CÓDIGO:

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090

VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
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FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO: BACTERIOLOGÍA
PROGRAMA: BACTERIOLOGÍA
DIPLOMADO EN DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
NOMBRE DEL CURSO:
TROPICALES
NOMBRE DE LA PRÁCTICA: ELECTROFORESIS Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. OBJETIVO

Obtener ácidos nucleicos óptimos en calidad y cantidad para ser utilizados en técnicas de diagnóstico
molecular de las enfermedades virales.

2. INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son macromoléculas polianiónicas uniformemente cargadas que pueden migrar
en un campo eléctrico.
La electroforesis a través de geles de agarosa o de poliacrilamida es el método estándar que se utiliza
para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. La técnica es simple, rápida de realizar y
permite la resolución de fragmentos de ADN que no se puedan separar adecuadamente mediante
otros procedimientos, como la centrifugación en gradientes de densidad. Además, tiñendo el gel
directamente con una baja concentración de bromuro de etidio BrEt (que es un agente intercalante
fluorescente), se puede determinar la localización del ADN dentro del gel.
Las bandas de ADN se pueden identificar por un examen directo del gel con rayos ultravioleta. Si
fuera necesario estas bandas de ADN se pueden recuperar del gel y usar para una gran variedad de
análisis.
Los geles de agarosa y poliacrilamida pueden variar en cuanto a forma, tamaño y porosidad. La
selección de las características de estos parámetros depende principalmente del tamaño de los
fragmentos que se quieren separar.

Diferentes moléculas tienen la capacidad de absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro
del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber
dependen de la estructura atómica, permitiendo así el estudio a nivel bioquímico de cualquier
molécula. Por tanto, como la absorbancia (cantidad de luz absorbida) es una función lineal de la
concentración, se puede calcular también fácilmente la cantidad de la molécula existente en una
muestra. Una sustancia absorbe una cantidad de radiación distinta a la que absorbe otro compuesto,
por lo que cada molécula tiene un espectro de absorción característico, que consiste en una curva que

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muestra la cantidad de energía absorbida (absorbancia) en cada longitud de onda del espectro
electromagnético.

El NanoDrop One es un espectrofotómetro UV-VIS de barrido espectral que mide la variación de la

absorbancia con la longitud de onda, que emplea solo una microgota y que permite la medición
rápida, fiable y reproducible de pureza de DNA, RNA y proteínas en volúmenes de microlitro,
mostrando todo el espectro para detectar impurezas.

3. PROCEDIMIENTO

3.1. ELECTROFORESIS
I. Preparación del gel de agarosa al 1.5%
1. Realice los cálculos para preparar 80ml de un gel de agarosa al 1.5% en buffer TBE 1X.
2. Mida 80ml de Buffer TBE 1X
3. Pese la cantidad de agarosa necesaria de acuerdo con el numeral 1.
4. Agregue la agarosa a los 80ml de buffer TBE, disuelva y lleve a calentar hasta ebullición, mezcle
constantemente.
5. Permita que enfrié a unos 60° C, por cada 100ml agregue 5 ul de solución de bromuro de etidio.
6. Vierta en la cámara de electroforesis previamente preparada.
II. Siembra de muestras en la cámara de electroforesis
7. Saque de la nevera las muestras de ADN extraidas en la clase anterior
8. sobre un pedazo de papel parafilm deposite 2ul del buffer de corrido, tome 5 ul de su muestra de
ADN mézclelo suavemente con el buffer de corrido.
9. Tome los 7ul de la mezcla de ADN y 2 ul de buffer de corrido y deposítelos en el pozo del gel de
agarosa que le corresponda a su grupo.
III. Corrido
10. 110v por una hora.
11. Visualice en el transiluminador, tome la respectiva foto.

3.2. CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Realizar blanqueo:
1. En la pantalla Inicio, seleccione la ficha de una aplicación, como Ácidos nucleicos, y toque un
nombre de aplicación como ADNbc o ARN.
2. Levante el brazo del instrumento y limpie los pedestales superior e inferior con una toallita
para laboratorio nueva.
3. Mida un blanco de agua:
o Pipetee exactamente 1 μl de agua desionizada (DI H2O) en el pedestal inferior y baje el brazo.
o Toque Blanco y espere a que termine la medición.
o Levante el brazo y limpie ambos pedestales con una toallita para laboratorio nueva.
4. Mida la solución tampón:
o Pipetee 1–2 μl de solución tampón en el pedestal y baje el brazo.
o Comience la medición de la muestra.
o Si Medición automática está activado, baje el brazo.

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o Si Medición automática está desactivado, baje el brazo y toque Medición.

o Espere a que termine la medición. El espectro resultante no debería variar más de 0,04 A
desde la línea base en la longitud de onda del análisis (260 nm para ácidos nucleicos y 280 nm para
proteínas). Si el espectro no cumple estos criterios, repita los pasos 2–4. Si el espectro continúa fuera
de las especificaciones, consulte Solución a problemas de blanqueo.
5. Cuando haya terminado el ciclo de blanqueo, toque Finalizar experimento.
6. Levante el brazo y limpie ambos pedestales con una toallita nueva.

Para medir ácidos nucleicos

1. En la pantalla Inicio, seleccione la ficha Ácidos nucleicos y toque ADNbc, ADNmc o ARN, según
las muestras que necesite medir.
2. Especifique una corrección de línea base si lo desea.
3. Pipetee 1–2 μl de solución blanco en el pedestal inferior y baje el brazo, o introduzca la cubeta
de blanco en el portacubetas. Sugerencia: Si utiliza una cubeta, asegúrese de alinear la trayectoria del
haz de la cubeta con la del instrumento.
4. Toque Blanco y espere a que termine la medición. Sugerencia: Si Blanqueo automático está
activado, la medición de blanco comienza automáticamente al bajar el brazo. Esta opción no está
disponible para las mediciones en cubeta.
5. Levante el brazo y limpie ambos pedestales con una toallita para laboratorio nueva, o retire la
cubeta de blanco.
6. Pipetee 1–2 μl de solución de muestra en el pedestal y baje el brazo, o introduzca la cubeta de
muestra en el portacubetas.
7. Comience la medición de la muestra:
o Pedestal: Si Medición automática está activado, baje el brazo; si está desactivado, baje el
brazo y toque Medición.
o Cubeta: Toque Medición. Cuando termina la medición de la muestra, aparecen el espectro y
los valores proporcionados (consulte la sección siguiente).
8. Cuando haya terminado de medir muestras, toque Finalizar experimento.
9. Levante el brazo y limpie ambos pedestales con una toallita nueva, o retire la cubeta de
muestras

4. EQUIPOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y/O COLECTIVA.

 Bata de laboratorio anti fluido manga larga

 Guantes de nitrilo
 Tapabocas
 Gorro
 Zapato cerrado
 Gafas de protección

5. MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS.

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TIPO DE RESIDUO DISPOSICIÓN FINAL

Elementos de protección personal Canecas rojas
 Guantes
 Tapabocas
 Gorro

6. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.

En los artículos asignados revise la metodología de extracción de ácidos nucleicos.

7. BIBLIOGRAFÍA

Marcos-Merino, José María, Gallego Rocío Esteban, Ochoa de Alda Jesús Gómez. Extracción de ADN
con material cotidiano: desarrollo de una estrategia interdisciplinar a partir de sus fundamentos
científicos. Educ. quím  [revista en la Internet]. 2019  [citado  2020  Oct  31] ;  30( 1 ): 58-69.
Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-
893X2019000100058&lng=es.  Epub 14-Oct-
2019.  https://doi.org/10.22201/fq.18708404e.2019.1.65732.

8. RECOMENDACIONES

 Revisar y cumplir con las normas establecidas en el Manual de Seguridad de Laboratorios

MIFN-001.
 Cuando se trabaja con productos químicos, siempre use una bata de laboratorio adecuada,
guantes desechables, y gafas de protección.
 No agregue soluciones con hipoclorito de sodio o ácido directamente a los residuos de
preparación de muestras. Las preparaciones de las muestras con buffers AL y AW1, contienen
clorhidrato de guanidina, compuesto caracterizado por ser altamente reactivo cuando se
combina con hipoclorito de sodio.
 En caso de que exista un derrame, limpiar con un detergente de laboratorio y agua. Si el
líquido derramado contiene agentes potencialmente infecciosos, limpie el área afectada
primero con detergente de laboratorio y agua, y luego con 1% (v/v) de hipoclorito de sodio.

 El reactivo de trizol contiene fenol (toxico y corrosivo) e isotiocianato de guanidina (irritante) y

puede ser peligroso para la salud si no se tienen las precauciones adecuadas. Evite contacto
directo con el TRIzol (piel, ojos o tracto respiratorio) puede causar quemaduras químicas sobre
el área expuesta. Cuando trabaje con TRIzol, hágalo en cabina de extracción siempre use
guantes, gafas de seguridad y bata.

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9. ANEXOS

No aplica

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