UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

BIOINFORMÁTICA

CONSULTA DNA BARCODING Y DISEÑO DE PRIMERS

INTEGRANTES: AMELI HERRERA Y EMILY OÑA

OCTAVO SEMESTRE

GRUPO: 1
 Realizar una consulta sobre el código de barras de ADN (DNA barcoding).

Código de barras de ADN

El código de barras de ADN o DNA barcoding presentado en el año del 2003

por el científico Paul Hebert y su grupo de investigación, es una herramienta de
identificación rápida y precisa de diversas especies ya sean animales, plantas, hongos
o bacterias utilizando una pequeña sección del genoma estandarizada (Andrade et al.,
2021).

La región del genoma usada tiene que distinguir la variación entre especies
cercanas (interespecífica) y la variación dentro especies (intraespecífica), de aquí se
deriva su nombre de barcoding gap siendo la diferencia entre las diferentes de
variaciones que hay (Paz et al., 2011).

Por otro lado, usa la misma información de una región génica en varios
organismos con condiciones de secuenciación estandarizados con costos bajos y
eficacia alta (Altamirano-Benavides & YANEZ-MORETTA, 2016). Propone una
evidencia mayor en la discriminación de especies, así como, la universalidad y
fiabilidad de los primers o cebadores al momento de la amplificación de las regiones
(Andrade et al., 2021).

Entre sus aplicaciones más importantes esta la identificación de especies, uso

en disciplinas como evolución, ecología y genética de poblaciones, así pues, ha
contribuido en estudios sobre biodiversidad en lugares tropicales permitiendo el
descubrimiento de nuevas especies, recolectar datos para evaluar la estructura
filogenética de las especies que coexisten y como su ambiente cambia a las
comunidades (Paz et al., 2011). Finalmente, manejo de pestes, especies invasoras y
tráfico ilegal de especies (Paz et al., 2011).

Sin embargo, a pesar de ser una herramienta innovadora posee limitaciones

ya que se basa en un solo marcador mitocondrial o plasmídico, el uso de genomas
haploides afecta la identificación de especies (Paz et al., 2011). No disponer de bases
de referencia completa regiones que reconozca a la mayoría de los organismos vivos
(Paz et al., 2011).

 Incluir 2 ejemplos de regiones que se usan como código de barra para los
siguientes grupos: animales, plantas, hongos y bacterias.
  Incluir el nombre de la región y la secuencia de primers (realizar la
evaluación de los primers).

 Plantas
Para Amandita et al. (2019) las regiones de matk y rbcl son generalmente
usadas debido a las altas tasas de sustituciones de nucleótidos en las mitocondrias de
las plantas.

El éxito de amplificación y secuenciación es de 96,9% y 94,7 %

respectivamente, se amplificaron un total del 79,1% y 65, 8% por otro lado, las
similitudes que se pueden encontrar entre identidad morfológica y molecular son de
46,6% y 51,3% (Amandita et al., 2019). Asimismo, estudios realizados por Yu et al.
(2016) demostró un éxito general de identificación de especies en comparación fue
de 78,3% y 71,41%. Finalmente, para Ho et al. (2021) ambas poseen efectividad en
secuencias de las regiones de plantas vasculares, porcentaje considerablemente alto
en degeneración comprobadas en varias especies.

 Región del gen matK (megakaryocyte-associated tyrosine kinase),

marcador molecular de ADN de plásmidos ubicada en la región 5´, ha sido muy
utilizado para el reconocimiento de especies de plantas debido a sus resultados
positivos (Grivet et al., 2019).
 Ejemplo de los primers usados para la orquídea Epidendrum xanthinum
en Vietman (Ho et al., 2021)
Fwd CGATCTATTCATTCAATATTTC

Rev TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT
Parámetro Forward Reverse Cumple o no
cumple
Longitud 22 22 si
Contenido GC 27.3 %% 45.5% no
GC clamp 1 bases 1 bases si
Secuencias o patrones no no si
repetitivos
Tm 44.9 °C 56.0°C no
Hairpin 0.25 kcal/mol, 21.5°C -1.99 kcal/mol, 50.8 °C si
Hetero-dimer -5.46 kcal/mol, 3’ solamente fwd si
Self-dimer -7.8 kcal/mol, no en el -6.76 kcal/mol, no en el si
extremo 3’ extremo 3’
Especificidad Epidendrum Epidendrum xanthinum si
xanthinum vs vs Bacillus
Enterococcus E-value: 0.12/ 101
E-value: 0.0001/ 25 % id: 100/100
% id: 100/100 % query cov: 100/72
% query cov:100/72
 Observaciones: si presenta GC clamp en el primer forward y reverse, no
presenta secuencias o patrones repetitivos. No cumple con todos los parámetros básicos,
la Temperatura de melting y el contenido de GC es bajo para el primer forward y no
cumple con las condiciones.

Recomendaciones: se pueden utilizar estos primers, ya que en la prueba de

especificidad se observó un mejor E-value con nuestro organismo target vs al otro
organismo, potencial contaminante con los que también se observó similitud.

Región rbcl: de 599 pares de bases de la región 5´, este gen cosifica para
ribulosa difosfato carboxilasa (RuBisCO) (Rey y Capdevielle, 2020). Es usada por su
sencillez al momento de amplificación, secuenciación y alineación que posibilita ser
usado para la mayoría de las plantas (Rey y Capdevielle, 2020).

 Ejemplo del uso de la región rbcl para el género Pinus (Grivet et al., 2019).
2. rbcl –  ribulose-bisphosphate carboxylase

Fwd ATGTCACCACAAACAGAAAC
Rev TCGCATGTACCTGCAGTAGC

Parámetro Forward Reverse Cumple o no

cumple
Longitud 20 20 si
Contenido GC 40.0% 55.0% no
GC clamp 1 bases 2 bases si
Secuencias o patrones no no si
repetitivos
Tm 51.1 °C 57.3°C no
Hairpin 0.08 kcal/mol, 23.7 °C -1.32 kcal/mol, 38.3 °C si
Hetero-dimer -3.55 kcal/mol, 3’ solamente fwd si
Self-dimer -3.30 kcal/mol, no en el -10.24 kcal/mol, no en el no
extremo 3’ extremo 3’
Especificidad Pinus vs Human Pinus vs Human si
E-value: 0.004/1.5 E-value: 0.004/5.8
% id: 100/100 % id: 100/100
% query cov: 100/85 % query cov: 100/80

Observaciones: si presenta GC clamp en el primer forward y reverse, no

presenta secuencias o patrones repetitivos. No cumple con todos los parámetros básicos
puesto que, el contenido de GC y la temperatura de melting no se encuentran dentro de
 los parámetros, así como, en el self- dimer existe un valor mayor de -9 kcal/mol que es el
permitido.

Recomendaciones: se pueden utilizar estos primers, ya que en la prueba de

especificidad se observó un mejor E-value con nuestro organismo target vs al otro
organismo, potencial contaminante con los que también se observó similitud.

 Animales
En los últimos años, se han implementado nuevas herramientas de identificación
morfológica de especies en donde se usa el método molecular del código de barras de
ADN basado en la subunidad 1 del citocromo C oxidasa mitocondrial COI (Adeninan et
al., 2020).

Región COI: es usado para delimitar grupos taxonómicos en todo el reino

animal y reconocer su biodiversidad, tienen ventajas como cebadores universales que
permiten la recuperación del extremo 5’ de la mayoría de los filos animales (Ortega et
al., 2021). Sus desventajas son su simplicidad y la necesidad de especímenes de
referencia para realizar la identificación (Ortega et al., 2021). Ejemplo del uso de la
región COI para la identificación de mosquitos del género Aedes sp. (Muñoz-Gamba,
2021).

1.- COI Citocromo C oxidasa I

Fwd GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

Rev TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

Parámetro Forward Reverse Cumple o

no cumple

Longitud 25 26 si
Contenido GC 32 % 34.6 % no
GC clamp 2 bases 0 bases si
Secuencias o patrones no 6A no
repetitivos
Tm 50.5 °C 55.3°C no
Hairpin -0.44 kcal/mol, 27.5°C -1.99 kcal/mol, 53.7 °C si
Hetero-dimer -7.94 kcal/mol, 3’ solamente fwd si
Self-dimer -3.91 kcal/mol, no en el -4.41 kcal/mol, no en el si
extremo 3’ extremo 3’
Especificidad Aedes sp. vs Humanos Aedes sp. vs Humanos si
E-value: 0.0002/0.056 E-value: 0.001/ 0.050
% id: 100/100 % id: 100/ 100
% query cov: 100/80 % query cov:100/ 80
 Observaciones: si presenta GC clamp en el primer forward y reverse, si
presenta secuencias o patrones repetitivos (6A). No cumple con todos los parámetros
básicos puesto que, el contenido de GC y la temperatura de melting no se encuentran
dentro de los parámetros, así como en el hetero-dimer existe un valor cercano de -9
kcal/mol que es el permitido.

Recomendaciones: se pueden utilizar estos primers, ya que en la prueba de

especificidad se observó un mejor E-value con nuestro organismo target vs al otro
organismo, potencial contaminante con los que también se observó similitud.

Por otro lado, otro marcador molecular usado es el citocromo B (Cytb) se usa
como marcador a nivel de especie y particularmente en biosistemática de mamíferos
(Wang et al., 2019). Igualmente, para análisis filogenéticos, para identificar especies,
tamaños de estas (Wang et al., 2019).

Como se ha podido observar estas dos regiones son utilizados por científicos por
el éxito que han demostrado en la identificación de reptiles, aves, mamíferos e insectos
(Wang et al., 2019).

Uso de la región del Cytb en secuencias de ADN de ratones salvajes en China (Dong-Ying
et al., 2017).

1.- Cytb (Citocromo B)

Fwd TACCATGAGGACAAATATCATTCTG

Parámetro Forward Reverse Cumple o

no cumple
Longitud 25 26 si
Contenido GC 36 % 46.2 % no
GC clamp 1 bases 0 bases si
Secuencias o patrones no no si
repetitivos
Tm 52.6 °C 56.7°C no
Hairpin -1.26 kcal/mol, 45.9°C -1.17 kcal/mol, 35.7 °C si
Hetero-dimer -7.18 kcal/mol, 3’ solamente fwd si
Self-dimer -5.38 kcal/mol, no en el -5.63 kcal/mol, no en el si
extremo 3’ extremo 3’
Especificidad Ratón vs Streptomyces Ratón vs Streptomyces si
E-value: 0.0007/ 102 E-value: 0.005/459
% id: 100/94.44 % id: 96.15/100
% query cov: 100 / 72 % query cov:100/50
Rev CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG
 Observaciones: si presenta GC clamp en el primer forward, no presenta
secuencias o patrones repetitivos. No cumple con todos los parámetros básicos puesto
que, el contenido de GC y la temperatura de melting no se encuentran dentro de los
parámetros, así como en el hetero-dimer existe un valor cercano de -9 kcal/mol que
puntaje máximo permitido para investigaciones.

Recomendaciones: se pueden utilizar estos primers, ya que en la prueba de

especificidad se observó un mejor E-value con nuestro organismo target vs al otro
organismo, potencial contaminante con los que también se observó similitud.

· Hongos
En el caso de los hongos su código de barras genético más utilizado es la región
denominada ITS (Internal Transcribed Spacer) ya que permite de forma fácil y
automática la obtención de secuencias de hongos de mayor interés, también el
descubrimiento de nuevas especies de hongos y tabular estudios de diversidades de
hongos en un nicho específico Maldonado et al. (2022).

El operón ribosomal que se considera funcional tiene el siguiente mecanismo de

acción para la obtención de ITS1 y ITS2, este es considerado una secuencia continua de
ADN codificante para SSU, 5.8S y LSU (Henras et al., 2015).

Se realiza dos cortes en los extremos con la ayuda de ciertas enzimas, para la
obtención de SSU y LSU con tamaño completamente exacto y los cortes realizados en el
medio se realizan con el fin de liberar al 5.8S, este fragmento flanquea al ITS1 y el
ITS2, se le ha denominado con el nombre de ITS ya que es la región espaciadora entre
los ARNr, cumple con funciones como transcribir y sintetizar a partir de una molécula
de ADN todo este proceso ocurre en el núcleo de las células por Maldonado et al.
(2022).
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