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Tema 12. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. INTRODUCCIÓN

En el tema 10, en el apartado de introducción, se indicó que las enzimas se podían

aplicar en forma libro o inmovilizada.

En este tema vamos a ver qué se entiende por enzimas inmovilizadas, qué métodos de
inmovilización existen y cómo afecta el proceso de inmovilización a las propiedades de
las enzimas, entre otros aspectos.

Empezamos definiendo qué se entiende por enzimas inmovilizadas... El

término enzima inmovilizada fue adoptado por primera vez en la Primera
Conferencia sobre Tecnología Enzimática (1971, New Hampshire, USA):

 “Enzimas confinadas físicamente o localizadas

en una región definida del espacio con retención
de su actividad catalítica, y que pueden ser
utilizadas repetida y continuadamente”

Aunque las enzimas son catalizadores eficientes y efectivos, no siempre son ideales
para aplicaciones prácticas. Algunas de sus ventajas pueden convertirse en desventajas
en algunos casos. Así, por ejemplo, generalmente son inestables y es difícil utilizarlas
con disolventes orgánicos o a temperaturas elevadas.

 Para intentar solventar estos problemas se desarrolló una nueva tecnología

basada en la inmovilización de enzimas.
 Para hacernos una idea de la importancia de la inmovilización de enzimas vamos
a fijarnos en datos científicos…

La primera enzima (invertasa) se

inmovilizó en 1916 ...

...desde entonces más de 10000

publicaciones... y la cifra sigue
creciendo...

199
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Cuando se aplica una enzima inmovilizada las ventajas deben superar a inconvenientes.

INCONVENIENTES

 Posibles alteraciones de la enzima: pueden producirse cambios en las

propiedades, pérdida de actividad, etc.

 Mayores costes: hay que tener en cuenta los costes asociados a la inmovilización
en si misma (soporte, proceso de inmovilización, etc.)

 Limitaciones en la transferencia de masa: a veces, la propia presencia del soporte

puede limitar el movimiento de las moléculas (sustrato, producto, cofactores,...)

VENTAJAS

 Aumento de la estabilidad de la enzima: protección frente a cambios de pH, Ta,

fuerza iónica, contaminación y acción de proteasas.

 Posibilidad de reutilización: utilizar más veces disminuyen los costes del proceso.

 Posibilidad de uso en procesos en continuo: esto es especialmente importante

para que el catalizador inmovilizado se mantenga en un ambiente constante, lo
que es determinante para la estabilidad de la enzima.

 Aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los productos: porque es

más fácil retirar la enzima del medio de reacción al estar inmovilizada.

2. TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN

2.1. - Clasificación de las enzimas inmovilizadas

En esta tabla se
esquematizan las principales
técnicas de inmovilización
según la clasificación que se
acaba de indicar. Se señala
con letras la equivalencia
con la clasificación anterior.

Este es el esquema que se

seguirá a lo largo del tema.

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Existen distintas técnicas para inmovilizar enzimas. Una primera clasificación las divide
en tres grandes grupos en función de si tras la inmovilización la enzima permanece
soluble o no….

A. Enzimas modificadas con técnicas adecuadas hasta ser insolubles en agua.

B. Enzimas solubles utilizadas en reactores equipados

con membranas de ultrafiltración semipermeables, que
permiten el paso de los productos de reacción,
reteniendo las moléculas de enzima dentro del reactor.

C. Enzimas cuya movilidad ha sido restringida al unirlos con macromoléculas, pero

de forma que la molécula global formada sea aún soluble en agua.

A. ENZIMAS INMOVILIZADAS INSOLUBLES

A.1. Inmovilización por atrapado

Esta técnica supone la localización de la enzima dentro de la red

espacial de una matriz polimérica o de una membrana, de forma que se
evita la liberación de la proteína sin impedir la penetración del substrato.

Se suele utilizar con enzimas en las que las moléculas de producto y de substrato son
relativamente pequeñas (para que puedan moverse a través de la matriz) La enzima no
está unida al soporte de ninguna manera.

o Existen distintos tipos de inmovilización por atrapado:

 En geles

 Las enzimas quedan atrapadas en los espacios intersticiales

de geles poliméricos entrecruzados insolubles en agua.
 Se pueden utilizar distintos tipos de geles (p.e. alginato, quitosano,
poliacrilamida).

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 En fibras
 Las enzimas quedan atrapadas dentro de las
microcavidades de fibras sintéticas.
 Para la elaboración de las fibras se utilizan aparatos
similares a los utilizados en la industria textil.
 Uno de los polímeros más utilizados es el acetato
de celulosa (es económico y resistente).

 Microencapsulado

 Consiste en atrapar a las enzimas en membranas poliméricas

semipermeables esféricas con diámetros entre 5- 300 m.
 El microencapsulado se puede llevar a cabo en
liposomas, que son vesículas constituidos por
fosfolípidos dispuestos en forma de bicapas concéntricas
muy ordenadas, separadas por compartimentos acuosos.

A.2. Inmovilización por enlace a un soporte

Es el método más antiguo y común de inmovilización de enzimas. El enlace puede

establecerse mediante...
 Adsorción física
 Unión iónica
 Quelación o unión metálica
 Unión covalente

Existen una gran variedad de soportes, con características muy diferentes; sin embargo,
hay una serie de propiedades, consideradas ideales, que debería de tener un soporte.
Así, el soporte ideal es aquel que...

 Incremente la interacción de la enzima con el sustrato

 Disminuya la inhibición por producto
 Cambie el valor de pH óptimo hasta el valor deseado
 Frene el crecimiento microbiano
 Sea fácilmente recuperable
 Sea estable en solución
 Sea rígido mecánicamente y tenga un grado de compactación bajo si se
emplea en reactores de lecho fijo.

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Vamos a ver las principales características de cada uno de estos tipos de

inmovilicación…

 Adsorción física
 Se basa en la adsorción física de las moléculas de enzima en la superficie
de una matriz sólida poniendo en contacto una solución acuosa de la
enzima con el soporte.
 La unión depende de las condiciones del proceso: pH, naturaleza del
solvente, fuerza iónica, concentración de enzima y de soporte, tiempo y
temperatura.
 Las fuerzas de unión entre enzima y soporte son relativamente débiles
(enlaces de H, interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der Waals).
 Al ser uniones débiles, se puede producir la
desorción de la enzima del soporte, lo que
puede ser un problema o una ventaja si se
quiere reutilizar el soporte (p.e. soportes caros).

En esta tabla se recogen algunos soportes utilizados para la inmovilización por

adsorción:

Tabla 1. Adsorción a portadores para la inmovilización de la enzimas

Tipo de Portador Portador Enzima utilizada

Óxido de aluminio Glucosamilasa
Bentonita Invertasa
Inorgánico
Vidrio Lipasa
Gel de fosfato cálcico Aspartasa
Glucosa oxidasa
α-amilasa
Carbón activo β-amilasa
Glucoamilasa
Orgánico
Invertasa
Almidón α-amilasa

Tanino- Glucosa-isomerasa
aminohexilcelulosa Aminoácilasa

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 Unión iónica
 Se basa, principalmente, en la unión iónica de las moléculas de enzima a
soportes sólidos que contienen restos cambiadores de iones.

Los cambiadores de iones se clasifican en aniónicos y catiónicos,

dependiendo de su capacidad para cambiar aniones (cloruro o hidroxilo) o
cationes (iones hidrógeno y sodio).

Algunos de los soportes utilizados son: DEAE-celulosa

(dietilaminoetilcelulosa) o CM-celulosa (carboximetilcelulosa)

 La fuerza de unión es más fuerte que en la adsorción física, pero menor

que en el enlace covalente.
 Se pueden utilizar soportes orgánicos (derivados de polisacáridos como
dextrano y celulosa), soportes inorgánicos (p.e. sílice) o polímeros
sintéticos (principalmente derivados del poliestireno)

 Quelación o unión metálica

 Esta técnica implica el uso de metales de transición como forma de activar
la superficie del soporte, permitiendo el acoplamiento directo de la enzima
sin transformación química previa del soporte a través de la formación de
quelatos.
 La unión es reversible.
 Algunos ejemplos de soportes son:
quítina, ácido algínico, gelatina o
celulosa.
 Como metales se pueden utilizar el
titanio o el zirconio (circonio).

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 Unión covalente
 Se basa en la unión covalente de la enzima a matrices insolubles en agua.
 La metodología consiste en activar grupos químicos del soporte para que
reaccionen con las cadenas laterales de los aminoácidos accesibles en la
superficie de la proteína.
 La unión es irreversible.
 La unión de la enzima al
soporte debe implicar
grupos funcionales que no
sean esenciales para la
acción catalítica. Para ello,
es importante proteger el
centro activo de la enzima
(p.e. realizando el proceso
en presencia de un sustrato
o un inhibidor competitivo).

En esta tabla se muestran los grupos químicos de los aminoácidos más

empleados para la inmovilización de enzimas por unión covalente.

A.3. Inmovilización por entrecruzamiento (cross-linking)

Se basan en la formación de enlaces covalentes entre las

moléculas de enzima, mediante reactivos bi- o
multifuncionales, dando lugar a la formación de agregados
tridimensionales entrecruzados totalmente insolubles en agua.

En esta imagen se muestra uno de los métodos más utilizados para este tipo de
inmovilización, que consiste en usar glutaraldehído como agente entrecruzante...

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B. ENZIMAS INMOVILIZADAS SOLUBLES SIN TRANSFORMACIÓN QUÍMICA

Supone el confinamiento físico de las enzimas utilizando membranas semipermeables,

fibras huecas o membranas de ultrafiltración.

En estas imágenes se pueden ver algunas estrategias utilizadas para el confinamiento

físico de las enzimas, en ambos casos en reactores que trabajan en continuo.

 En a) las enzimas se localizan en el reactor y se evita que escapen utilizando

membranas de ultrafiltración.
 En b) las enzimas se localizan en el interior de fibras huecas.
 En c) vemos como la presencia de una membrana impide la salida de la enzima
(E) pero no del producto (P).
 En d) observamos lo que sucede en una fibra hueca; se permite la entrada de
sustrato (S) y la salida de producto (P), pero la enzima permanece en el interior
de la fibra.

C. ENZIMAS INMOVILIZADORAS SOLUBLES CON TRANSFORMACIÓN QUÍMICA

Consiste en la preparación de conjugados enzima-polímero solubles en agua.

Se lleva a cabo mediante reacciones similares a las empleadas en el acoplamiento

químico de enzimas a polímeros insolubles.

Su uso es limitado, ya que es tiene como desventaja

la necesidad de una laboriosa purificación una vez
finalizado el proceso de catálisis enzimática.

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3. PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS

No existe un método ideal de inmovilización. Cada uno presenta unas determinadas

características, como podemos observar en la tabla adjunta.

Además, la elección de un método u otro, así como de un soporte determinado, depende

de importantes factores, como el tipo de enzima, cómo afecta la inmovilización a las
propiedades de la enzima y la aplicación final.

Cuando una enzima es inmovilizada su microambiente y su estructura tridimensional

pueden cambiar, lo que puede hacer que sus propiedades sean diferentes a las de la
enzima libre.

De cara a la aplicación de una enzima inmovilizada, es esencial conocer cómo va a

afectar la inmovilización a sus propiedades.

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas van a depender del tipo de enzima, del
soporte y del tipo de asociación que se establezca entre ambos.

Vamos a ver, brevemente, como afecta la inmovilización a las propiedades de las

enzimas.

¿Cómo afecta la inmovilización a las propiedades de las enzimas?

 Efecto sobre la actividad enzimática

 Efectos conformacionales e impedimentos estéricos

 Reparto desigual limitada y difusión estabilidad

 Efectos del pH

 Efectos sobre la estabilidad enzimática

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 Efectos sobre la actividad enzimática

La actividad de una enzima inmovilizada, en comparación con su forma soluble, se

puede ver afectada principalmente por las siguientes razones...

a) Efectos conformacionales e impedimentos estéricos

La inmovilización puede producir la inactivación total o parcial de una enzima

si como consecuencia del proceso se altera la estructura de la proteína
(ejemplo (c) de la figura o se ve afectado algún grupo esencial del centro activo
de la enzima).

También puede suceder que, tras la inmovilización, debido a impedimentos

estéricos (ejemplo (d) de la figura), el sustrato no pueda acceder al centro activo
de la enzima.

(a) Enzima libre

(b) Enzima inmovilizada activa

(c) Enzima inmovilizada inactiva

(perturbación estructural en la proteína)

(d) Enzima inmovilizada inactiva

(impedimento estérico)

b) Reparto desigual y difusión limitada

Como consecuencia de la inmovilización se puede producir un reparto

desigual de solutos, de modo que la concentración de éstos en el microentorno
de la enzima y el grueso de la disolución sea distinta. Esto puede ser debido a
interacciones hidrofóbicas o electrostáticas de estos solutos con el soporte de
inmovilización.

En esta imagen se
muestran dos ejemplos de
reparto desigual entre el
microentorno de la enzima
y el grueso de la disolución.

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Por otra parte, se puede producir una difusión limitada de moléculas de soluto
debido a la presencia física de la matriz, lo que puede conducir al agotamiento
de las moléculas de sustrato y la acumulación del producto alrededor de las
enzimas.

En esta imagen se muestra un ejemplo

de cómo la presencia física del soporte
afecta a la difusión de los solutos. Así, se
observa como alrededor de la enzima (E)
va disminuyendo la cantidad de sustrato
(S) y aumentando la de producto (P).

c) Efecto del pH

El entorno de una enzima inmovilizada es diferente al de la enzima libre, sobre

todo cuando se encuentra unida a un soporte cargado eléctricamente.

Las curvas pH-actividad pueden verse distorsionadas, desplazadas o

ensanchadas como consecuencia de la inmovilización.

En la figura se muestra el efecto de un soporte sobre el perfil de pH de la

quimotripsina...

Si el soporte es polianiónico, los grupos cargados negativamente atraen una

delgada capa de protones (H+), creando alrededor de la enzima un
microambiente más ácido (al tener una mayor concentración de protones) que
el que hay en el grueso de la disolución. Por lo tanto, lo que se observa es un
desplazamiento aparente en el pH
óptimo de la enzima hacia valores
más básicos que la enzima libre, ya
que donde se mide el pH es en el
grueso de la disolución.

Si el soporte es policatiónico,
ocurre el efecto contrario, y lo que
se observa es un cambio aparente
de pH hacia el lado ácido.

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 Efectos sobre la estabilidad enzimática

La estabilidad de una enzima es una función compleja que depende de su

naturaleza intrínseca, de las condiciones de inmovilización y de las condiciones de
reacción.

Cuando se habla de estabilidad es importante distinguir entre:

a) Estabilidad operacional

La inmovilización puede incrementar o no la estabilidad operacional de una

enzima. A veces, el incremento en la estabilidad operacional en solo aparente,
como se puede observar en la figura adjunta...

Si nos fijamos en la figura observamos que, aparentemente, la enzima

inmovilizada es más estable que la libre, pues su actividad relativa (en %) es
mayor que para la enzima libre. Así, se ve que durante un tiempo mantiene un
100% de actividad, para luego descender
bruscamente. Esto se explica porque, debido a
restricciones difusionales, solo una parte de la
enzima inmovilizada es activa al comienzo de su
uso. El resto queda como actividad en reserva que
se va manifestando durante un tiempo. La pérdida
de actividad con el tiempo se manifiesta cuando
se pierde la actividad enzimática tamponante.

b) Estabilidad térmica

La actividad catalítica de las enzimas aumenta cuando se eleva la temperatura.

Sin embargo, las enzimas son proteínas generalmente inestables al calor, por lo
que habitualmente las reacciones enzimáticas no pueden llevarse a cabo a
temperaturas altas. En este sentido, la inmovilización puede producir
incrementos o descensos, o bien no influir, en la estabilidad frente a la
temperatura de las distintas enzimas.

En esta figura se muestra un ejemplo de como la

inmovilización incrementa la estabilidad de una
enzima inmovilizada, en este caos celobiosa
inmovilizada en dextrano. Como se puede ver, a
partir de los 65oC, la actividad relativa de la enzima
inmovilizada es superior a la de la enzima libre.

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En esta otra figura se representa la estabilización de

una enzima mediante dos técnicas de inmovilización
distintas. Como consecuencia de la inmovilización la
estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor
rigidez, y se hace más resistente a la desactivación
térmica.

4. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las enzimas inmovilizadas tienen numerosas aplicaciones. A nivel industrial, se pueden

aplicar en numerosos sectores, como la industria química, farmacéutica y, por supuesto,
alimentaria.

En cualquier caso, y en función de todo lo que hemos visto en el tema, que una enzima
se pueda utilizar inmovilizada dependerá, entre otros factores, de la enzima, del
proceso, del tipo de soporte, de la relación coste/beneficio, etc…

Una aplicación muy interesante es en analítica, formando parte de biosensores. El

biosensor actuaría transformando una respuesta biológica, como la transformación de
un sustrato en producto, en una señal eléctrica cuantificable.

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