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Bioquímica

1º Grado en Farmacia

Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación

Universidad de Barcelona

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 TEMA 3

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS

Es la secuencia de aminoácidos y las formas de plegamiento tridimensional que

adoptan. Cuando tiene una estructura primaria no es funcional.
Las proteínas se leen en dirección de N a carboxilo terminal.

1. Enlace peptídico

Reservados todos los derechos.

Es un enlace amida.
Cadena polipeptídica: serie de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Residuo: cada unidad (aa) de un polipéptido.

Hacia la derecha hay una flecha más pequeña que hacia la izquierda porque es más
difícil crear el enlace que deshacerlo, ya que se necesita la ayuda de enzimas para
formarlos.
Los enlaces peptídicos son planos porque tiene carácter de doble enlace, que hace que
la estructura sea rígida y no se pueda mover, por lo que los átomos (6) quedaran en el
mismo plano. Este carácter de doble enlace se debe a la resonancia que hay entre los
electrones que están en el grupo carbonilo y que se pueden desplazar hacia el amino.
El carácter de doble enlace se ve en la longitud del enlace entre los grupos CO y NH, a
mitad de camino entre un enlace sencillo y uno doble.

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 Hay 2 disposiciones posibles dependiendo de cómo se situen los carbonos alfa:
- Disposición trans: carbonos alfa situados en lados opuestos
consecutivamente.
- Disposición cis: carbonos alfa situados hacia abajo.

Casi todos los enlaces peptídicos en las proteínas son trans para evitar el choque
estérico entre los grupos R.
*excepción: la prolina muestra menos preferencia por la configuración trans.

Los enlaces entre el grupo amino y C alfa o entre el grupo carbonilo y C alfa sí pueden
girar:
- Amino-C alfa: angulo fi.
- Carbonilo-C alfa: angulo psi.
Diagrama de Ramachandran: descubrió que muchas combinaciones no son posibles
debido a los choques esféricos entre los átomos. Así se descubrieron las estructuras
secundarias.

2. Estructuras secundarias

2.1. Hélice alfa

Estructura helicoidal estabilizada por puentes de
hidrogeno intracatenarios.
·Características:
- Cada giro contiene 3’6 residuos.
- Cada giro avanza 5’4 Amstrongs.
- La distancia entre aa’s es de 1’5 Amstrongs.
- El giro es dextrógiro (hacia derecha).
- Estabilización gracias a:
o Puentes de hidrógeno.
o Grupos R.
o Interacciones electrostáticas.
*excepción: cuando hay una prolina en una estructura hélice alfa se produce un cambio
en la dirección de la cadena, ya que su disposición es cis.
EJ PROTEINAS HÉLICE ALFA: ferritina, mioglobina.

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 2.2. Hojas beta
Está formada por dos o más cadenas polipéptidicas, llamadas hebras beta. Se
estabilizan por puentes de hidrógeno intercatenarios (entre las cadenas).
Características:
- Las hebras beta están casi completamente extendidas (a diferencia de la hélice
alfa que está enrollada y empaquetada).
- La distancia entre aa’s es de 3’5 Amstrong.
- Estabilización gracias a :
o Puentes de hidrógeno.
o Grupos R.
o Interacciones electrostáticas.

- Las hojas beta pueden tener dos conformaciones:

• Hojas beta paralelas: las dos cadenas van hacia la derecha.
• Hojas beta antiparalelas: una cadena va hacia la derecha y otra hacia
la izquierda.

EJ PROTEINAS HOJAS BETA : proteínas que se unen a ácidos grasos y que son importantes en
el metabolismo lipídico.

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 2.3. Giros beta y bucles
Las cadenas polipeptídicas pueden cambiar de dirección por medio de giros inversos y
bucles.
La estructura primaria que tenga una proteína (su secuencia de aa’s), nos determinará
su secuencia secundaria.

3. Estructuras supersecundarias
Son combinaciones de estructuras secundarias.

3.1. Proteínas fibrosas

Las proteínas fibrosas (alfa queratina y colágeno) dan un soporte estructural a las
células y a los tejidos.
- Alfa queratina: componente principal de la lana, cabello y piel. Consta de 2
hélices alfa dextrógiras enrolladas mutuamente (superhélice alfa).
Estabilizado por:
o Interacciones débiles (fuerzas van der Waals e interacciones iónicas).
o Puentes disulfuro entre hélices alfa.

- Colágeno: componente de los dientes, huesos, cartílagos, tendones. Consta de

3 hélices alfa.
Estabilizado por:
o Repulsión estérica de los anillos de pirrolidina (prolina e hidroxiprolina).

4. Estructura terciaria
Conjunto de todas las estructuras secundarias
que conforman la proteína.
Hay proteínas con esta estructura que ya pueden
ser funcionales.

4.1. Mioglobina

Transportador de oxígeno en el músculo.

La capacidad de la mioglobina para unirse al oxígeno
depende del grupo hemo (grupo prostético (ayudante
no proteico + átomo de hierro)).
La cadena polipéptica se pliega para que sus cadenas
hidrofóbicas laterales estén en el interior y sus cadenas
polares (cargadas) en la superficie (medio acuoso).

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 4.2. Porina (proteína de membrana)

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Las proteínas que atraviesan las membranas biológicas son
excepciones que confirman la regla, ya que presentan una
distribución inversa (aa’s hidrofóbicos en el exterior y
hidrofílicos en el interior).
Concretamente, las porinas se encuentran en las
membranas externas de las bacterias.

4.3. Dominios de una proteína

Los dominios son zonas compactas de la proteína de un tamaño aproximado de 100 a
400 aa’s, conectadas por un segmento de cadena polipeptídica flexible.
Normalmente cada dominio suele tener una función concreta de la proteína.

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EJ: proteína CD4 (proteína de la superficie celular del sistema immune al que se une el VIH.

5. Estructura cuaternaria
La secuencia de aa’s de una proteína determina su estructura tridimensional.
EJ:
- Hemoglobina: tetrámero con 4 grupos hemo (2 subunidades alfa y 2 beta) y
átomo de hierro.
- Cro: proteína del bacteriófago lambda (dímero de subunidades idénticas).

6. Desnaturalización de las proteínas

La conformación nativa es la activa, es única y la más estable termodinámicamente.
Los agentes desnaturalizantes despliegan la proteína:
- Calor: se eliminan las interacciones.
- Cambio pH o concentraciones altas de sal: cambio de cargas en R o cambio
en los requerimientos de enlaces iónicos y puentes de hidrógeno.

7. Fuerzas que intervienen en el plegamiento de las proteínas

- Fuerzas hidrofóbicas.
- Puentes hidrógeno.
- Interacciones electrostáticas.
- Fuerzad de van der Waals.
- Impedimentos estéricos.
Las proteínas se pliegan porque se van estabilizando progresivamente los
intermediarios que se van formando.

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 En algunos casos, unas proteínas llamadas xaperoninas/xaperonas, ayudan a las
proteínas a plegarse. Las proteínas tienen un canal por donde entran las xaperonas.
Muchas enfermedades graves son provocadas por un mal plegamiento de proteínas:
- Fibrosis quística.
- Alzheimer.
- Creutzfeld-Jacob (enfermedad de las vacas locas).

SEMINARIO: PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Selección del material de partida.

Estrategia de purificación (técnica para separar la proteína).
- Centrifugación.
- Cromatografía.
- Electroforesis.
Todo dependerá de las propiedades específicas de la proteína:
- Carga iónica.
- Tamaño molecular.
- Solubilidad.
- Afinidad a moléculas biológicas.

1. Extracción

Homogeneización (localización celular: utilización de detergentes, centrifugación

diferencial).
Para que las proteínas no se degraden se tiene que tener en cuenta:

• pH (añadir solución tampón para mantener pH fisiológico 7’2-7’4).

• Fuerza iónica (añadir iones para conseguir una fuerza iónica similar a la
que había en el ser donde se encontraba la proteína).
• Temperatura (bajarla a 4ºC, si no se usa en el momento se congela a -
20ºC).
• Inhibidores de proteasas (como las proteasas, encontradas en los
lisosomas, son proteínas encargadas de degradar otras proteínas, se
añaden inhibidores para evitarlo).
• Añadir detergente (ayudan a extraer/disolver la grasa, rodea a las
proteínas de membrana y las hace apolares, permitiendo que puedan
disolverse).

2. Centrifugación diferencial
Separación de un orgánulo como paso previo a la purificación de una proteína.
- 1ª centrifugación: se obtiene la fracción nuclear (pellet) i el sobrenedante.

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 - 2ª centrifugación (+ tiempo y velocidad): se obtiene la fracción mitocondrial
(pellet) y el sobrenedante.
- 3ª centrifugación (+ tiempo y velocidad): se obtiene la fracción microsomal
(orgánulos más pequeños) y el sobrenedante.

3. Concentración (opcional)
Porque al homogeneizar ha aumentado el volumen y disminuido la concentración de
proteína.
Se aprovechan las propiedades de solubilidad de las proteínas en diferentes
condiciones:
- Concentración de sales.
- Polaridad del disolvente.
- pH.
- Temperatura.
Métodos de concentración de sales:

• Precipitación con sales (sulfato de amonio).

• Precipitación por cambio de pH.
• Precipitación por aumento de temperatura.
• Precipitación con disolventes orgánicos (etanol, acetona…).

Diálisis: para disminuir la concentración de sales en la solución.

Se consigue una menor concentración de sales en

el interior del tubo, ya que una parte de estas salen
del tubo para igualar las concentraciones entre los
dos medios, es una barrera semipermeable. Las
proteinas no pasan.

4. Separación de proteínas por cromatografía

4.1. Cromatografía de gel-filtración

Se separan las proteínas según su tamaño, dentro de los límites de exclusión.

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 - Límite de exclusión
máximo: las moléculas de
peso molecular superior a
este límite se eluirán al
principio.

- Límite de exclusión
mínimo: las moléculas de
peso molecular inferior
saldrán agrupadas en una
única fracción final.

Entre los 2 límites se

producirá la separación por
fraccionamiento en función
del tamaño.

4.2. Cromatografía de intercambio iónico

Se separan las proteínas según su carga.
Las proteínas cargadas positivamente se unirán, en este
ejemplo, al polímero insoluble en agua, ya que este está
cargado negativamente. El resto de proteínas, cargadas
negativamente, no se unirán a estos y quedarán
separadas de las cargadas positivamente.

4.3. Cromatografia de afinidad

Se separan unas proteínas
concretas que tienen ligandos
especiales.
Si tenemos una proteína que une
glucosas podemos utilizar
polímeros que tienen unidos
moléculas de glucosa haciendo que
cuando se mezcle con estas
proteínas, estas se unan al
polímero y puedan diferenciarse, ya
que el resto de proteínas se eluirán

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 5. Métodos para detectar y cuantificar la proteína en el proceso de

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purificación

5.1. Absorbancia

Los aminoácidos tirosina, triptófano y

fenilalanina, cuando les incide la luz son
capaces de absorberla y dan un espectro.
La absorbancia es proporcional a la
concentración, por lo que, si en la mezcla
de proteinas se encuentra uno de estos
aminoácidos absorberán la luz en el
espectofotometro.

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5.2. Actividad específica

Diferencia entre actividad y actividad específica:

- Actividad enzimática: unidades de enzima en una solución.

V reacción = mmol (S P)/min

- Actividad específica: número de unidades enzimáticas por mg de proteina

total.

V reacción/mg prot. Total

Los dos recipientes contienen la misma

actividad, ya que tienen la misma cantidad
de canicas rojas, en cambio, tendrán
diferente actividad específica porque
contienen un número total de canicas
diferente, por lo que como en el segundo
recipiente hay el mismo número de canicas
rojas pero en una cantidad total menor, su
actividad específica es mayor.

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 5.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
Permite:
- Determinar el grado de pureza de una muestra.
- Determinación de algunas propiedades: pI, masa molecular, número de
subunidades.
Según las condiciones de la electroforesis:
- Condiciones desnaturalizantes (PAGE-SDS): separación en función de la
masa molecular.
Hay un polímero (especie de red) y las proteinas van descendiendo a través de él, las
más pequeñas avanzan más rápido y salen antes y las más grandes van más lento,
después se van separando según su masa molecular.
Como se quiere separar las proteinas SOLO según su masa molecular, se les aplica
un detergente SDS que las recubre y hace que la carga de todas ellas sea negativa,
por lo que todas tendrán la misma carga y no se separarán según ese criterio.
También se añade beta-mercaptoetanol, que se añade para romper los puentes
disulfuro de las proteinas (entre cisteínas).
AGENTES DESNATURALIZANTES = SDS + BETA-MERCAPTOETANOL

- Condiciones no desnatularizantes: separación en función de la carga y masa

molecular.

5.3.1. Formación del gel de poliacrilamida:

Para formar el gel (malla tridimensional) se produce una co-polimerización del
monómero activado y el cross-linker .
Son necesarios 2 catalizadores → APS (persulfato de amonio) + TEMED (acelera la
formación de radicales).

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 5.3.2. Determinación de la masa molecular de una proteína
Se añade un marcador para que se pueda observar donde se encuentran las
protreinas.
La movilidad de las proteínas es inevrsamente proporcional al logaritmo de su peso
molecular.
A menos distancia, proteínas de peso molecular mayor.

5.3.3. Identificación de la proteína (western blot)

Electroforesis + identificación con anticuerpos

Se utilizan anticuerpos específicos contra la proteína que queremos buscar, que son
una herramienta básica para el estudio de proteínas.
Pasos:
- Se transfieren las proteínas del gel de poliacrilamida a una membrana.
- Se incuban con un anticuerpo específico.
- Se relevan por luminiscencia, fluorescencia o radioactividad.

5.3.4. Enfoque isoeléctrico

Nos permite separar las proteínas según el pI, se separan según su contenido relativo
en aminoácidos básicos y ácidos.
Para ello, se establece un gradiente de pH y se aplica un campo eléctrico → permite
separar proteínas de diferente pI.
- Cuando el pH es ácido se protonan las proteínas → carga +.
- Cuando el pH es básico se desprotonan las proteínas → carga -.
En el pI, la proteína no tiene carga neta i deja de desplazarse en el campo eléctrico.

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 Electroforesis bidimensional (para proteínas especiales):
- 1ª dimensión: enfoque isoeléctrico → separación en función de su pI.
- 2ª dimensión: SDS-PAGE → separación en función del peso molecular.

6. Métodos para identificar la proteína

Cuando aumenta la concentración de sales, estas hacen que disminuya la solubilidad
de las proteínas y hace que se cristalicen → se puede observar la estructura de la
proteína a través de diferentes métodos.

6.1. Rayos X
Una vez se tengan los cristales, se aplican rayos X, de manera
que se produce una refracción y llega información al detector
sobre la estructura de la proteína.

6.2. Espectrometria de masas (MALDI-TOF)

Permite conocer la masa de las proteínas.
Proceso:
- La proteína se encuentra en una matriz, se encuentra en un estado
relativamente puro.
- Se le aplica un láser que la ioniza (se convierte en iones), queda en diferentes
fragmentos.

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 - Se aplica un campo eléctrico que acelera los iones, la velocidad de estos

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dependerá de su masa, ya que los más pequeños irán a más velocidad, por lo
que se podrá saber su masa según este criterio.
Las proteínas grandes se secuencian a partir de fragmentos más pequeños.

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