Código: MFO-RG-014

CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ Fecha: 15/12/2017

MACROPROCESO MISIONAL
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PLANTILLA GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO Versión: 2

PROGRAMA NOMBRE DEL CURSO

Tecnología en Regencia de
Fitoquímica
Farmacia

PRACTICA No NOMBRE DE LA PRACTICA DURACIÓN EN HORAS

3 Técnicas cromatográficas 04

1. INTRODUCCIÓN:

La cromatografía es una técnica de separación de los componentes de una mezcla, basada en la

velocidad de desplazamiento diferencial de dichos componentes. La separación se lleva a cabo cuando
los componentes de la mezcla son arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa), a través de un
lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria (liquida o solida). Así las moléculas más afines
con la fase móvil, serán eluidas con mayor facilidad y rapidez, que las que son afines con la fase
estacionaria, que tenderán a permanecer un mayor tiempo en ella.

2. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA:

 ¿En qué consiste la cromatografía en capa fina y la cromatografía en columna? ¿Cuál es el

fundamento de las técnicas? ¿Cómo se llevan a cabo desde el punto de vista práctico?
 ¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía de tipo analítica y la cromatografía de tipo
preparativa? ¿De qué tipo es la cromatografía en capa fina y la cromatografía en columna?
 ¿Qué es la fase móvil y la fase estacionaria? ¿Qué es la serie eluotrópica y cómo incide en la
cromatografía? ¿Cómo se prepara una fase móvil para cromatografía? ¿Qué es elución isocrática
y qué es elución por gradiente?

3. OBJETIVOS:

Para la práctica cada estudiante debe plantear un objetivo general y al menos dos específicos.

4. MATERIALES Y REACTIVOS:

MATERIALES
AGITADOR GRADILLA PARA TUBOS DE PIPETEADOR
CÁMARA CROMATOGRÁFICA HEMÓLISIS PROBETA GRADUADA DE 10 mL
COLUMNA PARA MANGUERA DE CAUCHO PROBETA GRADUADA DE 100 mL
CROMATOGRAFÍA O BURETA MICROESPÁTULA SOPORTE UNIVERSAL
CHURRUSCO PINZA DE TRES DEDOS CON NUEZ TUBOS DE HEMÓLISIS
EMBUDO ANALÍTICO (PARA COLUMNA O BURETA) VASO DE PRECIPITADOS 50 mL
ERLENMEYER 100 mL PIPETA GRADUADA DE 5 mL VASO DE PRECIPITADOS 100 mL
FRASCO LAVADOR PIPETA GRADUADA DE 10 mL VADO DE PRECIPITADOS 250 mL
VIDRIO DE RELOJ
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REACTIVOS
ÉTER DE PETRÓLEO SÍLICA PARA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
ACETATO DE ISOPROPILO REVELADOR DE VAINILLINA
ETANOL

5. PRECAUCIONES:

Para el preinforme el estudiante debe realizar las fichas técnicas de cada uno de los reactivos, teniendo
en cuenta riesgos, precauciones y colector de desecho.

Por grupos de laboratorio deben traer a la práctica algodón, papel aluminio, 3 palos de pincho, toallas
de papel absorbente, tijeras, bisturí, regla, lápiz, pinza de precisión (depilador) y la porción del extracto
sin clorofila obtenido en la práctica anterior.

6. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Cromatografía en placa fina:

 Preparar las fases móviles que se describen en la tabla y adicionarlas en una cámara
cromatográfica o vaso de precipitados, de manera que la altura del solvente en el recipiente sea
inferior a 1 cm. Tapar el recipiente lo mejor posible, si es necesario con ayuda de papel aluminio
en el caso de los vasos de precipitados.
 Dejar reposar la cámara cromatográfica por lo menos 20 minutos antes de ingresar las placas.
 Tomar cuatro placas cromatográficas de al menos 1,5 cm de ancho. Trazar sobre la placa una línea,
SUAVEMENTE sin perforar la fase estacionaria, a 1 cm de la base y a 0,5 cm de la parte superior
como se muestra en la figura 1.
 Con ayuda de un capilar para cromatografía, siembre repetidamente y con precaución de no
perforar la fase estacionaria, el extracto etanólico de la especie vegetal trabajada formando un
único punto en el centro de la línea de siembra (línea inferior).
 Deposite suavemente las placas sembradas en las cámaras cromatográficas preparadas y
saturadas previamente (use las pinzas de precisión). Tenga en cuenta que la altura del solvente
en el recipiente debe estar por debajo de la línea de siembra de la placa.
 Tapar nuevamente las cámaras cromatográficas y manténgalas completamente quietas en reposo
sobre una superficie plana. Esperar hasta que el solvente llegue a la línea trazada a 0,5 cm del
borde superior.
 Retire las placas suavemente con ayuda de las pinzas y déjelas secar a temperatura ambiente.

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 Revelar las placas con luz UV y vainillina. Para revelar con vainillina, ubique la placa sobre un trozo
de toalla absorbente y aplique vainillina desde una altura de 20 cm, en una zona ventilada y lo
más alejado posible del rostro. Caliente la placa en plancha de calentamiento hasta que se
muestren las manchas.

Tabla 1. Fases móviles para cromatografía en capa fina

No. cámara FASE MÓVIL
1 Éter de petróleo – Acetato de n-butilo 7:3
2 Éter de petróleo – Acetato de n-butilo 1:1
3 Acetato de n-butilo
4 Acetato de n-butilo – Etanol 8:2

Figura 1. Diagrama de la placa cromatográfica.

Cromatografía en columna:

 Analizar los resultados obtenidos en el procedimiento anterior y elija la fase móvil que ofrezca la
mejor separación de los componentes del extracto.
 Preparar 50 mL de la fase móvil seleccionada.
 Pesar 1 g de silica para columna en un vaso de precipitados. Agregue un poco de la fase móvil
preparada hasta humectar completamente la Sílica y formar una suspensión. Agite la suspensión
vigorosamente eliminando cualquier tipo de burbuja.

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 Agregar un pequeño trozo de algodón en la columna cromatográfica o bureta SECA, de manera

que se deposite en el fondo tapando la salida de la columna. Ubicar la columna en una pinza
sujetada a un soporte universal.
 Con ayuda de un embudo, agregar la suspensión en la columna manteniendo la llave de paso
abierta y recolectando el solvente en un Erlenmeyer. Agregue porciones de fase móvil hasta que
toda la Sílica gel se haya decantado en la columna y se observe una capa de solvente sobre esta.
En ese momento cierre la llave de paso y golpee la columna con una manguera de caucho
eliminando cualquier burbuja dentro de la columna.
 A 1 mL del extracto etanólico de la especie de trabajo agregar una pequeña cantidad de Sílica para
columna y secar con cuidado en un baño maría con agitación constante.
 Abrir la llave de paso de la columna y esperar a que el solvente baje al mismo nivel de la Sílica.
Cierre la llave y con ayuda del embudo SECO agregar la muestra impregnada en la columna, de
manera que se deposite sobre la capa de Sílica. De ser necesario use un poco de fase móvil para
bajar la muestra depositada en el embudo y en las paredes de la columna, siempre abriendo la
llave de paso para que el nivel del solvente se iguale al de la Sílica.
 Agregar en la columna el resto de la fase móvil preparada (incluyendo lo que fue recolectado
durante la preparación de la columna en el Erlenmeyer) y abrir la llave de paso para iniciar la
elución de la muestra.
 En tubos de hemólisis recolecte fracciones de 5 mL cada una, desde que comience a salir la
muestra de la columna.
 Escoja 3 fracciones (consulte al docente al respecto) y siémbrelas en una placa cromatográfica
con capilares limpios. Siembre también una muestra del extracto etanólico total. Corra la placa
cromatográfica en la misma fase móvil que utilizó para la columna y revele con luz UV y vainillina.
 Todos los residuos líquidos generados en el laboratorio deben desecharse en el colector de
solventes orgánicos sin halógenos.
 Los residuos de la Sílica, las placas cromatográficas y los residuos de papel filtro deben desecharse
en el colector de residuos sólidos contaminados.

7. SEGÚN EL DESARROLLO EXPERIMENTAL REALICE LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES:

Para la entrega del segundo avance del informe (informe final) en la fecha establecida, incluya en el
análisis de los resultados la respuesta a las siguientes preguntas.

 ¿Cuáles fueron las razones por las cuales se seleccionó una de las fases móviles utilizadas? ¿Cuál
fue la diferencia con respecto a los resultados de las demás?
 ¿Cuáles fueron los resultados en el “monitoreo” de la columna a través de CCF? ¿Se consiguió la
separación de forma adecuada de los metabolitos en el extracto?
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 Relacione los resultados de la cromatografía con los obtenidos en la marcha fitoquímica

preliminar. De acuerdo con la polaridad de los metabolitos ¿A qué correspondería probablemente
cada mancha en la placa?
 Consulte el fundamento de las técnicas de revelado (luz UV y vainillina). ¿Por qué se utilizan como
métodos de revelado?

8. BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA:

Domínguez, X. A., “Métodos de Investigación Fitoquímica”, Ed. Limusa, México, 1973. Capítulo 3.

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