monocatenario liberado
Paso 2 Se continúa con la síntesis de una cadena de ADN complementaria al ADN molde,
partiendo del extremo 3' de la región F2 de la FIP. Se avanza hasta completar la cadena

Paso 3 El cebador F3 (EXTERNAL PRIMER) se hibrida con la región F3c y se inicia una
nueva síntesis de ADN por parte de la Bst polimerasa con desplazamiento de cadena. Se
libera la cadena complementaria.

Paso 4 Se forma una cadena doble a partir de la cadena de ADN sintetizada a partir del
cebador F3 y la cadena de ADN molde.

Paso 5 La hebra complementaria liberada en el paso anterior tiene la estructura para formar
un bucle entre las estructuras complementarias F1c y F1.

Paso 6 Este molde de ADN sufre la síntesis desde el otro extremo por la unión de los primers
de tipo B. Exactamente igual a todos los pasos anteriores pero en el otro extremo.

Paso 7 El ADN de doble cadena se produce a través de los procesos descritos en el Paso (6).

Paso 8 Se forma una estructura de bucle en ambos extremos de la cadena por

complementariedad de las estructuras de los primers F1-F1c B1-B1c
 En los pasos sucesivos siempre de la misma forma, por síntesis de la Bst polimerasa y
complementariedad interna en la cadena se van formando diferentes estructuras en forma de
bucle y cíclicas que serán las detectadas en el método.

Detección:
- Real -time LAMP: detección por diferentes métodos
- Fluorescencia , precipitado, detección visual :
-La utilización del colorante Calceína permite la detección por fluorescencia bajo luz UV ,
sustitución de los iones Mn por Mg.es una fluorescencia indirecta
- Precipitado por formación de sales fosfato.
- Fluorescencia o detección visual con Syber Green: En este caso es una fluorescencia
directa , un colorante intercalante que se une cuando se forman hebras de material genético
- Detección visual con indicador de pH: -colorante Azul Hidroxinaftol -Rojo fenol
- Productos en gel de agarosa: diferentes tamaños (PCR tamaño único)

Hay varios protocolos de amplificación isotérmica LAMP descritos.

El instituto Pasteur en colaboración con UDELAR, pusieron a punto un protocolo, el

mismo tiene como blancos los genes N, E y ORF1. Posee dos controles internos
endógenos; RNasp y Actina humana, pero se procesan en tubos separados. LAMP con
muchos primera diferentes que iban amplificando las estructuras en horquillas “LUPS”,
que siguen amplificando u siguen pegando en diferentes zonas.

Problemas: Contaminación
Fuentes de esa contaminación: Muestras positivas Controles positivos Productos de
amplificación

EJEMPLO: Hay varios protocolos de amplificación isotérmica LAMP desarrollados y con

diferentes métodos de detección.
EN NUESTRO MEDIO:
• El Instituto Pasteur en conjunto con UdelaR y ATGen pusieron a punto un protocolo original
de New England BioLabs® retrotranscripción del ARN viral acoplado a la amplificación por
LAMP Blancos: genes N, E y ORF1a. Controles internos: RNAsaP y actina humana pero se
procesan en tubo separado Detección visual por indicador rojo fenol, acidificación posterior a
la amplificación

Protocolo: -Toma de muestra : HNF -Extracción del ARN viral -Mezcla del Reactivo LAMP +
ARN-Incubación a 63°C x 30 minutos: RT + LAMP -Interpretación de resultados

RESULTADOS En cada corrida se debe cargar un control positivo ( provisto por el fabricante o
de una muestra positiva conocida) y un control negativo con agua ( sin el agregado de
muestra).Los resultados obtenidos para los controles deben de ser los siguientes.
Control negativo: ROSADO ESTO ME VALIDA LA CORRIDA
Control positivo: AMARILLO

Muestras: Por cada muestra se utilizaran 2 tubos diferentes con contenidos bien diferentes.
1- control INTERNO detecta actina RNAsaP. Debe ser positivo para validar mi muestra,
presencia de material genético humano
2- Detección de SarsCov-2

Otros métodos de diagnóstico

Test rápido de antígeno para COVID-19

Es un método rápido y mucho más económico que los métodos moleculares. En un principio
solo se recomendaron para pacientes sintomáticos pero hoy en día se utiliza como método de
screening. Tienen gran especificidad pero baja sensibilidad. Se basan en un método de
inmunodetección de tipo sándwich y emplean un formato de prueba de inmunocromatografía
de flujo lateral.

Consisten en un cartucho de plástico con pocillos para la muestra, una tira de matriz de
nitrocelulosa con una línea de prueba en la que se han inmovilizado anticuerpos específicos
contra los complejos antígeno de interés-anticuerpo conjugado y una fila de control en la que
se han inmovilizado anticuerpos específicos contra los anticuerpos conjugados.

Tienen un buen desempeño en los pacientes con cargas víricas elevadas que suelen aparecer
en las fases pre sintomáticas (entre 1 y 3 días antes de la aparición de los síntomas) y en las
fases sintomáticas iniciales de la enfermedad (en los primeros 5 a 7 días de esta). En los
pacientes que acuden a los servicios médicos cuando han pasado más de 5 a 7 días desde el
comienzo de los síntomas es más probable que la carga vírica sea baja y la test de Ag dé un
resultado negativo falso.
Métodos serológicos
Las pruebas serológicas que identifican IgA, IgM, IgG o ACs totales contra SARS-coV-2 se
realizan en muestras de sangre, suero o plasma. Son menos complejas que las pruebas
moleculares. No son útiles para diagnosticar infecciones en etapa aguda. Los resultados
negativos no excluyen la infección por SARS-coV-2, sobre todo en pacientes con exposición
reciente al virus. Algunos ensayos incluyen proteína de nucleocápside (N), combinación de
proteína N más proteínas de espícula y otros utilizaron solo proteínas de espícula

Interpretación de resultados de PCR y serología

Tema 5: Determinación molecular de virus patogénicos en muestras

clínicas

Aplicaciones de la PCR en diagnóstico:

- Detección de secuencias de ADN o ARN específicas: detección directa y tipificación del
genoma del microorganismo infectante. PATOLOGÍAS INFECCIOSAS
- Detección de mutaciones: PATOLOGÍAS CONGÉNITAS o ADQUIRIDAS
- Estudio de expresión génica: permite detectar las regiones genómicas que se están
expresando
Agentes Virales
Detección viral directa por amplificación de ácidos nucleicos:
- Eliminación en algunos casos de la utilización de métodos indirectos (ELISA).
- Eliminación del cultivo viral altamente complejo.
- Rápido diagnóstico de infecciones virales.
Detección cualitativa(diagnóstico):
PCR en tiempo final
PCR en tiempo real
Genotipado:
PCR en tiempo final / RFLPs
Secuenciación
PCR en tiempo real /sondas /HRM
Evaluación de carga viral (evaluación tratamiento):
PCR en tiempo real cuantitativa

Requerimientos en el Laboratorio de Diagnóstico Molecular

Requerimientos básicos para evitar resultados falsos positivos por contaminación y falsos
negativos:
- Áreas de pre y post-PCR físicamente separadas.
- Utilización de Uracilo-glicosilasa en la reacción de PCR.

VALIDACIÓN:
- Controles positivos y negativos en todos los diagnósticos.
- Controles internos y/o de inhibición de reacción.

- Cámara de flujo laminar para muestras infecciosas

➢Los resultados de los diagnósticos moleculares de agentes infecciosos deben de ser
interpretados en un contexto clínico.
Diagnóstico de encefalitis y meningitis

¿Qué técnicas se utilizan en cada caso?

● Detección cualitativa (diagnóstico):
○ PCR tiempo final y real time.
○ Me dice si está presente o no el virus que estoy buscando.
● Genotipado:
 ○ PCR tiempo final/RFLPs: enzimas de restricción que reconocen
secuencias específicas del ácido nucleico.
○ Secuenciación: se secuencia la región de interés y se puede ver la
secuencia de bases.
○ PCR en tiempo real/sondas/HRM.
○ Se establecen subtipos o genotipos del virus (algunos asociados al
tratamiento que se debe aplicar)
● Carga viral (evaluación de tratamiento):
○ PCR en tiempo real cuantitativa: se estudia cuántas partículas virales
por mililitro de plasma hay en la muestra.
○ Se cursa la enfermedad viral, se realiza el tratamiento y se evalúa si
está siendo efectivo, de ser así las partículas virales comienzan a
disminuir en el paciente. Debe disminuir hasta ser indetectable.

Con la PCR real time se puede realizar la detección, amplificación y genotipado del
virus a la misma vez.

Requerimientos en el laboratorio de diagnóstico molecular

Requerimientos básicos para evitar resultados falsos positivos por

contaminación y falsos negativos (asociados a la toma de la muestra):
Áreas pre y post PCR físicamente separadas:
● Pre-PCR:
○ se realiza la extracción de ácidos nucleicos
○ manejo de la muestra clínica
○ se prepara la reacción de diagnóstico
● Post-PCR:
○ se realiza la amplificación
○ se analizan los resultados: con PCR real time nunca se abren los tubos
luego de la amplificación porque se ve el resultado en la computadora y
no es necesario realizar la electroforesis.

Utilización de Uracilo-glicosilasa en la reacción de PCR: si hay alguna contaminación

con productos de PCR, esta enzima los degrada previo a realizar la amplificación.

Controles positivos y negativos en todos los diagnósticos: positivo debe dar positivo y
negativo debe dar negativo.

Controles internos y/o de inhibición de reacción: en caso de agentes infecciosos hay

que poner controles internos y/o de inhibición de reacción. Debemos asegurarnos
que si no amplifica la muestra es porque el virus no está presente y no porque la PCR
no se hizo de forma correcta.

Cámara de flujo laminar para muestras infecciosas: protección para el operador.

Los controles son fundamentales para validar los resultados de diagnóstico molecular
de agentes infecciosos.

Los resultados de diagnósticos moleculares de agentes infecciosos deben de ser

interpretados en un contexto clínico.

PCR de sistema cerrado: se realiza la amplificación, se detecta en el equipo y no hay

necesidad de abrir el tubo en ningún momento, por lo cual evita contaminaciones.

Diagnóstico de encefalitis y meningitis

Lo que debe resolverse rápidamente es el origen de la encefalitis ya que el
tratamiento es diferente en encefalitis viral o bacteriana.
Primero se descarta que sea viral, ya que de inmediato se comienzan a dar
antibióticos mientras que llega el resultado de microbiología para saber qué agente
bacteriano es el causante.

Virus Bacteria Hongo

Herpes simplex virus I Listeria monocytogenes Cryptococcus

Herpes simplex virus II Neisseria meningitidis neoformans
Enterovirus Pseudomonas aeruginosa Cryptococcus gattii
Citomegalovirus Staphylococcus aureus
Human herpes virus 6 Streptococcus pneumonia
Varicella-zoster virus Escherichia coli

Estos virus son ADN.

El LCR llega al laboratorio y se hace la extracción de ADN. Siguiente a eso se realiza
la amplificación de 6 virus a la misma vez (en poco tiempo).
Con PCR real time los resultados están listos en 4 horas.

Diagnóstico de Herpes virus por PCR real time:

Sonda específica: aumenta la sensibilidad y

especificidad.
Gráfico: se ve el control negativo (agua), el control
interno y si hay amplificación se verá la curva
sigmoidea.
Control interno: la muestra se contamina conun
fragmento de ADN, se realiza la extracción de ADN y
luego se utilizan cebadores específicos para este
control y para el virus.
La amplificación del virus debería ser siempre anterior
a la amplificación del control ya que de esta manera
me aseguro de que la amplificación del control no
genere ningún tipo de inhibición en la amplificación del
virus. Puede suceder que, si es poca la carga viral, la
amplificación del virus sea posterior a la del control
interno.

La región conservada es muy parecida en

herpes 1 y 2, cuando la sonda lo reconoce no puede
decirse de cuál de los dos se trata, para esto se
utilizan las curvas de melting.
Temperatura de melting: T° a la cual la mitad de la
hebra se separa.
.

Curva de melting: luego de la

detección y amplificación, se
realiza el proceso de melting.
Se separa la hebra y se
vuelve a unir cuando baja la
temperatura.
Cuanto más G-C se necesita
mayor temperatura para
romper los puentes.
High resolution melting: el
cambio de una única base,
ya da una diferencia en la
temperatura de melting y el
equipo es capaz de
detectarlo.

Se detectan pequeñas
diferencias entre las secuencias
de adn amplificadas que
implican cambios en la
temperatura de melting.

Las diferencias en la
temperatura de Melting para
HSV-I= 67°C y para
HSV-II=60°C, determinan el
resultado positivo para cada tipo
viral.
IC: control interno.

El control negativo no amplifica en ninguna de las dos gráficas, pero si lo hace el

control interno para poder validar la corrida.

Diagnóstico de HIV-1
3 genotipos de HIV-1: M, O y N.
El grupo M es el más frecuente y comprende varios subtipos: A, A2, B, C, D, F1, F2,
G, H, J y K.
Los diferentes genotipos no están asociados con diferentes cursos de la enfermedad
o respuesta al tratamiento antiviral. Se realiza el diagnóstico y se evalúa el
tratamiento.
El HIV-1 es un retrovirus ARN capaz de insertarse en el genoma de las células que
está infectando.
Genes estructurales de HIV:
Se utilizan las regiones más
conservadas del virus para
realizar la amplificación.

Ciclo del virus HIV:

Una vez que ingresa a la célula

mediante un receptor de membrana, su
genoma ARN es capaz de
retro-transcribirse (presenta una
retrotranscriptasa) y copiarse a un ADN
copia (ARN se convierte a ADN de
doble hebra).
La enzima integrasa permite integrar el
genoma HIV al genoma de las células
del huésped, donde queda latente y no
puede separarse del genoma del
huésped. La única forma de separarlo
sería matar a las células del sistema inmune.
Los pacientes HIV positivos pueden tener una vida normal gracias a los tratamientos.
El tratamiento impide la activación del genoma integrado del virus en el genoma
humano, ya que no hay forma de separar el genoma viral integrado a la célula.

Cuando se reactiva, el ADN viral pasa a copias de ARN que se traduce, se producen
las proteínas virales, se forma la partícula viral y sale fuera de la célula provocando la
ruptura de la membrana celular y la muerte de la célula involucrada en el sistema
inmune.

Entonces, podemos diagnosticar HIV de dos maneras:

● Partículas circulantes: se realiza su detección en sangre y debe detectarse el
ARN.
● Virus integrado en el genoma celular: debe detectarse a partir de ADN.

La PCR se utiliza para detectar el ARN viral que está circulando y el genoma de HIV
inserto dentro de las células como ADN.

Si se quiere saber si una persona está o no infectada, es recomendable detectar si

está integrado a la célula. Si se realiza el estudio con las partículas virales circulantes
en sangre, lo que se detectará es si hay una infección activa en el momento.

Sensibilidad de las técnicas para detección de HIV:

Las técnicas moleculares (como PCR) son muy sensibles ya que permiten detectar el
virus a los 10 días de la infección.
Los métodos indirectos o inmunológicos detectan el virus a los 20 días o al mes de la
infección.

HIV-1 en Recién Nacidos de Madres Positivas:

Todo niño que nace de madre HIV positiva debe ser testeado para este virus. A la
madre, durante todo el embarazo, se le dan muchos retrovirales.
Si la madre ya sabe desde antes que tiene HIV se le pide que antes de quedar
embarazada tenga una carga viral indetectable.

ELISA (serológico):
● Es uno de los test más utilizados para el diagnóstico en la población general,
menos en recién nacidos.
● Se confirma el resultado positivo por Western blot: electroforesis para detectar
proteínas virales.

○
● IgG maternas pueden persistir hasta los 18 meses de edad del niño
● No discrimina las IgG producidas por la madre y traspasadas al niño, de las
producidas por el feto.
● Entonces, que de positivo este test no significa que el niño esté contagiado, ya
 que no se sabe si los anticuerpos detectados son los que pasaron de la madre
al recién nacido o son propios del mismo.

PCR:
● Permite la detección directa del genoma de HIV antes de la seroconversión.
● A todo recién nacido de madre positiva, se realiza la detección de HIV-1 por
biología molecular (PCR común).
● Si da negativo se lo vuelve a evaluar al mes y luego a los tres meses.
● Si las tres muestras dan negativo, se considera negativo al niño (así se
asegura la sensibilidad del estudio).
● En los recién nacidos de madres HIV positivas y en accidentes laborales del
personal de salud, son los únicos casos en que se utilizan técnicas
moleculares para diagnóstico de HIV.
● 1: Control interno
2: Detección del virus HIV
3: Control negativo total.

Carga viral para evaluación de tratamiento:

Los anti-retrovirales van directo al inhibidor de la
integrasa, se inhiben las proteasas (proteína que
utiliza el virus para romper la membrana celular).
Para evaluar la carga viral se toma una muestra del
plasma y se estudian las partículas virales
circulantes (ARN viral).
Se debe realizar una PCR cuantitativa.
Se realiza la extracción de ARN del plasma y se detecta virus circulante.
Se amplifica en el mismo tubo LTR, gag (regiones del gen) y un control interno (QS).
El control interno es ARN sintético del cual se coloca una cantidad de copias
conocida en la muestra antes de la extracción de ARN. Esto ayuda ya que si, por
ejemplo, hay una degradación de ARN, también se va a degradar el ARN sintético
que se colocó.
Entonces, si se colocaron “x” copias del ARN sintético y al finalizar el proceso queda
la mitad de lo que se colocó, debe corregirse o normalizarse el ARN de la muestra.

En la PCR real time se tiene una sonda que fluoresce al reconocer el producto de la
PCR.
Luego amplificar se realiza una curva estándar con distintas concentraciones de HIV
y se calcula el número de copias de ARN de HIV por mililitro de plasma circulante.

No se utiliza la región POL porque la terapia está dirigida a esta región entonces
pueden generarse mutaciones en la misma.

Curvas de crecimiento del fragmento objetivo para una serie de dilución con un
intervalo de 5 log10:

La muestra que tenga mayor carga viral

amplificará antes.
 Gráfica de amplificación del control
interno: si el control interno se mantiene
constante, se pueden validar las
muestras.

La carga viral debe ir descendiendo hasta ser indetectable como respuesta al

tratamiento (4 meses aprox.).
Nunca se informa “carga viral cero”, sino que se informa “no se detectan partículas
virales circulantes”.

HIV resistentes:
Se dice que hay HIV resistentes cuando hay una falla de los tratamientos en
pacientes HIV positivos.
La susceptibilidad del HIV a drogas anti-retrovirales es muy difícil de establecer con
metodologías basadas en el cultivo viral, por eso se aplican técnicas de biología
molecular más sencillas.
Esta resistencia está dada por mutaciones específicas en genes que codifican para
proteínas blancos de la terapia (TR y proteasa).
Se realiza una secuenciación y se ve a qué es resistente esa mutación (tipificación de
resistencia por secuenciación). De no ser posible el acceso a un secuenciador, se
prueban diferentes tratamientos en el paciente.

Dinámica viral y resistencia a antivirales:

Efecto de las mutaciones:

 Secuenciación:

Se amplían las secuencias que son

blanco de los antivirales y se compara
con la secuencia de referencia para
chequear si hay cambio de bases.
Así es como se detectan las distintas
mutaciones que pueden haber.

Ejemplo:

Diagnóstico de virus influenza

Es un virus envuelto y sus partículas son morfológicamente variables.
Comenzó a diagnosticarse por PCR en tiempo real.
Su ARN de cadena simple presenta un genoma segmentado: 8 segmentos en
influenza A e influenza B.
Presenta glicoproteínas de superficie: Hemaglutinina (HA) y Neuraminidasa (NA) que
son blancos para el diagnóstico molecular.
También tiene proteínas estructurales como nucleoproteínas (NP) y matrix (M).
 Si dos virus influenza atacan el mismo
individuo, pueden recombinarse entre
ellos y generar nuevas mutaciones.

Variantes:

Hubo varias epidemias y

pandemias de gripe.
La más complicada fue en 1920
ya que generó más estragos en la
población.

Origen Genético del virus pandémico H1N1: en 2009 hubo un reordenamiento viral

Diagnóstico de H1N1v:
Muestra: Hisopado Nasal, Aspirado Nasofaríngeo.
Técnicas:
● Detección de Influenza A con antígenos virales: en un principio se daban
muchos falsos negativos.
 ● Aislamiento viral en cultivo celular
● Diagnóstico molecular: RT-PCR (es un virus ARN) en tiempo real:
○ Detección de Influenza A: amplificación de gen M2 (muy conservado)
○ Detección de subtipo H1N1v: amplificación de gen HA1 (específico de
cada subtipo)
○ En pacientes con gripe para detectar si era H1N1

Diagnóstico por RT-PCR en tiempo real:

Interpretación de resultados:
Tema 6: Diagnóstico molecular de hongos y parásitos

Micosis
En la actualidad las micosis se encuentran entre el 4to al 10mo lugar de causa de muerte en
inmunocomprometidos, sobre todo en pacientes internados en cuidados intensivos. Las
muertes por infecciones micóticas graves son comparables a las producidas por tuberculosis y
malaria (alrededor 1,2 millones por año)

Diagnostico Micologico
Tradicionalmente las micosis son identificadas en el laboratorio a través de diferentes
procedimientos:
- examen directo
- cultivo
- histopatología
- pruebas inmunológicas
La mayoría de estos procedimientos requiere de un tiempo prolongado desde 3 hasta 15 o
más días. Requiere de personal muy capacitado.
Este largo periodo para proporcionar los resultados diagnósticos ha sido motivo de la
búsqueda de procedimientos más rápidos, sensibles y específicos.

Técnicas clásicas
- Cultivo y observación microscópica.
- Técnicas de diagnóstico precoz :
- Antígeno de Cryptococcus,
- Manano de Candida,
- Galactomanano de Aspergillus (en suero o BAL de hemato oncológicos)

Diagnostico micologico
Entre las técnicas moleculares utilizadas en la identificación de hongos se han descrito
- Análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP; del inglés, Restriction
Fragment Length Polymorphism),
- Electroforesis de enzimas multilocus (MLEE; del inglés, Multilocus Enzyme
Electrophoresis),
- Hibridación con sondas marcadas para la identificación de un fragmento específico de
ADN (hibridación Southern o Southern blot)
- PCR y sus modificaciones para la amplificación de diferentes fragmentos de ADN
específicos
Diagnóstico molecular micosis
La región que se emplea con mayor
frecuencia como diana para detectar ADN
fúngico es la que codifica el complejo de
los ARN ribosomales, genes 18S, 5,8S y
28S. Estos genes contienen secuencias
conservadas comunes a todos los hongos,
dominios variables y regiones
espaciadoras internas, altamente variables.
Las zonas variables se pueden emplear
para la clasificación de las especies, hay
secuencias muy conservadas e
inespecíficas o muy variables y específicas

Técnicas moleculares: - Análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).

Amplificar el gen (cada especie, un alelo). Luego de amplificar uso E de restricción (cortan el
ADN) en el medio del fragmento, reconocen secuencias de ADN y cortan donde encuentran
ese fragmento que reconocen. Cuando corra la electroforesis, voy a ver fragmentos de la
misma pcr.

- Electroforesis de R multilocus (MLEE): Varios E (proteínas) diferentes que son

conservadas en la especie del hongo se aíslan y se corre una electroforesis y se
observa el patrón de banda z cepas diferentes, dan un patrón de bandas diferentes
si sus E son diferentes. Observo diversidad de proteínas (prot con acción
enzimática).
- Hibridación con sondas marcadas para la identificación de un fragmento específico
de ADN, busca si un fragmento está presente o no en la muestra, y una vez que se
une, se revela la presencia de la sonda por Southern blot.
- PCR y sus modificaciones para la amplificación de diferentes fragmentos de ADN
específicos.
- Secuenciación de fragmentos específicos

Las regiones que se emplean con mayor frecuencia como diana para detectar ADN
fúngico son las que codifican el complejo de los ARN ribosomales. Genes 185, 5, 85 y
285.

Estos genes contienen secuencias conservadas comunes a todos los hongos,

dominios variables y regiones espaciadoras internas, altamente variables. Las zonas
variables se pueden emplear para la clasificación de las especies, hay secuencias muy
conservadas e inespecíficas o muy variables y específicas.
 Ej: Técnicas de PCR para aspergilosis tienen como diana (blanco) alguna zona del
fragmento 185 del ADN ribosómico, ITS (espaciadores internos) dentro del ADN
espacios que no secuencian.

Pneumocystis jirovecii: Se han usado numerosas dianas como los ITS del ADN
ribosomal, genes mitocondriales y otros que codifican glicoproteínas de superficie.

Combinación de PCR, RFLP permite diferenciar 16 especies de levaduras de

importancia clínica, entre ellas Candida tropilalis, C. parapsilosis, C. kruseli, C.
grabrata, C. dubliniesis y C. aurius.

Kits cerrados. Muestra:

sangre.

En una prueba puedo

encontrar 43 pátogenos
diferentes y en una
hora tengo el resultado.
Muy caro.

Usa real time PCR.

Pneumocystis jirovecii:
Es un hongo oportunista no cultivable. Causa infección pulmonar en personas
inmunocomprometidas especialmente HIV SIDA, desnutridas, transplantadas o con
tratamiento con inmunosupresores. Es adquirido por vía respiratoria en etapas tempranas de
la vida. La neumonía por P. jirovencii (PCP) tiene síntomas inespecíficos pero la insuficiencia
respiratoria es la complicación más frecuente y se asocia con alta mortalidad.
El diagnóstico de PCP se realiza por síntomas clínicos y radiográficos y la confirmación se
realiza por la observación directa de organismo teñido. La observación al microscopio requiere
muchas capacitación y no tiene mucha sensibilidad. Las tinciones más utilizadas son
May-Grünwald-Giemsa, Gomori-Grocott, o inmunofluorescencia. En los pacientes
inmunocomprometidos muchas veces la respuesta inmune es baja complicando el diagnóstico
por inmunofluorescencia y presentando falsos negativos.
El diagnóstico molecular se ha realizado de diversas formas.
- PCR anidada
- PCR en tiempo real
- PCR seguida de Secuenciación
- Lamp
Los métodos moleculares presentan una dificultad, por su alta sensibilidad es difícil determinar
si el paciente está colonizado o si está cursando una infección activa. Esto se puede superar
realizando qPCR utilizando puntos de corte para determinar infección o colonización. O
asociando la PCR con el resultado clásico. El poder predictivo negativo de los métodos
moleculares es del 100%

Secuenciacion de acidos nucleicos fungicos

Se ha secuenciado el genoma completo de muchos hongos con aplicación en investigación y
en microbiología clínica.La identificación se logra comparando la secuencia del producto de
amplificación obtenida a partir de la muestra o cultivo con una base de datos de secuencias
de especies conocidas. La secuenciación es un método rápido, económico y específico, por lo
que se considera candidato para convertirse en el estándar de referencia para la identificación
de hongos

Diagnóstico parasitológico
El diagnóstico parasitológico clásico se realiza por métodos indirectos como las técnicas
serológicas o directos como la observación al microscopio de distintos estadios parasitarios.El
diagnóstico molecular no es utilizado de rutina en los laboratorios clínicos pero hay muchos
diseños experimentales

Leishmaniasis
La leishmaniasis comprende un grupo de enfermedades zoonóticas causadas por
protozoarios del género Leishmania y transmitidas mediante mosquitos hematofagos. Se
reconocen tres formas clínicas básicas: formas cutáneas, cutáneo-mucosas y viscerales,
siendo esta última, la presentación más grave por su alta letalidad cuando no se realiza
tratamiento específico. Su principal reservorio son los caninos domésticos y silvestres.
El diagnóstico se basa en la sospecha clínica, y un contexto epidemiológico.
Debe ser confirmado microbiológicamente por cualquier técnica parasitológica.
- Observación microscópica
- Pruebas serológicas.
- Cultivo in-vitro
- Inoculación en animales de experimentación
- Xenodiagnóstico
En nuestro país la zona “0” es el litoral norte, Salto y Artigas, en la doble frontera terrestre con
Brasil y Argentina.
El diagnóstico molecular se hace por PCR en tiempo real. Es de gran utilidad porque se puede
hacer a partir de muestras menos invasivas que las que se utilizan para el diagnóstico
parasitológico clásico. Tiene gran sensibilidad y permite identificar a nivel de especie.
Permiten realizar seguimiento de tratamiento .Los blancos utilizados son varios, pueden ser
ITS del ARNr 18S o kDNA (ADN mitocondrial)

Toxoplasmosis
Es causada por el parásito Toxoplasma gondii, intracelular obligado, único en su género. El 30
% de la población es portadora del parásito. La infección durante el embarazo en una mamá
serológicamente negativa puede llevar a la transmisión del parásito por la placenta hacia el
feto, que lleva a toxoplasmosis congénita. El 85% de los neonatos puede ser asintomático, sin
embargo, la mayoría desarrollará lesiones irreversibles, especialmente en el ojo y en el
cerebro, durante la niñez temprana o adolescencia, si no se recibe el tratamiento adecuado.
El diagnóstico se realiza mediante:
- Técnicas indirectas como la detección de anticuerpos
- Técnicas directas como la detección del ADN por técnicas moleculares. REP529
secuencia repetitiva 200 a 300 copias por genoma
- Estudio anatomopatológico y el cultivo

Leucemias: Neoplasias hematológicas.

La palabra leucemia viene del latí Leucemia o Leukemia, palabra que se
integra por dos raíces griegas, leukos “blanco” y haima “sangre”. Sangre
blanca, lo vemos en el hemograma, cantidad enorme de leucocitos.

Grupo de enfermedades malignas de la médula ósea (cáncer hematológico)

bastante heterogéneo. Afectan la sangre, médula ósea y ganglios linfáticos.
Diferentes niveles en el estudio de neoplasias hematológicas:
- Examen clínico
- Hemograma
- Citogenética
 - Citología
- Inmunofenotipo
- FISH
- Biología Molecular
- Anatomía patológica

Las células de la sangre derivan de células

hematopoyéticas (stem cell) totipotencial por
su capacidad de dar origen a diferentes
tipos celulares. Varias células intermediarias
en el proceso.Dos grandes grupos Mieloides
(Intervienen en inmunidad) y Linfoides.

Las alteraciones genéticas subyacen a

cualquier tipo de neoplasia hematológica
puede estar en cualquiera de los estadíos
celulares.

Clasificación informal de las

leucemias:

Origen Aguda Crónica

Origen mieloide Leucemia Aguda Neoplasias

Mieloblástica (LAM) mieloproliferativas crónicas.

Origen linfoide Leucemia Linfoblástica Neoplasias

Aguda (LLA) linfoproliferativas crónicas.

Agudas: células indiferenciadas inmaduras, evolucionan rápidamente. Si no se tratan

desencadenan en la muerte.
Resultado en 24hs, como mucho 48hs.
Crónicas: No son tan urgentes.
Neoplasias mieloproliferativas crónicas (NMP):

Son desórdenes clonales de las células madre hematopoyética, caracterizados por la

proliferación desregulada y expansión de uno o más linajes mieloides (eritroide, granulocítica,
megacariocítica, monocitos/macrófagos o mastocitos).

Tienen una tendencia variable para progresar a Leucemia aguda en caso de no tratarse o de
tener alteraciones genéticas.

-Para ser mieloide crónica DEBE TENER SI O SI EL GEN BCR-ABL1.

-Organomegalia: Células hematopoyéticas que tendrían que estar en MÓ, están en el bazo
aumentando su volumen. Esplenomegalia, hepatomegalia.
-Pueden mostrar un solapamiento en las características clínicas y moleculares.
Leucemia mieloide crónica (LMC). Crh Ph +, (BCR-ABL1 + )
Las neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL1-negativas:
1) Policitemia Vera (PV) Mutación en gen JAK2
2) Trombocitemia esencial (TE) Mutación en gen JAK2, CALR, MPL
3) Mielofibrosis primaria (PMF) Mutación en gen JAK2, CALR, MPL
Anomalías genéticas definen muchas NMP
Mutaciones: KIT D816v característica de mastocitosis.
JAKL casi en el 100% de las policitemias vera, aunque no es específica de ella.

Última clasificación de las OMS 2016. Encuadradas las comunes

Se han incorporado genes. En leucemia aguda

hay varios genes que identifican a un subtipo en
particular dependiendo de la translocación que
tenga.
Importante conocerlo por si se sospecha por
dato clínico que sea una MI (8;21) lo primero
que estudio es el gen RUNX-1-RUNX1T1.
 Anomalías genéticas definen muchas NMP:

Mutaciones: KIT D816v característica de mastocitosis.

JAKL casi en el 100% de las policistemias vera, aunque no es específica de ella.

Neoplasias mieloproliferativas crónicas:

-Leucemia mieloide crónica (LMC) Phi (BCR-ABL1+).

Neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL negativas:

-Policistemia vera.
-Trombocitemia esencial (TE).
-Mielofibrosis primaria (PMF).
Todos JAK2 +

Características: -Clínica compartida en NM clásicas.

-Hipercelularidad de la médula ósea.
-Signos y síntomas.
-Episodios trombóticos o hemorrágicos.
-Hematopoyesis extramedular (esplenomegalia).

La heterogeneidad de las NMP complica la capacidad de hacer un diagnóstico preciso,

proporcionar información y pronóstico confiable, seleccionar la terapia apropiada.
De ahí la importancia de estudiar las nuevas mutaciones.

Leucemia mieloide crónica (LMC):

Generalidades:
-Es una neoplasia mieloproliferativa clonal.
-Producción descontrolada de granulocitos, generalmente maduros. Neutrófilos, o también
basófilos y eosinófilos.
-Caracterizado por la fusión de dos genes: BCR (en cromosoma 22) y ABL1 (en cromosoma
9), generando el gen BCR-ABL1.
-El resultado es el cromosoma Philadelphia (Ph)
-La proteína codificada por el BCR-ABL1 tiene actividad tirosin quinasa desregulada.

Epidemiología:
-Representa 15-20% de las leucemias en adultos.
-Edad media: 45-55 años.
-Incidencia anual: 1-2/100.000 (aumenta con la edad),
-Hasta 30% tienen más de 60 años.
-Ligeramente mayor incidencia en varones.
-Mayor incidencia observada en pacientes con exposición a la radiación pesada.
-Presenta 3 fases: Crónica, Acelerada y Blástica.
-50% se diagnostica por pruebas de rutina en el laboratorio.
-85% se diagnostica durante la fase crónica.
- El 95% presenta cromosoma Ph.

Aumento de granulocitos.

Translocación: El ADN está organizado en una estructura muy compleja que se empaqueta en
una fibra que es la CROMATINA, da 2 vueltas alrededor del octámero de histonas y a su vez
ese octámero genera una fibra que tiene una alta compactación y una estructura muy
organizada para formar los cromosomas.

Los cromosomas metafásicos (2 brazos largos y 2

cortos) ya se duplicaron para la división celular.
Esto permitió ver los cromosomas al microscopio
óptico y podemos armar un cariotipo.
La mayor parte del tiempo la cromatina está en
estadío relajado (interfase).
 Cromosoma Ph que se genera por
una translocación balanceada del
cromosoma 9,22.
Gen ABL donde se corta el
cromosoma 9.
Gen BCR donde se corta el
cromosoma 22
Se intercambian los cortes.
El gen y los puntos de corte donde
se rompe el ADN (se corta la hebra
en interfase). Dependiendo de los
puntos de corte son las isoformas.

Principal punto de corte.

Las barras verdes son los
exones (Tienen la información
para codificar proteínas), las
regiones entre ellos son no
codificables (intrones)

Cromosoma Ph es el primer gen de fusión que se detecta en una

enfermedad oncológica en 1960, luego se mejoraron las técnicas
de bandeo y se pudo determinar que era una translocación entre el
cromosoma 9 y 22.
En 1983 con técnicas Southern Blot se determinó que la
translocación involucraba los genes BCR y ABL1.
En 1988 PCR cualitativo.
En 1990 se identificó el STI-571 (Inhibidor de Tirosin-quinasa o
ITK).
1999 Primer resultado en humanos.
2001 se aprueba por la FDA.

Señales de translocación BCR-ABL que se

dan por las proteínas tirosin-quinasa: Proteína
que capta un grupo
Fosfato del ATP y fosforila (lo transfiere) a
otra proteína.
Esto genera cascadas de señalización. Forma
en que las células transmiten señales.
La vía PI3K inhibe señales de apoptosis (muerte celular programada.
La vía RAF y STAF le dicen a la célula que se multiplique, son vías de proliferación. BCR-ABL
no se apaga, es una proteína anómala, siempre está mandando señales y no deja de
proliferar.

La BCR-ABL toma un grupo fosfato del ATP y

se lo transfiere a la proteína sustrato en una
residuotirosina. Este a su vez fosforila otra y
genera una cascada de señalización. Lo que
hace el Latinib es competir por el sitio activo
del ATP, ocupa el sitio activo e impide la
fosforilación cortándose la cascada de
señalización. La célula se muere y esto revierte
la enfermedad en poco tiempo.

Estudio que mostró el beneficio y potencial del

Imatinib.
2 grupos de pacientes, uno tratado con el fármaco
y otro tratado con la terapéutica tradicional.
A los 18 meses, la respuesta citogenética mayor
(RCM) es una disminución en el cariotipo de las
células Ph, fue 87,1% en el grupo con Imatinib y
34,7% el grupo con interferón alfa más Cytarabina
(terapia convencional).
La tasa de remisión citogenética completa (RCC) la desaparición del cromosoma Ph fue del
76,2% y 14,5% respectivamente.

Se introduce el estudio de la enfermedad residual mínima (ERM), es la que hay por debajo del
límite de detección de la técnica citogenética por Q-PCR que aumenta la sensibilidad técnica
(1-100.000).

Diagnóstico de LMC
Examen físico, conteo sanguíneo completo, frotis de sangre periférica, aspiración y biopsia de
médula ósea, estudio citogenético, PCR, FISH (opcional si es Ph-).

Estudio citogenético:
Permite el diagnóstico de LMC, requiere de un
aspirado de médula ósea para tener metafases
óptimas. Luego del aspirado las células se ponen en
cultivo, se hacen crecer, se detiene en metafase para
ver los cromosomas, se tiñen, se hace el bandeo, y se
mira el resultado.
Permite evaluar la evolución colan, así como
anomalías cromosómicas adicionales.
Cariotipos críticos y complejos ocasionales pueden
resultar en la pérdida de la identificación +(9;22).

Estudio de fisher:
No necesita biopsia de médula ósea para resultados
óptimos.
Permite confirmar el diagnóstico de LMC. No es
necesario hacer cultivos celulares para tener la
metafase. Permite la identificación de potenciales
duplicaciones del cromosoma Ph.
Permite la identificación de translocaciones críticas
BCR-ABL.

Técnicas moleculares: RT-PCR Q-PCR y secuenciación Sanger.

RT-PCR: (Retrotranscripción y PCR) confirma el diagnóstico clínico. Identifica diferentes
puntos de ruptura (cualitativo).
Importante en caso de Ph- ya que el PCR si lo detecta. Caracterizaciòn leucémico blanco en
ERM (Isoforma).
Q-PCR o real time PCR: Permite evaluación terapéutica durante la evolución de la
enfermedad (cuantitativo).

Secuenciaciòn: Identifica mutaciones que generan resistencia al medicamento, generalmente

se dan en el sitio activo de la presencia a nivel del ADN en regiones que codifican el sitio
activo de la proteína, hay aumento del gen BCR-ABL.
Estudio el gen BCR-ABL a nivel transcripto (ARNm) porque a nivel del ADN los genes se
organizan en regiones codificantes (exones) y no codificantes (intrones) que tienen más pares
de bases que los exones. Cuando un gen se expresa, produce una molécula de ARN de una
sola hebra, por splacing corte y empalme, los intrones se sacan y queda la región codificante
completa. El ADN hace una copia (Retrotranscripción) a ADN, dando enzimas
retrotranscriptasas que hacen una copia a la inversa del ARN generando una molécula de
ADNc, demora 5 horas. ADN de simple cadena, de rutina.

El ARN es una molécula lábil, se degrada en horas. Las muestras se procesan en el dìa o se
almacenan en medios especiales.

Dando E retrotranscriptasas ( extraídas del retrovirus) que hacen una copia a la inversa del
ARN generando una molécula de ADN copia ADNc, demora 1hs ADN de simple cadena de
rutina.

El ARN es una molécula hábil, se degrada en horas, las muestras se analizan en el dia o se
preservan en medios especiales.

Niveles de respuesta Citogenética y molecular en LM C. M CYR respuesta

mayor M R y M C respuesta molecular citogenética

Proceso de transcripción: La cadena de ADN

se separa y la ARN polimerasa va copiando a
una molécula de ARN. Ese pre-ARN tiene todos
los intrones - exones, luego se cortan y
empacan y la molécula de ARNm sale al
citoplasma y entra en traducción los ribosomas
y ARNt van leyendo el msj de ARN y agregando
los AA (anticodón) del ABL1 a nivel genómico

Las regiones codificantes del gen ABL

(amarillo) muestran gran diferencia de la parte
codificante de la no, una vez que se transcribe
e ARN que se empalman, uno con otro , la
parte coficiante llega a 1600pb a diferencia del gen que puede tener varios cientos de miles de
pares de base. Lo mismo pasa para el BCR.
Detección del gen quimérico BCR-ABL1 por RT-PCR

Si queremos amplificar por PC, si extraemos el

ARN hacemos el RT ponemos cebadores
(primer) para PCR y no está la translocación,
no más amplificación.

Con termociclador detecto gen. Le ponemos la

temperatura y el número de ciclos que nos interesa y luego hacemos electrofore sis (pre
cualitativo).

Se hace gel con pasillos que se sumergen en buffer, con una solución y se le pasa corriente
eléctrica ADN8, migra al seguimiento de la respuesta a la terapia con ITK mediante PCR en
tiempo real o PCR

Taqman Probe:
Además de usar el primer (cebador), para amplificar,
se unen primas que permiten detectar el producto a
medida que se va sintetizando.
La sonda Taqman es como un primer complemento a
una región determinada. La sonda tiene un
fluorocromo
(verde) y un quencher (roho) que enmarca la
fluorescencia y la sonda cuando está intacta por
cercana.
Pero cuando se da la amplificación, la polimerasa con
actividad 3° 5° exonucleasa, degrada la sonda liberando el fluorocromo que cuando sea
excitado, va a emitir una señal.

Cuando paso fluorescencia basal

(+hreshola). CQ inversamente proporcional
a la cantidad que había al inicio (si hay
mayor cantidad al inicio el punto va a ser
mas temprano, si hay
menor cantidad va a ser más tardío).
Cuando se empiezan a apretar los
reactivos, llega a meceta (plato). CQ
determina número de copias por fórmula.
PCR cuantitativo (Q PCR):

Permite cuantificar el número de transcriptos BCR-ABL: se/mo (sangre o médula).

Detecta cambios en niveles de expresión (si el paciente está respondiendo al tratamiento,
disminuye el número de BCR-ABL y le permite predecir recaídas/remisiones.

Se analiza la expresión relativa del gen BCR-ABL en relación a la expresión, de un gen control
(ABL-GUT-BCR) constitutivos, todos los genes lo expresan. La expresión de este último debe
ser igual en diferentes confesiones. Cociente BCR-ABL.

Niveles de respuesta citogenética y molecular en LMC.

Mc y R. Respuesta citogenética mayor M R

respuesta molecular.

El paciente empieza el tratamiento. A

los 6 meses alcanza una respuesta
citogenética completa y a los 12
meses una respuesta molecular
mayor. Casi a los 30 meses alcanza
una respuesta molecular completa M
R 4,5 y M R 5 con 0,01 % - 0,001%
de expresión relativa.

Cuando se pasa la RM M está indicado a ser un estudio de mutación si la gráfica empieza a

subir.

Recomendaciones del European Leukemiane

Resistencia a inhibidores de TK.. Resistencia primaria: el paciente no logra una respuesta
deseada al tratamiento inicial (no remisión hematológica completa 3M. No remisión
citogenética mayor a 6M. No remisión citogenética completa 12M ).

- Resistencia secundaria: el paciente con una respuesta inicial a un TKI recae.

- Resistencia adquirida: el 80% de adquisición de mutaciones en la región de dominio.
- Pérdida de respuesta citogenética o molecular. Progresión a fase acelerada o
blástica. Se detectan entre el 50-90% de los pacientes que presentan resistencia al
tratamiento algunas mutaciones confieren ventaja al crecimiento, ganancia de
función, contribuyendo al progreso de la enfermedad. Identificó mutaciones
tempranas, cambio terapéutico, no evoluciona la enfermedad.

Mutaciones que ya se han estudiado y

los dominios de las proteínas T315lim
pide la función de los 3 medicamentos
aprobados por el FNR, se estudia
primero y por PCR cualitativo.

Estudios en roio las mutaciones que no funcionan

con cada medicamento

En amarillo las que funcionan levemente, en naranja

un poco mas y en verde las que si
Como se estudia la resistencia de Allk por secuencia directa porque se puede analizar todo el
dominio quinasa. Secuenciación directa +DMPLC (más sensible), no se sabe que mutación es
solo se encuentra una alteración.

ASO PCR/ ASO RQPCR Técnica específica para una mutación.

RFLP hay amplificación y digestión específica de cada mutación.
Pirosecuenciación. No se usa tanto.

PCR ALELO específico (ASO-PCR). En el extremo complementario (C-G). La E puede

empezar a sintetizar 1-2 emparejamiento imperfecto, la E no funciona, no amplifica
mutaciones de A por G.

JAK2: Proteína quinasa que normalmente funciona a través de su asociación con receptores
de citocina sin actividad quinasa intrínseca. El ligado de unión a receptor de citoquina es
apropiado. El ligando de unión al receptor de citoquinas apropiado da como resultado la
fosforilación de Jak2 quinasa y la activación, la fosforilación del receptor de citoquinas, el
reclutamiento y la fosforilación de proteínas STAT, y la activación de vías de señalización.
Gen MPL(receptor de trombopoietina) en cromosoma 1p34 codifica para el receptor de
trombopoietina(TPO).

Mplus515 (mutación) es una transición de G A T en el nucleótido 1544 (exón 10) aunque el

receptor no está activado por la TPO igual va estar mandando señales.
Otras mutaciones: w5155 y 505n
MPL: mutado induce activación constitutiva de la vía JAK STAT
Mutaciones en JAK2 y MPL Cuando el receptor TPO se activa, activa las cascadas de JAK2
(A)

Cuando está mutado el receptor (c), no tiene el

ligando, átomo de TPO reclutando a las JAK
mutadas y activo las cascada JA. ras que van al
núcleo a decir a la célula que hay que proliferar,
activarse.

Mutaciones en gen CALR: en 2013 se identifican

mutaciones recurrentes (codifica para la
calreticulina)

Estas mutaciones se detectaron en el 65% de los

pacientes con trombosis (TE) y M FP (micro
fibrosis primaria) que no tienen mutaciones en
JAK2 o en MPL .

Policitemia vera tiene

aumento de GR general,
la trombocitemia tiene
aumento de plaquetas.
La mielofibrosis puede
haber fibrosamiento de la MO. Puede haber solapamiento de las características clínicas.

En TE y M FP mutaciones CALR M PL. Las mutaciones CALR son las segundas: pacientes
NMP PH negativo.Estudio CALR: PLR y secuencias fanger del exón 9.

Pares de genes: Secuencia genoma entero, sos exoma '(regiones codificantes).

Lo más normal es secuenciar grupos de genes (6 genes para cáncer de mama)

.
Mutaciones somáticas en otros genes: TET2, CBL, EZH2, DNMT3A y ASXL1, presentes en
una porción de casos de neoplasias miecroprofilerativas, pero estos pueden co-ocurricon
mutaciones JAK12 y M PL (se encuentran en todos los tipos de cánceres mieloides).

Las técnicas de secuenciación NGS son de bajo costo y permite secuenciar completamente la
secuenciación completa del genoma de una bacteria en 2 hs y ver específicamente qué gen
de virulencia y resistencia tiene codificado.

Bacterias intracelulares con aplicación secuencial inmediata:

Detección de microorganismos lentos: Se analizan por separado porque tienen requerimientos

especiales:
En Tuberculosis hay varias plataformas de biología molecular.

Treponema Pallidum, para diagnóstico de sífilis.

Gérmenes de crecimiento difícil gastro interinos,

infrecuentes o medios con los que no se cuentan.
Hay agentes que no se encuentran en la región por
lo que no se compran reactivos. Entonces se utiliza
biología molecular para identificación.

Técnicas empleadas para diagnóstico de enfermedades bacterianas:

PCR como aplicación de BM express la PCR y sus variantes: (Rt-PCR, PRC tiempo real,
PCR. RFLP, PCR Nested, PCR multiplex, PCR loop). Reacción en cadena de la polimerasa.

Los análisis que permiten no solo validar el gen patógeno sino todo el genoma de la bacteria,
para poder identificar otras características como mecanismos de resistencia. Se realiza en
laboratorios especializados en eso y no se hace en todas las muestras solo las que se
necesite conocer más información para el tratamiento:

NGS: tecnologías creadas para secuenciar grandes cantidades de fragmentos de ADN en

paralelo, y poco tiempo. Tiene 5 pasos grandes segmentación del ADN del patógenos
analizar, marcaje del ADN, amplificación de los fragmentos y luego la secuenciación de los
fragmentos. Un software arma la estructura que tendría el patógeno a partir de los fragmentos.

Tipos de PCRs más utilizados:

PCR real time:

Cartucho del equipo para carga de patógeno específico (ej: tuberculosis). Cada módulo tiene
incluido una ultrasonicador para que realice la lisis de las células bacterias y se produzca la
liberación del ADN. El motor de pistón tiene un embolo que es la aguja de punción del
cartucho encargada de insertar la muestra y hacer las mezclas necesarias.

Tubo de amplificación: donde se produce la reacción en cadena de la polimerasa y debe

estar libre de ADN y por eso no se puede tocar con la mano cuando se hace la carga de la
muestra.

Tecnología de tiempo real, se amplifica el adn y te marca con

fluorescencia para poder hacer la detección en simultáneo.
No implica interfase húmeda, elimina la interferencia de
contaminantes ya que solo se debe cargar con buffer la muestra y
luego cargarla en el cartucho .
Sistema completo cerrado que tiene control interno de sus reactivos o necesita controles
externos implica menos error y técnica más controlada.

Software integrado para interpretación de datos, ve si hay o no amplificación y puede

cuantificar. Semi cuantificativo.

ADN diana:
Gene rpoB es una región RDR (81 pares de bases) responsable de más del 90% de las
mutaciones que son responsables de las resistencias.

Sondas diseñadas en 4 regiones diferentes del gen rpoB y otra sonda externa se une a otra
región del genoma que permite decir si hay o no el gen específico del patógeno y las otras 4
indican si es la cepa salvaje o no. La cepa no salvaje es la que no tiene el gen de la
resistencia.

Cuando las 4 sondas encuentran la cepa salvaje, indicamos que no estamos frente a
tuberculosis resistente a rifampicina, estamos frente a mycobacterium tuberculosis cepa
salvaje sensible a rifampicina. Cuando no las encuentra indicamos que estamos frente
mycobacterium tuberculosis resistente a rifampicina. El software entonces informa esto mismo

Los molecular beacons son sondas las 5 sondas con molécula fluorescente en el extremo que
permite hacer la lectura de la detección y amplificación del ADN.

Existen múltiples cartuchos desarrollados para múltiples patógenos específicos, por ejemplo
enfermedades de infecciones intrahospitalarias resistentes, infecciones críticas,
oncológicas/genéticas, salud sexual, virología.

Controles internos:

Dos tipos: 1- PCC (control de inspección de sonda) mecánico, de funcionamiento evalúa la

velocidad de respuesta de cartucho frente a diferentes temperaturas. Previo a arrancar evalúa
las presiones (si está dañado, abierto) evalúa fluorescencia (si no fue protegido luz). Hace 4
lecturas de fluorescencia distinta hace el promedio y si da dentro de un rango aceptado valida
o no al cartucho. Si el PCC falla no se procesa la muestra y la expulsa.Pasa también con
muestra viscosas que no fueron bien diluidas por buffer.

2- SPC (control de amplificación completo):

a partir de esporas no infecciosas de la
bacteria bacillius giobigii. Cada cartucho
tiene las esporas verifica que haya
amplificación más allá de que el tets sea
positivo o negativo. Si el control no
funciona pero da negativa la muestra no
puedo confirmar que esté correcta, pero sí
se valida cuando la muestra da positiva.

PCR multiplex: no se utiliza para un proceso infeccioso en particular, sino que tiene múltiples
paneles desarrollados para múltiples genes ya sea virus,bacterias, etc. Se utiliza para
detección que afecta a un parénquima general (ejemplo síntomas respiratorios, digestivos).

PCR anidada, puedo de manera simultánea buscar varios fragmentos de ADN (bacterias,
virus, levaduras, parásitos y/o gérmenes resistentes a antibióticos). Es una técnica integral, el
equipo se encarga de hacer todo. Está diseñado en paneles sindrómicos, es decir realizar
diagnóstico de un proceso infeccioso con varios gérmenes.

Cada panel autónomo tiene la capacidad de

almacenar todos los reactivos necesarios para llevar
a cabo la extracción, purificación de ARN/ADN,
amplificación y detección.

El equipo extrae el ADN lo purifica y el equipo hace

2 PCR, por eso se la llama anidada, esto consigue
mayor sensibilidad especialmente se necesita en
estos casos que se procesa grandes cantidades de ADN, se buscan
múltiples genes de distintos gérmenes al mismo tiempo, la carga de
ADN es importante la segunda PCR sirve como depuración para
aumentar la sensibilidad, evitando interferentes que den valores
incorrectos.
En la PCR 1 evaluar grandes cantidades de ADN y la PCR 2 analiza
productos específicos detectados en la PCR 1 para cada gen específico.

Al ser simbólico analiza múltiples patógenos a la vez permitiendo identificar varías causas de
enfermedad en un solo análisis:
 Los más importantes son los estreptococos por ser los más
frecuentes.

Panel respiratorio

Panel gastrointestinal
Lo importante de este test es
que en BM permite identificar y
diferenciar la E. Coli, puedo
informar el tipo específico.

Importante para epidemiología para dar seguimiento al patógeno que está afectando a un
grupo de personas. Es de gran ahorro también porque en un solo tests podés tener gran
cantidad de información y no separarlo en varios estudios más inespecíficos y que llevan
tiempo.

Enfermedades asociadas a
la asistencia sanitaria.

Me interesa encontrar genes de resistencia y todos agentes etiológicos de bacteriemias que

derivan a sepsis. Son importantes en las que hay una urgencia superior y sé que tengo mayor
probabilidad de encontrar las resistencias y necesito conocerla específicamente para tratarla.

Todo lo que conlleva una larga paraclínica para identificar una patología en específico, como
neumonia atípica, puede realizarse con un solo análisis en un mismo panel puedo identificar
los gérmenes de una neumonia, típica, atípica, viral y además los mecanismos de resistencia
asociados a las neumonías hospitalarias. Con una sola muestra respiratoria y en pocas horas.
Hemostasia

Hemostasia: mantiene la integridad de la pared vascular, evita la pérdida de sangre ante una lesión
vascular y restablecer el flujo sanguíneo cuando se ha reparado la lesión.

Hay 4 componentes involucrados, actúan de manera localizada, amplificada y modulada: sistema

vascular, plaquetario, coagulación y fibrinolítico (rompe coágulo que se formó.

Ante una lesión vascular: vasoconstricción local (para evitar pérdida de sangre y se acumulen las
células que necesitamos para reparar el daño). La exposición de moléculas adhesivas cómo el
colágeno, el factor de Von Willebrand, otras proteínas activan la agregación plaquetaria. Esto genera la
liberación de factores procoagulantes para la formación de tapón plaquetario o tapón hemostático
primario. La exposición de factor tisular inicia el proceso de coagulación formando la malla de fibrina, la
cual junto a otras proteínas y elementos sanguíneos forman coágulos de fibrina o tapón hemostático
secundario.

En simultáneo con la formación del coágulo de

fibrina, se inicia la reparación del tejido dañado.
Se libera del endotelio activadores del
plasminógeno, lo que inicia la activación del
sistema fibrinolítico, destruyendo el tapón que se
había formado restableciendo el flujo sanguíneo
cuando el tejido esté reparado ante un
desbalance de cualquiera de los componentes,
aumenta el riesgo de las manifestaciones
hemorrágicas o trombóticas.

Fibrinolisis -> recuperó el flujo sanguíneo

normal.
Vasoconstricción, formación del tapón
plaquetario, formación de la red de fibrina,
cascada de la coagulación, coágulo formado, fibrinolisis.

Muchos factores están involucrados (plasmáticos, proteínas que la activan en forma de cascada, etc).

La HR no presenta ninguna alteración visible con métodos citogenéticos y el análisis a nivel molecular
es difícil debido al gran tamaño del gen, a su compleja organización genómica y a la heterogeneidad
alélica detectada en los distintos individuos. En la actualidad se han reportado 65% de mutaciones
puntuales, 28% de deleciones y 6% de inserciones. (Se insertan en nucleótidos según la zona es la
repercusión). Hay varios modelos de diagnóstico molecular de esta patología. Desde la PCR-RFLP
hasta secuencias del genoma completo.
Diferentes enfoques de diagnóstico de HA: Escoger un gen de prueba. El análisis dirigido para el intrón
22 o la inversión del intrón 1 la cual se realiza con frecuencia en: -Individuos con HA grave

-mujeres con antecedentes familiares de HA grave

-mujeres con antecedentes familiares de HA de gravedad desconocida

El análisis de secuencias del gen FB seguido de un análisis de deleción/duplicación está dirigido

en caso de que no se detecte la inversión del intrón 22 o la inversión del intrón 1.

Panel multi-gen: Incluye FB y otros genes de interés. Debe confirmarse la capacidad de los
paneles para detectar variantes estructurales en el gen de FB, una causa común de HA.

Pruebas genómicas exhaustivas, secuenciación del exoma y secuenciación del genoma se puede
considerar si una sola serie de genes de prueba (o el uso de un panel multi-gen que incluye FB)
falla para confirmar un diagnóstico de un individuos con las características de HA.

Diagnóstico de HB: El gen de la FA muestra una gran heterogeneidad mutacional. Entre las más
comunes se encuentran las mutaciones puntuales que ocupan el primer lugar de las transiciones
seguidas de las transversiones. En este caso la secuenciación es un método accesible por el
tamaño de sus regiones codificadora y promotora correspondiendo a 2,2 Kb donde se localiza
más del 90% del total de las mutaciones causantes de HB.

Patologías de la hemostasia
• Coagulopatías: caracterizadas por sangrados con deficiencias en la activación de alguno
de los factores de la coagulación
o Hemofilia A
o Hemofilia B
o Enfermedad de von Willebrand

• Trombofilias: caracterizadas por formación de trombos, sin recuperación natural del flujo
sanguíneo normal
o Factor V de Laiden
o Mutaciones en Factror II
o Mutaciones en el gen de la tetrahidrofolato reductasa (MTHRF)

Trombofilias
• La enfermedad tromboembólica abarca la trombosis venosa y la embolia pulmonar
• Tiene una incidencia anual de aproximadamente uno cada 1.000 habitantes.
• La identificación de los pacientes con riesgo aumentado de desarrollar complicaciones
tromboembólicas y el tratamiento profiláctico apropiado deben contribuir a disminuir la
morbimortalidad relacionadas.
• La trombofilia es una anomalía de la coagulación que aumenta el riesgo de trombosis. Puede
ser hereditaria o adquirida.
o Hereditaria
• Trombofilia genética: presencia de mutaciones en la secuencia de ADN que codifica
proteínas del plasma sanguíneo.
• Trombofilia plasmática: por deficiencia en los anticoagulantes naturales del cuerpo o los
reguladores de trombina en el plasma.
o Adquirida
• Dada por factores diversos como enfermedades o agentes externos al cuerpo

Trombofilia hereditaria
• Mecanismos propuestos
- Pérdida de función
- Deficiencia de antitrombina
- Deficiencia de Proteína C
- Deficiencia de Proteína S
• Ganancia de función
- 1-Factor V Leiden
- 2-Protrombina G20210A
- 3-Alto nivel de FVIII

1-Factor v leiden
• El Factor V Leiden es el factor de riesgo genético más frecuentemente encontrado en las
trombosis venosas.
Corresponde a una mutación en el gen del factor V, que determina una resistencia a la
actividad anticoagulante de la proteína C activada.
• Polimorfismo de simple nucleótido (SNP) en la posición 1691 del gen que codifica para este
factor V, 1691G>A. Este polimorfismo genera un cambio de aminoácido en la proteína
p.Arg506G .
• La incidencia encontrada en pacientes con trombosis venosa es de 20%

2-Protrombina g20210a
• La variante alélica protrombina 20210A es una mutación en el gen de la protrombina
asociada a un aumento de la concentración plasmática de protrombina.
• Polimorfismo de simple nucleótido en la región 3`UTR (región no codificante) del gen de la
Protrombina. Sustitución G>A en la posición 20210.
• Se ha observado una incidencia de 18% en pacientes con historia familiar de trombosis,
mientras que en sujetos sanos es de aproximadamente 2%.

Hemofilia: Las hemofilias A y B son los principales trastornos hemorrágicos hereditarios ligados al
cromosoma X que se presentan debido a mutaciones en los genes del factor VIII ( Hemofilia A,
HA) y factor IX (hemofilia B, HB), ocasionando una diminution deficiencia funcional de estas
proteínas en plasma provocando falla en la coagulation Representa una incidencia de de
1-5000(HA) y 1-30000 (HB) niños nacidos vivos. Desde el punto de vista clínico son
indistinguibles, pues las 2 proteínas participan en el mismo paso de formación de la malla de
fibrina.

Diagnóstico molecular de hemofilia. Es importante determinar al estado de portadoras en las

mujeres de familia con antecedentes de HA o HB (si son heterocopotas un cromosoma X presenta
fallas pero a otro no pueden no presentar síntomas pero los hijos que heredaron ese cromosoma
X con falla son quienes van a presentar problemas de coagulación). Pueden acceder a
alternativas de reproducción para disminuir o desaparecer la H en la descendencia.

Diagnóstico prenatal mediante muestreo de vellosidades coriónica (sem 10-13) a amniocentesis

(sem 15-16) con el fin de iniciar un manejo terapéutico desde una edad temprana. Acompañado
de la determination del sexo, si es femenino no importa, si es masculino si porque pueden ser
portadores de la enfermedad.

Electroforesis del gen de agarosa. Normal homocigota-heterocigota.

A: para Factor V Leiden normal vamos a tener 3 fragmentos, en la mutación (hom)x pierdo un sitio
de corte y me quedo con dos fragmentos. Si tengo (het) uno de los cromosomas tiene la mutación
y en otro no, veo 4 bandas.
B: protrombina 2021A: normal, tengo 1 solo fragmento cuando está mutado para hom voy a tener
dos fragmentos y en el caso de het, tres fragmentos.

PCR en tiempo real: hay diversos protocolos para el estudio de estas dos mutaciones usando pcr
en tiempo real: se utilizan sondas que hibridan con la zona donde se encuentra la mutación y se
analizan más curvas de fusión para los productos de PCR.

Si el paciente es homocigota para el gen sin mutación, se va a observar una sola curva (roja). Va
a ser a mayor temperatura porque esa sonda se une con la zona exactamente y para reparar
necesitamos mayor temperatura.
Si es homocigota para la mutación la unión no es exacta, hay un nucleotido que no pega
exactamente, la unión no es tan buena, a menor temperatura ya vamos a poder separar la sonda
del fragmento, se ve una sola curva (verde).
Si es heterocigota se ven 2 curvas (negro o azul)

Todas las muestras son heterocigotas para la mutación.

Puede presentarse alguna otra mutación que no la veo a simple vista y necesito hacer
secuenciación de los fragmentos. Se toma como heterocigota porque no son "normales", no tengo
una sola curva ni todas iguales las muestras.

Detección mediante rflp pcr

• Factor V Leiden:
La digestión del producto de amplificación origina fragmentos de 25, 37 y 85 pb cuando A está
presente en la posición 1691 (alelo normal) mientras que la sustitución por una G en esta
posición (alelo mutado) produce dos fragmentos de 25 y 122 pb, se pierde un sitio de corte
para la enzima MnlI

• Protrombina 20210A
El alelo normal carece de sitio de restricción
HindIII y, por tanto, se observa en el gel de
electroforesis un solo fragmento de 345 pb. En
el caso de presentar un alelo mutado, éste
origina un nuevo sitio de restricción
determinando la producción de dos fragmentos
de 322 pb y de23 pares de bases después de la digestión enzimática:

Diagnostico molecular de factores protrombóticos: primeros casos de factor V Leiden y

protrombina 20210A en uruguay:

PCR en tiempo real

• Hay diversos protocolos para el estudio de estas dos mutaciones utilizando PCR en tiempo
real.
• Se utilizan sondas que hibriden con la zona donde se encuentra la mutación o se analizan
las curvas de fusión para los
productos de PCR.

Análisis de las curvas de fusión

si el paciente es homocigota para el gen

si mutación se va observar una sola
curva (roja) si es homocigota para la
mutación se ve una sola curva
(verde) si es heterocigota se ven 2 curvas
Epidemiología molecular: emplea métodos de biología molecular para identificar subtipos
bacterianos y establecer relaciones entre aislamientos.

Métodos de tipificación basados en variaciones genotípicas: desde técnicas basadas en

PCR hasta análisis del genoma bacteriano completo (tipificaciones moleculares).

Distribución temporal/espacial:

Epidemiología local o a corto plazo: Estudio en una población dada durante un tiempo
determinado para saber si mi cepa en estudio se distribuyó. Nos permite diferenciar entre
una cepa que forma parte de un brote y otras que no están relacionadas.

Tengo una cepa índice (todas las bacterias de una especie que comparten un origen
común).

Al cabo de 3 semanas esa cepa se distribuyó y contagió a diferentes personas generando

un brote (casos secundarios de ese primer caso índice).

Epidemiología global o a largo plazo: define las relaciones de los clones que causan
brotes en diferentes países y/o tiempos o décadas diferentes.

Ej:- Neumococos resistentes a penicilina aislados en diferentes países del mundo.

- MRSA aislados en Sudamérica desde 1990.

Para la epidemiología global

necesitamos comparar
resultados de diferentes
laboratorios los cuales suelen
usar distintos métodos y aun
cuando usen el mismo es
difícil comparar.

Métodos de tipificación según

lo que se quiera saber:

Depende de la pregunta que se quiera responder:

RFLP: se amplifica un gen que sea conservado dentro de un grupo bacteriano, ver si
tiene un corte o no con enzimas de restricción para poder ver su polimorfismo. Si son
todos iguales podemos decir que se trata de un brote y si son todos diferentes no serían
un brote.

PFGE: Electroforesis en la que estudia el genoma completo de la bacteria.

REP-PCR: Utiliza un cebador que amplifica secuencias repetitivas que están en el ADN y
según cuantas veces amplifique veremos si se repite más o menos veces.

MLST: Multilocus secuenciating.

WGS: Secuenciación de genoma completo.

Caracterización molecular de N. Meningitidis:

El patógeno primario afecta el sistema nervioso central e infecciones diseminadas.

Secuenciación de fragmentos variables de proteínas de membrana externa porA y porB

para determinar genotipo y genosubtipo de la bacteria.

Secuenciación de los genes que codifican para otras proteínas de membrana fHbp, fetA,
NHBA, nadA, etc.

Por secuenciación de regiones variables de múltiples locus (MLST).

Electroforesis de campo pulsado PFGE para el estudio de brotes.

Tipificación de N. Meningitidis:

Membrana externa: Bacteria gram negativa.

Polisacárido capsular que determina que serogrupo tiene B-C, W son los más
importantes a nivel local. A nivel mundial es el A.

PorA determina el genosubgrupo.

PorB determina el genotipo.

Los diferentes serogrupos van variando en el tiempo.

Vigilancia laboratorial de enfermedad meningocócica en Argentina.

Enfermedad meningocócica por NmW (meningo W):

- 2000: Arabia Saudita. Epidemia por serogrupo W relacionada con la peregrinación a

la Mecca (Cepa Hajj 2000).

- 2000 y 2001: Casos de infección por el mismo serogrupo en varios países de

peregrinos que volvían y en sus contactos.

- 2002: Primera gran epidemia por W en Burkina Faso (13000 casos, 1400
defunciones).

Cepas: W

Genotipo: 2a

Genosubtipo: 1, 5, 2

Secuenciotipo: 11

Y varias variantes, todas igual a la de la Mecca.

Tipificación mediante MLST (tipificacion multilocus de secuencias):

El MLST se basa en amplificar por PCR 7 genes de enzimas o proteínas que están
presentes en todas las cepas de esa especie (constitutivos). Conservados dentro de la
especie pero con variaciones de alelos.

Cada cepa tiene un perfil alélico único, es una combinación de 7 genes. Cada
combinación se denomina secuentipo. Cada clon tiene sus secuenciotipos.

Análisis de secuencias de MLST:

Gen abcZ (arriba) y gen pdhC (abajo),son dos genes que se utilizan para secuenciar el
MLST. Hice PCR y secuencie con Sanger para ver en qué orden tengo las bases
nitrogenadas. Cada pico representa una base nitrogenada, esto se presenta en una base
de datos para saber qué número de alelos hay del gen abcZ y del gen pdhC.
Clones de NmV circulando en Sud América:

Los secuenciotipos se van a determinar con un número, por ejemplo ST-11.

ST-11 va a tener una combinación de los 7 alelos, a veces cambiando un solo alelo ya me
da otro secuenciotipo. Esos secuenciotipos que están relacionados porque varían en uno
o dos genes se engloban en lo que se llama COMPLEJO CLONAL.

El complejo clonal ST-11 constituye un grupo de meningococos íntimamente relacionados

que incluye los serogrupos B, C y W. Es particularmente virulento con altos niveles de
morbimortalidad.

Secuenciotipo de NmW:

Hay secuenciotipos muy similares que difieren en un solo alelo, se agrupan y forman
complejos clonales. Dentro de cada uno hay un secuenciotipo inicial característico que es
el que nomina al complejo clonal.

El complejo clonal ST-11 constituye un grupo de meningococos relacionados que incluye

los serogrupos B, C y W. Es particularmente virulento con altos niveles de
morbimortalidad. Desde 2003 se ha incrementado la enfermedad endémica por W:ST-11
en Sudáfrica y Brasil seguido por Argentina y Chile que alcanzó una letalidad de 28%. Los
aislamientos circulantes en Argentina son en su mayoría W: 5, 2; ST-11; F1-1.

Los esquemas de tipificación de rutina (PorB, PorA y MLST) no muestran diferencias

entre las cepas aisladas en enfermedad invasiva en Argentina con las cepas del clon Hajj.
Esto puede llevar a identificarlas como pertenecientes al mismo clon. Por secuenciación
del genoma completo se encontró que la cepa W:ST-11 provocadora de enfermedad en
Sudamérica (2008) es distinta a la cepa Hajj (2000).
Este es un Árbol filogenético que analiza la secuencia de los genomas completos de
muchas cepas de una bacteria. Cuanto más cercanos están los puntos más parecidos
son, mientras que si están lejos son diferentes.

PFGE: Electroforesis de Campo pulsado (Macrorrestricción):

Otro método para analizar

epidemiología a corto
plazo.

Usa enzimas de
restricción igual que en
RFLP-PCR.

Estudia todo el genoma

de la bacteria y según qué
bacteria sea tengo una
enzima de restricción que
sea de corte poco frecuente (tenga pocos sitios para cortar en ese genoma).
Hago electroforesis, tengo 3 frentes diferentes, 3 polos negativos y 3 polos positivos.
Hago Correr la electricidad en diferentes secciones de polo a polo (efecto tamiz), corre
12, 18, 24 horas hasta llegar al resultado.

PFGE

CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE GELES DE PFGE:

Comparo diferentes cepas, los patrones de banda de ellos.

B: Hay una inserción en el fragmento de genoma, tengo fragmentos más grandes por lo
que aparece más arriba.

C: Deleción del fragmento, está más abajo porque le falta un pedacito.

D: Ganó un sitio de restricción por una mutación, la banda original se convierte en 2 más
chicas.
E: Perdió un sitio de restricción, 2 bandas desaparecen y tengo una más grande arriba.
(Cuando pierdo sitio de corte queda más arriba)

Criterios para la interpretación de geles de PFGE según Tenover:

CASO: Portación vaginal y sepsis neonatal por Streptococcus pneumoniae:

Descriptos dos casos en Argentina.

Streptococcus pneumoniae es una causa infrecuente de sepsis neonatal.

La transmisión vertical, asociada a la portación vaginal materna y/o a la endometritis tiene

un rol muy importante en esta patología.

Para ambos casos se realizó:

- Serotipificación capsular por Quellung

- Tipificación molecular mediante PFGE con la enzima de restricción SmaI.

Entre madre e hijo en ambos casos por la electroforesis veo que se trata de la misma
cepa.
Aplicaciones forenses:

La Genética forense es una especialidad de la Genética que incluye un conjunto de

conocimientos de Genética necesarios para resolver ciertos problemas jurídicos
(paternidad, crímenes,etc).

Los tipos de pericia más solicitados al laboratorio de Genética forense por los tribunales
son casos de investigación biológica de la paternidad, pericias de criminalística biológica
(estudio de vestigios biológicos de interés criminal como manchas de sangre, esperma,
pelos, etc.) y, finalmente, problemas de identificación.

Las pruebas genéticas son sensibles y poderosas comparado a análisis de huellas

dactilares, la determinación de marcadores genéticos clásicos como grupos sanguíneos
(AB0, Rh, etc.), o la declaración de un testigo podían ser determinante para inculpar a
alguien como responsable de un delito.

En 1985 el Dr. Alec Jeffreys logró la identificación mediante el ADN al obtener un patrón
de bandas (parecido a un código de barras) al que denominó huella genética o huella
digital del ADN (del inglés, DNA fingerprinting) teóricamente único e irrepetible. A esta
técnica se le denominó RFLPs (del inglés, restriction fragment length polymorphisms) por
el uso de enzimas de restricción o MLPs (del inglés, multilocus probes) por emplear
múltiples sondas para detectar varias secuencias del genoma. Aunque estos marcadores
fueron ampliamente usados, al poco tiempo fueron sustituidos por las sondas de locus
único (SLPs, single locus probes).

Sin embargo, muchas de estas evidencias tenían un bajo potencial discriminatorio, o no

permitían determinar sobre un razonamiento lógico el valor probatorio de las mismas. •
Las pruebas genéticas llenaron parte de ese vacío, al ser lo suficientemente sensibles y
poderosas, con la posibilidad de estimar el nivel de incertidumbre de los resultados como
prueba incriminatoria.

Muestras: saliva, sangre, semen.

Se extrae el ADN, lo corto con enzimas de restricción, se realiza la electroforesis para

comparar bandas. Luego se transfiere a una membrana de hibridación, se hibridan con
sondas y reveló con ej: radiografía. Observó bandas (huellas genéticas).
Luego del desarrollo de la PCR K Mussis 1983:

Se implementan secuencias variables de menor tamaño (con poco ADN tengo muchas
copias para estudiar), particularmente los microsatélites o STRs (del inglés, short tandem
repeats) busco en el genoma secuencias que se repiten varias veces y son las que
estudia. Por su pequeño tamaño, los marcadores STRs se podían amplificar fácilmente
ofreciendo mayor robustez y sensibilidad ya que permitían obtener resultados a partir de
cantidades mínimas de ADN molde (0.5 a 1 ng). Hoy en día también se utilizan mini STR
que amplifican regiones más pequeñas en muestras muy degradadas.

STR:

Los marcadores más empleados

para realizar una prueba de ADN
son los microsatélites,
repeticiones cortas en tándem o
STRs. Los STRs se componen
de secuencias repetidas cortas (Ej: GATC) que dan lugar a diversos alelos que se
nombran por el número de veces que se encuentre la secuencia repetida (Ej: El alelo tres
presentará tres veces la secuencia GATC (es decir, GATC, GATC, GATC), con la misma
lógica para todos los alelos.

En la población podrían existir los alelos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, etc., y un número aún
mayor de genotipos (por ejemplo, 6/6, 6/7, 6/9; 7/7, 7/9, 10/12, etc).

Para cada gen o STR que estudie voy a tener diferentes alelos y diferentes genotipos.
Los STR los estudio de a 4 nucleótidos en su mayoría.

TH01, FGA, D21511 son los STR.

Según como se repiten, es el número del alelo.

ESTUDIOS DE FILIACIÓN:

Cada ser humano va a tener 2

alelos. Los hijos pueden tener
todas las combinaciones de los
alelos de los padres (genotipos
disponibles). Es importante
estudiar a ambos padres
además de al hijo. Hay que
tener en cuenta la posibilidad de
encontrar ese perfil genético en
la población general. Por azar
pueden haber personas que no
estén relacionadas y tengan el
mismo alelo en alguno de los STR. Se debe tener en cuenta que puede encontrarse una
mutación en el hijo por lo que algún STR no sea igual a ninguno de los progenitores. Una
vez que se han comparado los perfiles del hijo/a con los del supuesto padre y hay dos o
más STR en que no se observan alelos que tengan el mismo número de repeticiones, se
excluye la paternidad y no se requiere realizar ningún cálculo probabilístico.
FIGURA: Perfil genético de un individuo.

El tamaño (pb) de cada alelo (pico) y el STR que representa se muestra en la parte
superior (gris). Debajo de cada pico se indican los alelos para cada STR. Para
amelogenina se muestra el genotipo XY (varón). La medida del pico en RFUs se muestra
en el eje de las Y. Se observa la presencia de algunos stutters (pequeños picos a la
izquierda de algunos alelos).

El gen Amelogenina codifica

para una proteína presente
en el esmalte dental. La
particularidad de este es
que presenta una deleción
de 6pb en el cromosoma X
lo que permite distinguir
entre sexos. Si es XX tengo
un solo pico y si es XY
tengo dos picos.

Mediante un
electroferograma que
consiste en un gráfico que muestra la cantidad de fluorescencia emitida en función del
peso molecular podemos saber si nos encontramos ante un individuo XX o XY.

Comparación de perfiles genéticos:

Una vez obtenidos los perfiles genéticos, estos deben ser sometidos a un riguroso
proceso de revisión e interpretación. Inicialmente destaca la revisión de controles
negativos (sin ADN) y positivos (ADN conocido), para detectar una posible contaminación
y para confirmar que la amplificación por PCR fue correcta.

Es conveniente revisar la posible ganancia de alelos (drop-in) o pérdida alélica (drop-out),

los cuales son más frecuentes en muestras degradadas o con cantidades mínimas de
ADN, lo que ocasiona resultados estocásticos o azarosos que no son reproducibles y no
representan el verdadero perfil genético.

Una vez verificada la rigurosa observancia de los procesos de gestión de calidad a los
que todos los laboratorios de genética forense deben apegarse se realiza una
comparación para verificar la concordancia entre perfiles genéticos, y establecer si un
individuo inculpado es la fuente u origen de una evidencia biológica encontrada en la
escena de un crimen o confirmar la filiación entre individuos.