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VirSancho

PROTEÓMICA E INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

3º Grado en Biotecnología

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agraria

Universidad de Lleida

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 PEP – TEMA 1 Virginia Sancho Ochoa

TEMA 1 – EL ENLACE PEPTÍDICO Y LA SECUENCIA POLIPEPTÍDICA

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son moléculas formadas por aa unidos por enlaces peptídicos.

Una secuencia de aa da siempre una misma proteína de estructura nativa, su función dependerá de
los aa y su orden (estructura).

Hay 20 aa: L-alfa-aminoácido.

Pueden ser L o D, según si en la proyección de Fischer el grupo funcional está D o L (R o S). La cisteína
siempre es R. Tienen un grupo amino y un grupo ácido.

Los aa pueden ser: polares o apolares, con carga negativa (ácido) o positiva (básico).

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2. COMPORTAMIENTO ÁCIDO-BASE DE LOS AA

− Zwitterion: Ion de carga total neutra con cargas

aisladas.
− Anfotéricos: Los aa pueden comportarse como ácidos o bases.
− Pto isoeléctrico: En el que tenemos un zwitterion.
o pH ácido: Ganan protones y
tienen carga +.
o pH básico: Pierden protones
y tienen carga -.

En una curva de valoración, a pH 0 la

molécula tendrá dos protones y será +.
Conforme aumenta se pierde un protón (el
del ácido) y llegamos al pk1, quedando un
zwitterion. A pk2 se pierde otro protón y
queda con carga -.

Por debajo del pI el ácido esta desprotonado

y es el pk1. Por encima, la amina está
desprotonada y corresponde al pH pk2. La
cadena lateral tiene su propio punto de
cambio de protonación, pkR.

3. ENLACE PEPTÍDICO

El enlace peptídico es un enlace covalente de tipo amida. Las amidas no reaccionan en condiciones
normales. Puedes desnaturalizar una proteína y la secuencia se mantendrá. Se hidrolizan las proteínas
en condiciones extremas y concretas.

La secuencia se escribe de N-t C-t. En vitro de C-t N-t.

− Péptido: No tiene estructura fija ni dimensión 3D

− Proteína: Tiene una estructura tridimensional bien definida.

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Nomenclatura

El último aa (C) es el principal. A-G-S, Ala-Gly-Ser, alanilglicilserina.

Características

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
El enlace peptídico es un enlace resonante.
Los pares de e- no enlazantes pueden desplazarse hacia los dobles enlaces cercanos y preferiblemente
hacia donde haya átomos electronegativos.

Es un enlace sencillo que se comporta como doble enlace y no permite el giro del enlace. El equilibrio
entre isómeros trans y cis se encuentra desplazado hacia el trans, ya que son grupos voluminosos que
salen del C alfa, están más separados y no se molestan tanto.

Es considerado un dipolo permanente, un enlace polar sin carga neta. Al crear una proteína los
momentos dipolares se tienen que alinear.

4. REACTIVIDAD

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− Nucleófilo: Especie rica en e- que tiene pares de e- no enlazantes. Pueden ser ionizables o no.
− Electrófilo: Especie deficiente en e-.

El nucleófilo ataca con su par de e- al centro electrófilo y pueden formar un enlace covalente. En un
enlace peptídico, la amina (nucleófila) ataca al grupo ácido de otro aa.

Las cadenas laterales también pueden tener grupos nucleófilos y electrófilos. La serina y la treonina, al
tener alcoholes, se comportan como nucleófilos.

Reacciones del grupo carboxil

Los ácidos, tanto de los aa como de las cadenas

laterales, pueden hacer esterificaciones,
amidaciones y reducciones a alcoholes primarios.

Reacciones del grupo amino

Formación de bases de Schiff (reacción de

Maillar), acilación (el ácido está activado con un
Cl) que es con acilos o PITC (para determinar la
secuencia de proteínas) y la reacción con
ninhidrina (t. de Kaiser: para comprobar si
quedan aminas libres después de hacer
reacciones de unión de aa).

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Reacciones de cadenas laterales

1. Cisteína:

− Oxidación: Formación de un puente disulfuro que genera una cistina. Sirve para estabilizar la
estructura terciaria de la proteína mediante los grupos diol.
− Reacción iodoacetato: Con iodoacético derivamos con iodo a la cisteína, se forma un tioeter y
queda el azufre en medio de la cadena. Ya no puede formar puentes disulfuro.

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− Reacción ácidoperfórmico (oxidación): Se oxida el azufre y evitamos que se formen los puentes
disulfuro.
− Reactivo de Ellman: Es un test colorimétrico para detectar las cisteínas. Podremos conocer el
nº de cisteínas mediante la absorbancia. El TNB que resulta colora amarillo.

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No hace falta aprenderse esos compuestos raricos.

2. Lisina: formación de la base de Schiff.

3. Metionina: Bromuro de cianógeno: Para fragmentar péptidos de una proteína. El bromuro reacciona
con el C-t de una metionina. Provoca la
deslocalización de la molécula liberando el
derivado en la homolactona. Cuando hacemos esta
reacción corta por todas las metioninas si hay 3
metioninas quedan 4 fragmentos, uno con N-t y
otro con C-t. Es una fragmentación química, para la
secuenciación de proteínas.

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5. SÍNTESIS QUÍMICA DE PÉPTIDOS. LIBRERÍA COMBINATORIAL

Síntesis en fase líquida

La síntesis de péptidos en el laboratorio es de C-t hacia N-t.

Al adicionar el 2ºaa se une por C-t al N-t del 1º. El C-t del
1er r hay que protegerlo, porque si no se puede unir el
azul con azul, para ello hay que evitar reacciones paralelas,
ponemos en el ácido un grupo protector. En el grupo
amino del r2 ponemos otro grupo protector. Ahora el
grupo amino del r2 sí que tiene que reaccionar en la
siguiente adición de aa. El ácido del 1er residuo siempre está protegido.

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Los grupos protectores tienen que ser ortogonales entre sí, sus características de desprotección son
distintas, uno tiene que ser reversible. Se desprotegerán uno en medio acido y otro en básico. En la
imagen la amina del r2 está protegida por Fmoc, (protector que se puede desproteger en condiciones
básicas). El ácido del r1 protegido por un Dmab, que se desprotege en medio ácido. El protector Boc se
desprotege en condiciones ácidas. El Fmoc y el Boc son protectores de la amina, nos marcara el tipo
de química que usaremos en la síntesis del péptido, hay por tanto química Fmoc y química Boc.

Las cadenas laterales tienen grupos reactivos, tanto en ácidos como en aminas. Habrá que protegerlas
durante todo el proceso de síntesis por lo que se añaden protegidas. Estos protectores deben ser
ortogonales respecto a los de la amina, respecto del ácido depende. Si la cadena es lineal es
indiferente, pero si queremos hacer un péptido ramificado tendrán que reaccionar por las cadenas
laterales para que crezca una nueva secuencia. Tendría que ser ortogonal de la amina, del ácido y del
resto de cadenas ortogonales. Si queremos que el péptido sea cíclico, el N-t y el C-t formarán un
enlace peptídico, los protectores de las cadenas laterales serán ortogonales respecto a los dos
terminales, para poder desproteger únicamente los extremos y ciclarlos.

El 3er aa que se añade tiene el grupo acido libre y el amino protegido. El ácido se ha de activar, p.ej
con el PFP (no es un grupo protector). Hace que la reacción entre la amina y el ácido sea más rápida.

Cuando acabamos la 1ª reacción de acoplamiento de aa, haremos un TK. Será negativo ya que no hay
aminos libres si se ha producido el acoplamiento.

Después de liberar la amina hay que hacer otro TK y dará positivo. Sabremos que el grupo amino se ha
desprotegido. En f. líquida hay que medir la absorbancia para asegurarse de que el 100% de aminos
están desprotegidos. Cuando adicionemos el 3er aa haremos otro TK que dará otra vez negativo.

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La síntesis es, por tanto: acoplamiento- desprotección- acoplamiento- desprotección…

El inconveniente de la síntesis en la fase liquida es que después de cada reacción hay que hacer un
tratamiento para eliminar los reactivos de los pasos anteriores que hayan sobrado. Nos interesa un
proceso de purificaciones después de cada reacción. La síntesis en fase liquida es muy lenta. Hay que
trabajar con un exceso de reactivo limitado para que las purificaciones sean más sencillas.

Síntesis de fase solida (SPPS)

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La cadena peptídica que está creciendo está unida a un soporte solido insoluble al medio de reacción
(resinas). Por lo tanto, es más rápido, no hay que purificar (excepto al final). Las resinas suelen tener
forma de esfera. Tiene un linker (un brazo) que permite unir el ácido del aa a la resina. La resina actúa
como grupo protector.

Una vez unido el primer aa a la resina hay que desproteger el grupo amino para poder adicionar el
segundo aa. Es igual que el otro. Hay que hacer un pequeño lavado después de cada reacción. Cuando
hemos acabado todos los acoplamientos nos queda un último paso, la rotura de la unión del péptido
con el súper sólido y la desprotección de las cadenas laterales.

La síntesis en fase solida tiene una reactividad de la cadena que crece cada vez más lenta, por estar

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anclado al supe sólido. Además, con de la esfera pueden crecer N cadenas, dependiendo de la carga
de la resina.

Las resinas al estar secas hay que solvatarlas con el disolvente que usaremos en la reacción, el DMF. La
DMF es un medio que permite solvatar la resina de forma adecuada para que esta tenga más facilidad
de unirse al aa. Solvatar quiere decir inflar. Limpiamos la resina con disolvente que la hinchan y
deshinchan, así se limpia por dentro.

En la síntesis en fase liquida había que trabajar con un exceso de reactivos limitado (para purificar más
fácil), en fase solida puedes usar el exceso de reactivo que quieras.

Estrategia lineal: Es para hacer un péptido lineal. La SPPS puede hacer de 70-100aa.

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Grupos protectores: Fmoc,

Boc, Z-Cl, Alloc-Cl

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Reactivos de acoplamiento: Carbodiamidas, oximas aromáticas (HOBt),
grupos aza, sales de fosfonio (HBTU), neutralización in situ.

Resinas: Core resin (Merrifield Resin) y Linked resin (Rink amide resin)

6. QUÍMICA COMBINATORIA

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Está más relacionada con la fase sólida. La química combinatoria
se utiliza cuando usas diferentes compuestos con similares
características para encontrar un principio activo. En la
combinatoria puedes tener distintas variables de una misma
característica.

Las librerías combinatoriales son la diversidad de compuestos

que se producen en la química combinatoria. Hay dos tipos, la
que es una cadena (síntesis de péptidos) y la otra que se van
añadiendo a una estructura.

Split-pool

El método más usado de esta química es el Split-pool

(separar y juntar). Comenzamos con un compuesto inicial,
p.ej la resina. La en 3 recipientes, y añadimos el 1er aa, A1
A2 y A3. Mezclamos los tres recipientes. Separamos otra vez
en 3 recipientes y mezclamos con los aa B, dan 9 productos
que los mezclamos. Y otra vez igual con C. Para acortar,
podemos hacer las pruebas de actividad por ejemplo en el
paso anterior a mezclar y quitar el de C3 por ejemplo
porque no va bien.

En la pool hacemos una prueba de actividad, si la da, vale la

pena purificarlo para ver cuáles son los que dan actividad.
También puede ser que de una actividad cooperativa.

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Método de síntesis paralela

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Para hacer una librería usamos el método de síntesis
paralela. Se suele trabajar en placas en las que todos los
recipientes estén juntos para que tengan las mismas
características. Se hace en cantidades pequeñas.
Primero hacemos el acoplamiento de A por filas o
columnas. Después con B lo añadimos en columnas de 3,
y en C hacemos las columnas de uno en uno. Bueno esto
u know, lo haces como quieras.

La bioinformática es muy importante. Puedes ver si las

mezclas que vas a hacer son útiles y ahorrar tiempo…

La diversidad es ir cambiando R y ver qué pasa.

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