INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

UNIDAD INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIA

CAMPUS GUANAJUATO

MANUAL DE LABORATORIO DE TECNICAS

MICROBIOLOGICAS

Docentes
Karla Lizbeth Macías Sánchez
Estefany Abigail Garduño

Silao de la Victoria, Guanajuato

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índice

PREPARACIÓN DE FROTIS MICROBIANO ......................................................................3

Objetivos ......................................................................................................................................... 4
Introducción .................................................................................................................................... 4
Material y reactivos ......................................................................................................................... 5
Desarrollo experimental .................................................................................................................. 5
A. Preparación de un frotis....................................................................................................... 5
B. Tinción simple ......................................................................................................................... 6
C. Tinción diferencial (Gram) ......................................................................................................... 6
Resultados ....................................................................................................................................... 6
Tabla1. Resultados tinción simple .............................................................................................. 7
Tabla 2. Resultados tinción diferencial (Gram) .......................................................................... 8
Análisis y discusión de resultados ................................................................................................... 9
Conclusiones ................................................................................................................................. 10
Cuestionario .................................................................................................................................. 11
Referencias .................................................................................................................................... 12
Anexo ............................................................................................................................................ 13
PRACTICA 1. MICROSCOPIA ....................................................................................................... 13
• Alcohol acetona ................................................................................................................. 13
• Cristal violeta de Hucker .................................................................................................... 13
• Safranina............................................................................................................................ 13
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

UNIDAD INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIA

CAMPUS GUANAJUATO

Práctica 1

PREPARACIÓN DE FROTIS MICROBIANO

Y OBSERVACIÓN BAJO MICROSCOPIO ÓPTICO

Mesa 2

Gerardo Becerril Serna 2022660274

Ana Gabriela Corrales Ayala 2022660471
Edlin Jaqueline Cruz Camargo 2022660159
Angel Jair Pulido Santiago 2022660445
Itzel Fernanda Subias Mejia 2022660261

Lunes 29 de agosto de 2022, Silao de la Victoria, Guanajuato

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Objetivos

Que el alumno
Desarrolle habilidades y adquiera conocimientos sobre la correcta elaboración del frotis
microbiano.
Identifique los diferentes tipos de tinciones y sea capaz de realizar tinciones como la tinción
simple y la tinción Gram.
Sea capaza de utilizar un microscopio óptico compuesto de manera adecuada, además de
identificar las partes de este.

Introducción

La visualización de los microorganismos puede resultar complicada pero los procedimientos

de las tinciones en conjunto con la microscopía resulta una de las principales herramientas
en microbiología para observar, estudiar y analizar las propiedades y dividir los
microorganismos en grupos específicos con propósito de diagnóstico.
La extensión de los microorganismos de una muestra en un portaobjetos se denomina como
“frotis” y su correcta preparación es necesaria para la obtención de una imagen clara y nítida
durante la observación en el microscopio previamente sometido a un método de tinción.
Los procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen a las bacterias
son llamados “tinciones bacterianas” y existen diferentes métodos para llevarlos a cabo, entre
los más utilizados se encuentran: tinción de Ziehl-Neelsen, tinción de ácido alcohol
resistencia, tinción de endosporas, tinción de estructuras específicas, tinción de flagelos. Sin
mencionar los dos que serán utilizados en esta práctica siendo: tinción simple y tinción
diferencial (Gram).
En la tinción simple, como su nombre lo dice, es una de las más fáciles, pues al frotis se le
aplica un solo colorante (violeta de genciana, azul de metileno, fushcina diluida) y es
utilizada para destacar las formas y las estructuras celulares básicas del microorganismo
completo. Mientras que, en la tinción diferencial (Gram) se utilizan colorantes que se
componen de más de una sustancia tintórea; mediante esta técnica se obtiene información
acerca de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas.
La observación de estos microorganismos no es visible al ojo humano, por lo que será
necesario el uso de una herramienta, el microscopio este conjunto de lentes que concentra y
enfoca la luz sobre la muestra para formar imágenes visuales, basándose en la propiedad
física de la luz: la difracción.
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Material y reactivos

Material biológico (por equipo) Reactivos (por equipo)

1 Cultivo en caja Petri de Escherichia coli
de 24 horas de crecimiento.
1 Cultivo en caja Petri de Bacillus subtilis de
24 horas de crecimiento.
1 Cultivo en caja Petri de Escherichia coli
de una semana de crecimiento.
Cultivo en caja Petri de Bacillus subtilis
de1 semana de crecimiento.
1 gotero con 5 ml de alcohol al 96%
1 gotero con 5 ml de Cristal violeta (reactivo para
Tinción de Gram)
1 gotero con 5 ml de Yodo-lugol (reactivo para
Tinción de Gram)
1 gotero con 5 ml de Solución decolorante (acetona:
alcohol 1:1, reactivo para Tinción de Gram)
1 gotero con 5 ml de Safranina (reactivo para Tinción
de Gram)
Aceite de inmersión
Agua destilada

NOTA: La forma de preparación de las soluciones

se encuentran en el Anexo 1.
Equipo y material de laboratorio (por equipo)
1 microscopio
1 Pinza para portaobjetos
Papel seda

Desarrollo experimental

A. Preparación de un frotis

1. Desengrasar un portaobjetos, limpiándolo con una torunda de algodón impregnada

con alcohol y dejar secar. Etiquetar en un extremo del portaobjeto con un marcador
de tinta permanente.
2. Colocar en el portaobjetos una pequeña gota de agua destilada.
3. Pasar por la flama del mechero el asa bacteriológica la cual debe ser sostenida con la
mano derecha hasta que ésta se encuentre al “rojo vivo” y dejar enfriar
(aproximadamente 5 segundos). Con la mano izquierda y cerca del mechero, tomar y
abrir la caja Petri en la cual se encuentre el cultivo microbiano. Introducir el asa
bacteriológica estéril y fría y tomar una asada (porción de una colonia), cerrar la caja
Petri y colocar la muestra obtenida sobre el portaobjetos, extender la muestra.
4. Dejar secar la preparación cerca de la flama del mechero, una vez seca, fijar la
preparación, para ello pasar el portaobjetos sobre la flama del mechero tres veces, de
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tal manera que el portaobjetos caliente lo puedas soportar en tu dorso de tu mano, en

seguida se procede a teñir la preparación.

B. Tinción simple

1. Sobre el frotis, adicionar 3 gotas del colorante asignado (Safranina) y dejar 1 minuto.
2. Enjuagar el portaobjetos con agua destilada con ayuda de una piseta (el agua debe
deslizarse desde la parte superior del portaobjetos, sin que se adicione directamente
sobre el frotis.
3. Dejar secar la preparación.
4. Enfocar el microscopio.
5. Observar al microscopio usando los objetivos 40X y 100X.

C. Tinción diferencial (Gram)

1. Realizar el frotis y colocarlo en el puente de coloración.

2. Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
3. Lavar el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Cubrir el frotis con yodo-lugol (mordente) durante 1 minuto.
5. Lavar el frotis con agua destilada (el agua no debe caer directamente sobre la
muestra).
6. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) por 30 segundos.
7. Lavar inmediatamente con agua destilada.
8. Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante de 30 segundos
9. Lavar el frotis con agua destilada.
10. Secar el frotis y enfocar con los objetivos 40 X y observar.
11. Colocar una gota de aceite de inmersión, observar con objetivo 100X y observar.

Resultados

Se obtuvieron 8 diferentes resultados ya que 4 de ellos se realizaron mediante el proceso de

tinción simple y los otros 4 se realizaron mediante tinción diferencial (Gram). Dentro de los
los microorganismos que se utilizaron para ambas tinciones la se encontraba la Escherichia
coli con 24 hrs (Fig.1, Fig.5) y 1 semana de crecimiento (Fig.2, Fig.6), al igual que el Bacillus
subtilis con los mismos tiempos de crecimiento (Fig.3, Fig.7 y Fig. 4, Fig.8). En la Tabla 1.
se muestran los resultados hechos con Safranina y en la Tabla 2. se muestran los resultados
de la tinción diferencial y se puede apreciar si tienen un Gram positivo o negativo conforme
su coloración.
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Tabla1. Resultados tinción simple.

Microorganismo Safranina (coloración/forma) Imagen

Escherichia coli 24 hrs Coloración rosa/rojo claro, con
una forma de red de pequeños
círculos y huecos entre esas
redes que llegan a parecer
manchas.

Fig.1
Escherichia coli 1 Coloración rosa/rojo claro, con
semana una red más estrecha de
pequeños círculos, con algunos
espacios más definidos.

Fig.2
Microorganismo Safranina (coloración/forma) Imagen

Bacillus subtilis 24 hrs Coloración rosa/rojo claro con

una mancha obscura, una forma
de pequeños grupos dispersos.

Fig.3
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Bacillus subtilis 1 Coloración rosa/rojo claro,

semana incluso se podría decir que un
poco naranja con una forma de
una masa pequeña con
pequeñas ramificaciones.

Fig. 4

Tabla 2. Resultados tinción diferencial (Gram).

Microorganismo Coloración/ forma Gram + ó Imagen

Gram -
Escherichia coli 24 Manchas moradas Negativo
hrs con redes o
cúmulos de
pequeños círculos
de color rojo/ rosa
claro

Fig.5
Microorganismo Coloración/ forma Gram + ó Imagen
Gram -
Escherichia coli 1 Varios puntos Negativo
semana rojos/rosa claro y
unas pocas
manchas azules
muy pequeñas.

Fig.6
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Bacillus subtilis 24 Manchas Positivo

hrs moradas/azules un
poco dispersas con
pequeños círculos
sin una forma
definida.

Fig.7
Bacillus subtilis 1 Cúmulos en forma Positivo
semana de flores pequeñas
dispersos y unos
cuantos puntos
rosas/rojo claro

Fig.8

Análisis y discusión de resultados

En la tinción simple, se aplicó safranina en 4 diferentes frotis (2 de Escherichia coli y 2

de Bacillus subtilis), como se esperaba, podemos observar que están teñidas de un color
uniforme, siendo un rojo/ rosado el color predominante. Cuando comparamos las
muestras de 24 horas con las de más de una semana de crecimiento (correspondientes de
cada microorganismo), en las de 24 horas de crecimiento podemos notar una menor
presencia o acumulación de estos.

En Escherichia coli de una semana podemos observar la forma de los cocos más definida
en comparación con la forma de los cocos de la muestra de 24 horas. Mientras que en las
muestras de Bacillus subtilis podemos notar que en la muestra de 24 horas se puede
observar la forma como cocos o espiroquetas, mientras que en la muestra de más de una
semana podemos notar filamentos amontonados, el amontonamiento se puede atribuir a
una mala extensión del frotis.
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Los resultados en tinción simple se deben a que el colorante Safranina contiene un
cromógeno con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes
con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Así, provocando un incremento en
el contraste; todas las células absorbieron el colorante y quedaron teñidas del mismo color.
Según lo señalado por la Universidad Tecnológica Nacional (2009) informan que “El
colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular” (p. 2).
En las dos muestras (una de 24 horas y otra de una semana de crecimiento) de Escherichia
coli se observa la forma de cocos muy bien definidos y coloreados de los dos colores antes
mencionados, predominando el color rosado/rojo sobre el violeta/azul. Por lo que podemos
deducir que las bacterias corresponden a gram negativas, debido al color que adoptaron
después de la tinción.
Podemos observar que predomina el color violeta/azul lo que nos indica la presencia de
bacterias gram positivas, en el crecimiento de 24 horas podemos observar una acumulación
de pequeños circulitos que se pueden observar cómo cocos, en diferencia con la muestra de
1 semana se observa una menor acumulación de estos microorganismos. Esta acumulación
se la podemos atribuir a una mala extensión del frotis en el portaobjetos.
Según lo señalado por Physicochemical Principles of dyes used In Microbiology los
principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de
las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La
pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de
peptidoglucano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas
poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglucano, pero no cuentan con
membrana celular externa.

Conclusiones

Durante la elaboración de esta práctica se realizaron diferentes procedimientos como lo son

la preparación del frotis microbiano, fue de gran importancia el desengrasar los portaobjetos,
aunque tuvimos un problema que pudimos notar hasta el momento de observar a través del
microscopio, pero no afectó nuestros resultados. Se logró realizar con éxito los dos tipos de
tinciones las cuales permitieron la observación de las formas de las paredes celulares de
Escherichia coli y Bacillus subtilis, así como también se logró identificar entre gram
positivas y gram negativas. Todo esto fue observado y percibido por el ojo humano gracias
al uso del microscopio óptico compuesto que identificando y haciendo uso correcto de cada
una de sus partes, facilitó la interpretación de las imágenes formadas por las tinciones
permitiéndonos hacer nuestros análisis y anotaciones. Aunque aún se necesita de practica
para poder manejar con mayor rapidez cada procedimiento y hacerlos de forma correcta para
obtener resultados exactos, se considera que la practica se realizó con un buen tiempo y
calidad en cada uno de los procedimientos.
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Cuestionario

1. ¿Cuál es la función de los Colorantes y en qué se fundamenta su uso en

Microbiología?
Los microorganismos no teñidos muestran pocos detalles morfológicos es por ello que es
necesario teñir la célula para poder observar con detalle sus componente para tener un
mejor estudio, en el campo de la física, la óptica explica cómo todos los objetos son
observables dependiendo de las longitudes de onda que se absorben y se transmiten
dentro del denominado “espectro visible”. Dichas transiciones se deben, a su vez, a los
compuestos químicos y a los movimientos electrónicos dentro de los átomos. Así mismo,
cuando interacciona un colorante con una célula o un tejido, ocurren reacciones que
dependen de grupos químicos funcionales denominados cromóforos y auxocromos.
2. Nombre los agentes usados y la acción propuesta para cada uno de los siguientes
reactivos usados en la tinción Gram.
a. Mordante
Yodo Lugol, sirve como mordiente para que el cristal violeta no salga de la célula
b. Color primario (tinción primaria)
Cristal violeta, se tiñe toda la célula el cual tiene afinidad por el peptidoglucano
c. Decolorante
Alcohol-acetona, deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma
d. Contra tinción
Safranina, actúa como colorante secundario o de contra tinción y tiñe las bacterias que
no logran retener el complejo cristal violeta-yodo
3. ¿Por qué se debe usar cultivos nuevos (de 24 horas o menos) para hacer la tinción
Gram?
La tinción de Gram se puede hacer en unas horas, los resultados ayudan a los proveedores
a elegir los primeros antibióticos a usar.
4. ¿Qué parte de la célula bacteriana es la más involucrada en la tinción Gram y por qué?
La pared celular porque hay do tipos de bacterias en el cual se clasifican por Gram
positivas y Gram negativas, en cual la Gram negativas posen una fina capa de
peptidoglicano y las Gram positivas posen una pared gruesa de peptidoglicano que ayuda
a retener con facilidad el cristal violeta y esto hace que tengan un color morado o azul
mientras que las Gram negativas al tener una capa delga no retienen el cristal violeta y se
tiñen con safranina obteniendo el color rojo o rosado
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Referencias

Tincion simple. (2013, 24 noviembre). Blogger.

http://estudiantesenlaboratoristaquimico.blogspot.com/2013/11/tincion-simple.html

Biol. (s.f.). Tinción de microorganismos. Obtenido de Academic Edu:

https://academic.uprm.edu/~lrios/3725/Ejercicio4.pdf
José María Monteagudo Fontana, A. E. (11 de Septiembre de 2021). Revista Sanitaria de
Investigación (RSI). Obtenido de Examen microscopico, tipos de tinciones
bacterianas.: https://revistasanitariadeinvestigacion.com/examen-microscopico-
tipos-de-tinciones-bacterianas/
López, T. C. (2019). StuDocu. Obtenido de Preparación de un frotis y tinción simple:
https://www.studocu.com/es/document/universidad-de-
sevilla/microbiologia/practica-4-preparacion-de-frotis-y-tincion-simple/2800945
Microbiología Net. (s.f.). Obtenido de Técnicas de observación microscópica:
https://microbiologia.net/microbiologia/microscopios-colorantes-tinciones/
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Anexo

PRACTICA 1. MICROSCOPIA
Preparación de soluciones

• Alcohol acetona:
Alcohol etílico de 95% 50mlAcetona 50 ml
Mezclar los ingredientes respectivos. Guardar en frasco con tapón
esmerilado yEtiquetar. (Reactivo para la tinción de Gram.).

• Cristal violeta de Hucker:

Solución A:
Cristal violeta 2.0 g Alcohol etílico (al 95%) 20 mLSolución B:
Oxalato amónico 0.8 g
Agua destilada 80 mL
Mezclar las soluciones A y B, almacenar durante 24 horas y filtrar a través de
papel filtro Watman No.1 Rotular y conservar en frasco ámbar.

• Safranina:
Safranina O. (solución al 2.5 % en alcohol etílico al 95%) 10 ml Agua
destilada 100 ml
Disolver la safranina en el alcohol, de esta solución tomar 10 ml y añadirle 100 ml de
agua destilada yfiltrar. Almacenarla en una botella ámbar y rotular.