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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

INGENIERÍA AGRONÓMICA
METODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

VARIABILIDAD GENÉTICA DE GUADUA ANGUSTIFOLIA Y BAMBUSA


EXCELSA MEDIANTIAN LA UTILIZANCIÓN DE MICROSATÉLITES
AMPLIFICADOS AL AZAR (RAMs)

Resumen

En el siguiente trabajo se observará cada una de las técnicas implementadas en el laboratorio


de biología molecular, partiendo desde la extracción de DNA hasta la electroforesis en gel
de poliacrilamida. Para llevar a cabo la implementación de dichas prácticas se utilizaron dos
especies de bambú (Bambusa vulgaris y Rhapis excelsa), las muestras fueron obtenidas en
el campus de la universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, con el objetivo de lograr
la genotipificación de las especies mencionadas, este proceso se llevó a cabo con el uso de
RAMs (microsatélites amplificados al azar), los cuales permitieron la obtención de datos que
serían utilizados para comparar la diversidad de las especies.

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METODOS DE BIOLOGÍA MOLÉCULAR
Contenido:

1. Introducción general

2. Objetivos.

2.1 General

2.2 Específicos

3. Materiales y métodos.

3.1 Recolección de muestras

3.2 Extracción de DNA genómico vegetal

3.3 Montaje de gel de agarosa para visualización de DNA (electroforesis)

3.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando Microsatélites

Amplificados al azar (RAMs)

4. Resultados y discusión

5. Conclusión

6. Bibliografía

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METODOS DE BIOLOGÍA MOLÉCULAR
1. Introducción.

Conocer la diversidad genética existente entre 2 o más especies permite obtener información
importante para procesos de fitomejoramiento y/o creación de bancos de germoplasma, esto
permite la conservación de dicha diversidad genética. Una técnica muy usada son los RAMs
(microsatélites amplificados al azar), estos se utilizaron en dos especies de poaceas o pastos
gigantes (Bambú y guadua), estas son plantas perennes cuyo centro de origen es Asia, ciertas
especies pueden alcanzar los 25 metros de altura. La raíz forma un rizoma muy potente del
cual salen los tallos, formado por entrenudos muy marcados, la floración se da luego de
mucho tiempo, pues esta suele consumir tantos recursos que en muchas ocasiones la planta
muere.

La especie Bambusa excelsa, es un bambú perenne, denso, que puede crecer entre 7 y 30
metros de altura. El centro del grupo se eleva irregularmente sobre el suelo. Los culmos
leñosos, de paredes delgadas, erectos pueden tener un diámetro de 5 a 13 cm en la base, con
entrenudos de 40 a 60 cm de largo ("Bambusa excelsa - Useful Tropical Plants", 2019)

Por otra parte, Guadua angustifolia es una especie perteneciente a la familia de las poáceas,
tiene un rango de altura que va desde los 6 hasta los 20 metros la cual puede alcanzar en 120,
su tronco presenta un ancho aproximado de 20cm presenta un crecimiento optimo desde los
400 a 1200 MSNM, suelos arcillosos y temperaturas desde los 18 hasta los 28°C y humedad
relativa de por lo menos 80% (“guadua angustifolia- Tropicos.org”,2019)

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METODOS DE BIOLOGÍA MOLÉCULAR
1. Objetivos.

1.1 General.
 Desarrollar habilidades para llevar a cabo la genotipificación de materiales vegetales
de Bambusa vulgaris y Raphis excelsa mediante el uso de RAMs

1.2 Específicos.
 Conocer la utilidad de los RAMs en la biología molecular y como a partir de este se
puede caracterizar la diversidad genética en distintos organismos
 Manejar las técnicas moleculares utilizadas para llevar a cabo un proyecto de
investigación

3. Materiales y métodos:

3.1 Toma de muestras.

Para llevar a cabo la recolección de muestras se llevó a cabo en el campus de la Universidad


Nacional de Colombia, se tomaron los primordios florales de Bambusa excelsa y Guadua
angustifolia, estas estructuras se ubican en la parte final de la rama, luego se procedió a
llevar las muestras al laboratorio de biología molecular de la universidad ya
mencionada(Imagen 1.)

(Imagen1.) Toma de muestras para llevar a cabo la extracción de DNA.

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3.2 Extracción del DNA genómico vegetal
La extracción del ADN genómico se realizó siguiendo el protocolo de Doyle y Doyle (1990)
(modificado por Focus, 1995). Las muestras de material vegetal se sometieron a un macerado
en un mortero(Imagen 2.), además se aplicó Nitrógeno líquido con la finalidad de facilitar el
rompimiento de la celulosa, posteriormente el resultado del macerado se almacenó en tubos
Eppendorf, donde luego de varios procesos como el centrifugado y demás se obtuvo de DNA

(Imagen 2.) Macerado de la muestra

3.3 Montaje de gel de agarosa para visualización de DNA (electroforesis)


Las muestras fueron sometidas a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% teñido con “Gel
red”, este reactivo ayuda al momento de llevar a cabo la visualización del material genético
en el transluminador, pues sin la presencia de esta no seria posible adelantar el proceso

3.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando Microsatélites


Amplificados al azar (RAMs)
Los RAMs utilizaron 2 primer’s (ACA y CA) los cuales amplifican una determinada región
del DNA, por lo tanto, requieren una determinada temperatura dentro del proceso de la
PCR (tabla 1)

Agrupación de primer’s de acuerdo a la temperatura de Temperatura de


Hibridación Hibridación
ACA CA 50°C
Tabla 1. Primer’s para RAMs y temperaturas de hibridación

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Los dos primer’s manejados ACA y CA, para los cuales cada uno se preparó un coctel de
reactivos con una cantidad específica referente a la cantidad de muestras a preparar (tabla 2),
después se llevó al termociclador con las condiciones de amplificación por PCR (tabla 3) y
se comenzó el proceso de amplificación

RAMs: ACA y CA
REACTIVOS CANTIDAD BASE N° TOTAL
para 1 muestra en ul DE MUESTRAS para 12 muestras en
ul

MgCL2 1.25 15
Buffer 1.25 15
Primer 0.5 6
12
DNTPs 2 24
H2O 6.45 77.4
TAQ polimerasa 0.05 0.6
ADN 1 ---

Total 12.5 138

Tabla 2. Condiciones y reactivos del coctel para RAMs

Pasos Temperatura Tiempo


1. Desnaturalización I 94°C 5min
2. Desnaturalización II 94°C 30seg
3. Hibridación *TH 45seg
4. Extensión 72°C 2min
5. Repetir 37 ciclos des el paso 2
6. Extensión final 72°C 7min
7. Estabilizar el equipo 4°C 5min
8. Finalización

Tabla 3. Condiciones de amplificación para la PCR

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4. Resultados y discusión

4.1 Extracción de DNA

Tras la finalización del proceso de extracción de DNA se obtuvieron 12 muestras del material
genético, las cuales fueron sometidas a un lavado con diferentes reactivos para eliminar
proteínas u otras estructuras que pudieran afectar las muestras, posteriormente se secaron
boca abajo en una toalla de papel (Imagen 3.), para al final se obtiene un “pallet” en el fondo
de tubo ependorf el cual se cono como DNA total. Estas muestras sirvieron como base para
llevar a cabo las determinaciones de variabilidad genética

(Imagen 3.) Muestras dispuestas a secado


Las muestras fueron almacenadas a aproximadamente -20°C, esto permite disminuir el riesgo
de degradación y mantener la muestra en condiciones óptimas para continuar con el estudio

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4.2 Visualización de DNA por electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa (Imagen 4,) permitió conocer el tamaño de diferentes
fragmentos de material genético (DNA total) vegetal, además brinda un indicio acerca de la
calidad de las muestras resultantes de la extracción.

(Imagen 4.) DNA de las 12 muestras corrido en electroforesis

La imagen (4) muestra el DNA total tras haber sido sometido al proceso de electroforesis, las
muestras no presentaron un bandeo bien definido, si no más bien es un tipo de “mancha” en
el gel, también se puede observar que dos de los pozos (ubicados a el extremo izquierdo del
gel”) no presentan el brillo de las muestras, pues esto es debido a la ausencia de gelred, que
es el reactivo que permite la visualización

4.3 PCR con el uso de RAMs


La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) consiste en la amplificación de una región
específica del material genético, al utilizar RAMs (microsatélites amplificados al azar) esta
amplificación se hace de forma aleatoria o como su nombre lo dice al azar, esto se realiza
con el objetivo de buscar regiones iguales en dos plantas diferentes en ciertas características
y así determinar la variabilidad genética de las especies en cuestión

Lo dicho anteriormente fue aplicado en el laboratorio, sobre el material genético extraído de


Bambusa excelsa y Guadua angustifolia, para de esta manera amplificar los RAMs y
posteriormente visualizar el DNA producto PCR

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4.4 Visualización de DNA en gel de poliacrilamida
Tras realizar la PCR para la búsqueda de mayores fragmentos específicos de DNA (K. López-
2018), se utilizaron los geles de poliacrilamida para correr el material genético producto de
la técnica mencionada anteriormente (PCR), para de esta manera poder llevar a cabo la
identificación de los individuos en cuestión, estos geles se corrieron a 160 voltios durante
una (1) hora, una vez transcurrido el tiempo el gel fue llevado al transiluminardor,
observando:(Imagen 5.)

(Imagen 5.) Resultados obtenidos en electroforesis en gel de poliacrilamida


Dado que los resultados visualizados en el gel de la imagen (5) fueron insatisfactorios, se
procedió a llevar a cabo el análisis de dos geles corridos con los primer’s ACA y CA con
DNA de Bambusa excelsa y Guadua angustifolia, obtenidos del laboratorio de biología
molecular, esto permitió llevar a cabo un proceso más asertivo sobre la determinación de la
variabilidad genética
En Imagen 6. Se observan los geles de poliacrilamida corridos con los primer’s ACA
(Bambusa excelsa) y CA (guadua angustifolia)

ACA CA
Imagen 6. Geles de poliacrilamida

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Posteriormente se llevó a cabo el conteo de bandas de cada uno de los geles vistos en la
imagen anterior, obteniendo: 34 bandas para CA y 18 bandas para ACA. Teniendo la
cuantificación de las bandas se procedió a generar un matriz binaria en Excel, con dicha
matriz se llevaron a cabo análisis estadísticos con los programas del paquete NTSYS y el
programa GENALEX, esto arrojó:
4.41 Dendrograma
Este se llevó a cabo con el paquete NTSYS, en el cual se utilizó el coeficiente de similitud
de DICE (Imagen 7.), arrojando un total de grupos con los cuales podemos ver y aproximar
su variabilidad
A un nivel aproximado de similitud de 0,75

A
B
C

E
F
G
H
I

K
L

Imagen 7. Dendrograma obtenido con el coeficiente de similitud de Dice.

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El dendograma muestra una proximidad entre los grupos 1 y 2 se podría entender que existe
una cercanía geográfica, mientras que el grupo 3 es el más lejano, esto podría explicarse
dependiendo de dónde hayan sido tomadas las muestras (figura 2) y con un bootstrapp de
1000 repeticiones mostró un alto porcentaje de loci que soporta la formación de los nodos
(tabla 5) lo que indica una alta confiabilidad de los loci utilizados en el análisis de la Guadua
y la efectividad de la técnica de RAMs.

4.42 Análisis de varianza molecular


Este análisis arroja que la variabilidad entre especies es del (7%), esto indica que a pesar de
que existe variabilidad esta según los datos esta es baja
Por otra parte, dentro de las especies existe más variabilidad (93%), esto nos indica la posible
existencia de subpoblaciones que aumentan dicha variabilidad

Imagen 8. Gráfico de porcentajes de variación del análisis de varianza molecular para


Bambusa excelsa y Guadua angustifolia

Source df SS MS Est. Var. %


Entre especies 1 17,917 17,917 0,889 7%
Dentro de
especies 10 125,833 12,583 12,583 93%
Total 11 143,750 13,472 100%
Tabla 4. Análisis de varianza molecular de las especies

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4.5 Discusión.
Los resultados obtenidos en el laboratorio sirvieron para llevar a cabo un proceso de
aprendizaje y fortalecimiento de las practicas de biología molecular, pues se obtuvieron
resultados muy buenos hasta la extracción y electroforesis de DNA total, a partir de allí
cuando se pretendía amplificar los RAMs los resultados no fueron los esperados, pues al
realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida no se obtuvo un bandeo definido de las
muestras como se muestra en la Imagen 5.)
Según (Morillo-2013) la amplificación por RAMs debe realizarse en condiciones donde la
muestras no se contaminen (Cabina de flujo) para que estos salgan según lo esperado. Un
ejemplo de un buen resultado en la amplificación de RAMs se muestra en la Imagen 6. Al
tener un resultado de esta calidad se podrán adelantar proyectos de una forma más sencilla,
además de ser más asertivos en sus conclusiones
5. Conclusión:
Los RAMs son una técnica de gran aporte a los proyectos de investigación de determinación
de variabilidad genética (Morillo-2013), sin embargo, su utilización ya no es válida, pues hoy
día existen técnicas más confiables con un porcentaje de error mucho más bajo
Determinar la variabilidad genética nos ayuda a estudiar las diferentes poblaciones de plantas
existentes en una zona o región específica, además podemos aprovechar esta información
para generar bancos de germoplasma que ayuden a mantener esta variabilidad
6. Bibliografía:

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