CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

11. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS

1. Introducción.

La producción industrial de enzimas es un campo muy extenso, por lo que veremos

aspectos generales. Antes de empezar, vamos a ver como comenzó la utilización de
enzimas a nivel industrial.

Fuente: Wood BJ (1998). Microbiology of Fermented Foods. Thomson Science, United

Kingdom.

Aunque las enzimas se utilizan desde hace muchos años, el desarrollo de una verdadera
industria no comienza hasta finales del siglo XIX.

- El uso de enzimas se inició en 1874: producción de renina a partir de estómagos

de ternero para la fabricación de queso.
- En 1890, Takamine desarrolló la producción, a partir de A. oryzae, de takadiasa,
una mezcla de amilasas y proteasas para ayuda digestiva.
- En 1954 se lleva a cabo el primer escalamiento industrial (producción de enzimas
por fermentación sumergida).
- El principal desarrollo de la industria se dio con la incorporación de las proteasas
en los detergentes durante los años 60.

178
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

- La introducción generalizada de la fermentación (años 60) y la llegada de la

ingeniería genética, han contribuido significativamente a la expansión de la
producción industrial de enzimas.

En la actualidad, enzimas a la carta: los microorganismos son ahora la principal fuente

de enzimas para una amplia variedad de aplicaciones.

La producción industrial de enzimas requiere de las siguientes

etapas:

- Selección de la fuente.
- Aislamiento.
- Purificación.

Se trata de un proceso integrado en el que las tres etapas están relacionadas, de modo
que:

- La fuente de la enzima puede condicionar tanto los procedimientos de extracción

como los de purificación.
- La aplicación final de la enzima puede determinar el grado de purificación
requerido.
- La escala a la que se realice la operación puede delimitar las técnicas que, en la
práctica se pueden aplicar.

Veremos como se relacionan estos procesos a lo largo de tema.

2. Fuentes de enzimas.

Las fuentes de obtención de enzimas son: animal, vegetal y microbiana.

Para la obtención de enzimas a gran escala es importante seleccionar la fuente que sea
capaz de sintetizar una gran cantidad de la enzima deseada.

Hasta los años 30 las principales fuentes eran animales y vegetales. Hoy en día, la gran
mayoría de las enzimas con de origen microbiano.

179
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

- Animal. Aunque en poca cantidad se producen enzimas como:

o Pepsina (mucosa gástrica).
o Tripsina (páncreas).
o Quimosina (estómago de ternero).
Con fines analíticos y medicinales se pueden preparar encimas
altamente purificadas de algunos órganos (hígado, páncreas,
…).

- Vegetal. En pequeña cantidad en comparación con las fuentes microbianas.

Algunas de las enzimas de origen vegetal que se producen son:
o Amilasas (cereales).
o Papaína (papaya).
o Ficina (higuero).
o Bromelina (piña).

Surgieron problemas asociados a la utilización de fuentes animales y vegetales para

cubrir la demanda creciente de enzimas, así como los tiempos de generación de las
mismas, el control sanitario de los animales, la estacionalidad de los vegetales o la
elevada cantidad de subproductos que se obtienen.

Esto condujo a la utilización de microorganismos como fuente para la producción de

enzimas a partir de los años 70.

- Microbiana. La inmensa mayoría de las enzimas que se utilizan son microbianas

(bacterias y hongos). Algunos ejemplos de microorganismos utilizados:
o Aspergillus niger.
o Mucor miehei.
o Bacillus subtilis.
o Saccharomyces cerevisiae.

Es muy importante la selección del microorganismo: tienen que ser considerados

seguros (GRAS, generally recognized as safe).

180
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

Presentan una serie de ventajas:

ECONOMICAS:
o Producción a gran escala: pueden producirse rápidamente y en grandes
cantidades.
o Menores costes de producción, en comparación con animales y plantas.
o Facilidad de extracción (se verán las técnicas más adelante)
o Predictibilidad en el rendimiento de la enzima: se estandariza el método
de producción de forma que se puede conocer la cantidad de enzima que
se puede obtener, cuál va a ser su actividad, …
o Ausencia de variaciones estacionales: son independientes de la
ubicación y de la temporada del año.

TÉCNICAS:

o Enorme variedad de vías metabólicas: el metabolismo microbiano es muy

variado; se puede obtener un producto de interés utilizando un tipo u otro
de microorganismo y/o controlando el medio de cultivo, las condiciones
de crecimiento, …
o Amplio rango de condiciones ambientales: existen microorganismos que
viven en condiciones extremas, como termófilos y halófilos, que
presentan enzimas mucho más resistentes a la desnaturalización en
condiciones extremas de temperatura o salinidad elevadas,
respectivamente.
o Corto tiempo de generación: se reproducen rápidamente.
o Se pueden “modificar” para generar “enzimas a la carta”.

3. Producción de enzimas por fermentación.

La mayor parte de las enzimas industriales se producen por fermentación sumergida.

Para ello, se seleccionan las condiciones óptimas de producción: composición del

medio, pH, temperatura, operación en continuo o en discontinuo.

181
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

Hay dos aspectos importantes para controlar la producción microbiana de enzimas:

- Síntesis de enzimas en función del crecimiento microbiano: si nos fijamos en el

gráfico, cada enzima se produce en un momento determinado del crecimiento
microbiano, por lo que es necesario conocer dicho momento para optimizar el
proceso de producción.

- Control genético. Los microorganismos producen dos tipos de enzimas:

o Enzimas constitutivas:
• Se encuentran en proporción minoritaria respecto al total de
enzimas.
• Están implicadas en general en aspectos centrales del
metabolismo.
• Se producen continuamente al margen de la presencia o no de
ningún sustrato.
o Enzimas inductivas:
• Es un grupo mucho más amplio.
• Son sintetizadas en proporciones muy bajas hasta que un
sustrato adecuado pasa a estar disponible por el organismo,
entonces ese sustrato o un producto de su degradación induce un
gran incremento de la síntesis.
• A este sustrato se le denomina inductor.

182
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

En la siguiente tabla se muestran algunas enzimas de interés obtenidas por

fermentación.

Fuente: Hernández A (2003). Microbiología industrial. Editorial Universidad Estatal a

Distancia, Costa Rica.

183
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

4. Extracción y purificación de enzimas.

El primer paso para el aislamiento y purificación de una enzima es su extracción.

El método de extracción depende de:

- Naturaleza de la fuente. En general, tejidos animales o vegetales, más blandos,

se trituran fácilmente picándolos o batiéndolos. Los microorganismos son más
robustos desde el punto de vista mecánico, necesitando métodos más vigorosos.
- Escala de operación: pequeña o gran escala; no todas las técnicas disponibles
son adecuadas para trabajar a gran escala.
- Estabilidad de la enzima. Hay enzimas que son más inestables y precisan
técnicas más cuidadosas que otras.
- Pureza en la que se necesite. Si van a ser de pureza muy elevada el proceso de
extracción habrá de ser más cuidadoso; no se deberán usar técnicas o
materiales que puedan dar lugar a la contaminación del producto final.
- Localización celular. Va a condicionar la técnica a utilizar:

Algunos de los métodos de extracción más utilizados son:

- Químicos.
o Álcalis (pH 11-12.5). Se somete el medio a un pH alcalino; se rompen
membranas; el éxito del tratamiento depende de la estabilidad de la
enzima a esos valores de pH; a pequeña y gran escala.
o Lisozima y EDTA. Se rompen paredes celulares; más susceptibles
bacterias Gram+; proceso caro, por lo que no se utiliza a gran escala.
o Detergentes. Se rompen membranas; importante controlar bien el
proceso para no precipitar proteínas.
o Choque osmótico. Ruptura de membranas; para extracción de enzimas
periplasmáticas (recuerda que es el espacio periplasmático).

184
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

- Físicos.
o Sonicación. Células en medio líquido se someten a
ultrasonidos. Útil a escala de laboratorio, no a gran
escala (dificultad de transmitir suficiente potencia a
grandes volúmenes).
o Congelación y descongelación. Se rompen membranas. Inconvenientes:
se pueden formar cristales; puede perderse actividad enzimática.
o Cizalla líquida. Se pasa una suspensión celular a través de una válvula,
con un pequeño orificio, a presiones muy elevadas; la rotura celular se
produce por caída brusca de presión.
o Trituración o agitación con abrasivos. Se mezcla una suspensión celular
con un agente que actúa como abrasivo (perlas de vidrio) y se somete a
trituración o agitación.

Una vez extraída la enzima de interés comienza la purificación necesaria para eliminar
del medio restos celulares, …

Vamos a ver cuales son las principales etapas en la purificación de un extracto

enzimático:

- Eliminación de ácidos nucleicos.

o La lisis celular, producida en la extracción, puede dar lugar a la liberación
de ácidos nucleicos (depende del tipo celular, siendo más frecuente en
procariotas), lo que produce:
• Problemas de viscosidad (importante a escala industrial).
• Interferencia en procesos cromatográficos.
o Para eliminar los ácidos nucleicos, se pueden utilizar los siguientes
métodos:
• Precipitación con policationes de elevado peso molecular (p.e.
polietilenimina). Importante: eliminar residuos del polímero (o de
unidades monoméricas del mismo) al finalizar el proceso.
Proceso caro.
• Enzimático (con nucleasas). Método fácil, eficiente y económico.
El más utilizado.

185
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

- Eliminación de restos celulares. Para eliminar restos celulares se utilizan

fundamentalmente dos técnicas:
CENTRIFUGACIÓN.
o Separación de componentes en base a sus diferencias de tamaño, forma
y densidad que hace que el efecto de la gravedad sea diferente.
o Se utiliza a media escala. A gran escala se utilizan centrífugas de flujo
continuo (los sólidos depositados quedan en el recipiente y el
sobrenadante clarificado va siendo descargado continuamente).

FILTRACIÓN.
o Método de separación física utilizando filtros o membranas.
o Si las soluciones a filtrar son gelatinosas o viscosas, es necesario utilizar
auxiliares de filtrado, o ajustar las condiciones de precipitación, para
lograr un precipitado floculante, que si se puede filtrar.
o Se puede utilizar a gran escala.

- Purificación y concentración son las siguientes etapas en la producción de

enzimas y pueden producirse de manera simultánea en algunos casos.
Existen diversos métodos. La elección de uno u otro depende de la fuente
biológica y de la concentración de la enzima, y se basan en las distintas
propiedades físico-químicas de las proteínas.

186
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

La elección de un determinado procedimiento es cuestión de ensayo y error: hay

que probar procedimientos y seleccionar.
Estos son los métodos que vamos a ver, algunos de los más habituales.
o Precipitación.
 Precipitación por salado.

Es uno de los métodos más utilizados en las primeras etapas.

La solubilidad de las proteínas depende en gran medida de la concentración salina

(fuerza iónica) del medio.

Las proteínas se mantienen disueltas gracias a interacciones con el agua. Cuando se

añade sal a una solución de proteína, una parte del agua forma enlaces ion-dipolo con
la sal. Al haber menos agua disponible para hidratar las proteínas, comienzan a
interactuar hidrofóbicamente entre ellas.

La concentración salina de una disolución se puede expresar como fuerza iónica (I):

A bajas concentraciones, la presencia de sales incrementa la solubilidad de las

proteínas (“salting-in”).

A elevada concentración de sal se produce la agregación y precipitación de las proteínas

(“salting-out”).

Una de las sales más utilizadas es el sulfato amónico. Esto es debido a su gran
solubilidad, ausencia de efectos perjudiciales para la mayoría de las enzimas, no ser
cara y, en algunos casos, por su efecto estabilizante de ciertos enzimas.

187
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

La solubilidad de una proteína dada varía en función del tipo de ion.

En la siguiente figura vemos la solubilidad de la carboxihemoglobina en distintos tipos

de sales.

Fuente: Voet D y Voet JG (2006). Bioquímica (3ª Edición). Editorial Médica

Panamericana, S.A.

La solubilidad de la carboxihemoglobina en su punto isoeléctrico en función de la fuerza

iónica y el tipo de ión. S y S+ son las solubilidades de la proteína en solución salina y en
agua pura, respectivamente. Se graficó el logaritmo del cociente entre ambas
solubilidades para poder colocar las curvas de solubilidad en una misma escala.
Tomado de Green, AA. J Biol Chem 1932; 95, 47.

La concentración de sal a la que precipita una proteína varía, de una proteína a otra, lo
que puede utilizarse para fraccionar proteínas  Precipitación por salado.

Mediante el ajuste de la por salado concentración salina de una solución que contiene
una mezcla de proteínas hasta el punto inmediatamente inferior al de precipitación de la
proteína de interés pueden eliminarse de la solución proteínas contaminantes. Si se
elimina el precipitado (centrifugación o filtración), quedaría en disolución la proteína de
interés, que podría precipitarse incrementando de nuevo la concentración salina (Voet
D y Voet JG, 2006).

188
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

 Modificación del pH.

El pH influye en la solubilidad de las proteínas, ya que en el punto isoeléctrico (carga

neta 0) la solubilidad es mínima.

Se denomina precipitación isoeléctrica al proceso de precipitación de proteínas en sus

puntos isoeléctricos.

Recuerda el concepto
de punto isoeléctrico

189
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

 Disolventes orgánicos.

Los solventes orgánicos polares (metanol, etanol, acetona, …) pueden provocar la

precipitación de las proteínas a determinadas concentraciones.

Cuando se van añadiendo cantidades recientes de solventes orgánicos, las moléculas

de proteína interaccionan más con otras moléculas de proteína que con el agua. La
formación de complejos entre las proteínas continúa hasta que se alcanza un punto en
el que la proteína precipita.

La adición de sal a un medio en el que se han añadido solventes orgánicos aumenta la

solubilidad de la proteína.

o Separación en dos fases líquidas.

Un sistema en dos fases se prepara mezclando soluciones inmiscibles,
por ejemplo:
• polietilenglicol + dextrano.
• polietilenglicol + sulfato amónico.

Las proteínas y los restos celulares se reparten entre las dos fases, lo
que permite la separación de componentes según la fase en la que se
localicen.

190
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

Las ventajas de este método son:

• Es un método suave.
• Muchos de los polímeros utilizados estabilizan proteínas.
• Generalmente rendimiento elevado de recuperación proteica.
• Pocas dificultades para realizar a gran escala.

La localización de una determinada enzima en una de las fases depende

de:

• Peso molecular de la enzima.

• pH y fuerza iónica de la mezcla.
• Presencia de iones polivalentes.

Por lo que hay que determinar experimentalmente las condiciones

óptimas de reparto para cada enzima.

o Cromatografía en columna es uno de los métodos más empleados para

la purificación de proteínas.
Se utiliza en fases finales, en extractos parcialmente purificados y
concentrados.
Recordemos que la cromatografía es un método físico de separación en
el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una
inmóvil (fase estacionaria) y otra (fase móvil) que se mueve en una
dirección determinada a través de la primera. (IUPAC).
• Fase estacionaria: sólida o líquida.
• Fase móvil: líquida o gaseosa.

191
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

Puede ser de distintos tipos y se puede clasificar en base a distintos

criterios:
• Naturaleza fase móvil y estacionaria (p.e. líquido-líquido).
• Polaridad fase estacionaria (normal, fase reversa).
• Forma lecho cromatográfico (plana, en columna).
• Mecanismo de retención (reparto, filtración en gel, intercambio
iónico, adsorción, afinidad)

FILTRACIÓN EN GEL.

Separación de moléculas en base a su tamaño.

La fase estacionaria está compuesta por microesferas de un material

hidratado poroso, como el dextrano, la agarosa o la poliacrilamida.

192
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.

Separación de moléculas en base al signo y la magnitud de las cargas
netas de las proteínas a un pH determinado.
La matriz (fase estacionaria) retarda el paso de las moléculas de carga
opuesta.
La matriz es un polímero sintético (resinas) con grupos cargados:
• Intercambiadores catiónicos (grupos negativos).
Ejemplo: carboximetil (CM)-celulosa.
• Intercambiadores aniónicos (grupos positivos).
• Ejemplo: dietilaminoetil (DEAE)-celulosa.

193
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN.
Las moléculas se adsorben físicamente por uniones de Van der Waals o
enlaces de hidrógeno a la superficie de una matriz (fase estacionaria).
Una de las más utilizadas es la hidroxiapatita (forma insoluble de fosfato
de calcio).

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.
Se basa en la unión de las proteínas a moléculas específicas.

194
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

o Electroforesis en continuo.
La electroforesis es una técnica para la separación de las moléculas
según la movilidad de éstas en un campo eléctrico.
En la electroforesis en flujo continuo se pasa una corriente continua de
muestra sobre el buffer que se mueve en forma vertical entre dos capas.
Los electrodos están en la parte lateral y hay un sistema de enfriamiento
por refrigerantes.

o Ultrafiltración y diálisis.
Estos métodos se utilizan en las últimas fases, normalmente para la
eliminación de sales.
En ambos casos se utilizan membranas semipermeables.
La diálisis se suele utilizar a pequeña escala (laboratorio); no es
adecuada a gran escala (es cara, se requiere un elevado volumen de
agua).
La ultrafiltración se diferencia de la diálisis en que se aplica presión. Se
utiliza a gran escala.

195
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

- Concentrado y envasado.
o A pequeña escala se suelen preparar las enzimas liofilizadas, aunque
también se pueden encontrar en otros formatos.
o A gran escala se suelen envasar formando grano o cápsulas, o como
soluciones concentradas.

196
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

5. Consideraciones legales para la producción de enzimas.

Aunque las enzimas son productos naturales, las compañías responsables de su

producción se esfuerzan en asegurar que sus productos no planteen riesgo a los clientes
y consumidores.

En la mayor parte de los países la normativa que se aplica a la producción de enzimas

es la que controla los productos químicos.

Existen asociaciones, como la Asociación de Manufactureros y Formuladores de

productos enzimáticos (AMFEP) fundada en 1977, que representan, promueven y
defienden los intereses, el uso seguro y los marcos reguladores de productores de
enzimas.

197
CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

A modo de ejemplo, se muestra la página web de Novozymes en la que informa sobre

el cumplimiento de la normativa aplicable: https://www.novozymes.com/es/regulatory-
compliance.

198