TEMA 1. INTRODUCCIÓN.

PROSPECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

DEFINICIONES
Biotecnología: uso de organismos vivos o sus partes/productos para el beneficio humano, con
la finalidad de obtener un producto o resolver un problema.

BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL: uso de microorganismos sin modificaciones genéticas.

BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA: modificación genética de microorganismos para que produzcan

sustancias que, de otra manera, no podrían producir. Se produce esta manipulación de mo para:
- Obtener alimentos, aditivos alimentarios…
- Generar nuevas y/o enzimas mejoradas.
- Clonar y producir, en grandes cantidades, proteínas de interés.
- Mejorar procesos industriales y ambientales (descontaminación…).
- Producir antibióticos y otras moléculas de interés en salud.
- Diseñar biosensores.
- Cualquier aplicación en la que sea necesario el uso de un microorganismo para cada objetivo.

Fermentación:
● En BIOLOGÍA: proceso biológico de obtención de energía en ausencia de oxígeno, con
el uso de un sustrato orgánico como aceptor de electrones. Síntesis de ATP mediante
“fosforilación a nivel de sustrato” (p.e. en la glucolisis). Producción de bebidas y
alimentos en la que intervienen microorganismos o enzimas de origen microbiana.
● En BIOTECNOLOGÍA: cualquier proceso, aeróbico o anaeróbico, que implique el cultivo
de microorganismos a gran escala en un “FERMENTADOR” o “BIORREACTOR”.

MICROORGANISMOS COMO FACTORÍAS BIOTECNOLÓGICAS. ¿POR QUÉ LOS MO SON DE

TANTA UTILIDAD EN LA BIOTECNOLOGÍA?
1. Gran velocidad de crecimiento:
▪ Tiempo de duplicación: 20/30 min promedio para muchas especies, en condiciones de
laboratorio.
o Escherichia coli: 20 mins.
o Vibrio natriegens: récord conocido, bacteria marina que se divide en laboratorio en
menos de 10 mins: 9,4 mins.
o Levaduras: Saccharomyces cerevisiae: 1h 30 mins.

2. Versatilidad en el uso de diversos sustratos como alimento para su crecimiento:

▪ Subproductos industriales y agrícolas de bajo coste, melazas de la industria azucarera,
aguas residuales, suero de la leche…
▪ Por el contrario, el cultivo de líneas celulares animales es altamente costoso (necesidad de
suero fetal bovino…).

3. Facilidad de manipulación bioquímica:

▪ Posibilidad de modular mecanismos de regulación genética, incrementar producción,
inducir/reprimir expresión…

4. Facilidad de manipulación genética:

▪ Mutación: facilidad de selección de mutantes (espontáneos o inducidos).
▪ Ingeniería genética (tecnología del ADN recombinante): facilidad para modificar
genéticamente los microorganismos.

5. Facilidad de cultivo a gran escala:

▪ Biorreactores: > 400.000 litros. Suelen ser cilíndricos, con tamaños muy variados (mL-m3).

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VENTAJAS DE USAR EL POTENCIAL DE MICROORGANISMOS EN BIOTECNOLOGÍA
La biosíntesis de moléculas por mo o sus enzimas, a diferencia de los métodos clásicos de síntesis química,
no daña el medio ambiente; las enzimas son catalizadores no tóxicos.

- La síntesis química industrial clásica a menudo requiere condiciones extremas de temperatura, presión
y pH, mientras que las enzimas pueden catalizar reacciones que producen productos similares o
iguales en condiciones mucho más moderadas (también se pueden usar enzimas extremófilas).
- La alta selectividad de las enzimas produce niveles más altos de pureza y con la estereoquímica
especifica de los productos deseados, y reduce los intermediarios tóxicos y los productos secundarios
no deseados.
- Loso mecanismos enzimáticos naturales presentes en los microorganismos para muchas reacciones
químicas están por descubrir. Las tecnologías de minería del genoma de procariotas y hongos revelan
una riqueza insospechada de “grupos de genes de biosíntesis de metabolitos secundarios”. Al
reprogramar y modificar muchos de estos grupos de genes, podemos construir nuevas vías para la
síntesis de moléculas no naturales de interés biotecnológico.

¿QUÉ TIPOS DIFERENTES DE PRODUCTOS DE ORIGEN MICROBIANA PUEDEN SER DE INTERÉS?

- Células: células de levadura o suplementos (como extractos de levadura).
- Biotransformación de células: como biotransformaciones de esteroides.
- Productos de las células: enzimas, antibióticos, aditivos alimentarios, alcohol, químicos…

Por ejemplo, las células de levadura son un producto biotecnológico en sí mismo.

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TIPOS DE METABOLITOS MICROBIANOS
1. METABOLITO PRIMARIO: formado durante la fase
exponencial de crecimiento.
2. METABOLITO SECUNDARIO: formado cerca o
durante la fase estacionaria de crecimiento.

Relación entre la principal ruta metabólica primaria para la

síntesis de aminoácidos aromáticos y las rutas metabólicas
secundarias para la síntesis de algunos antibióticos:

METABOLITOS PRIMARIOS: (fase exponencial)

- ÁCIDOS ORGÁNICOS: pirúvico, cítrico, láctico, propiónico, acético, málico, succínico.
- AMINOÁCIDOS: todos los que forman parte de las proteínas.
- ALCOHOLES: etanol, glicerol, butanodiol.
- ENZIMAS: todas las enzimas del metabolismo primario de la célula.

METABOLITOS SECUNDARIOS: (fase estacionaria)

- ANTIBIÓTICOS: típico ejemplo de metabolito secundario. Aminoglucósidos, β-lactámicos,
macrólidos, tetraciclinas…
- PIGMENTOS: carotenoides (industria alimentaria…).
- ANTICANCERÍGENOS: actinomicina D.
- INMUNOSUPRESORES: ciclosporina.

● SINGULARIDADES DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS:

1) No son esenciales para el crecimiento ni para la reproducción de las células.
2) Su síntesis depende, en gran medida, de las condiciones de cultivo, especialmente de la
composición del medio de cultivo.
- Su síntesis suele estar reprimida, salvo en determinadas condiciones ambientales.
- También podemos inducir su producción cuando nos interese.
3) Suelen producirse como grupos de compuestos muy relacionados entre sí:
- Una única especie de Streptomyces puede producir más de 30 antibióticos relacionados.

3
 4) Tienden a producirse en exceso, en grandes cantidades. Sin embargo, los metabolitos
primarios, asociados al metabolismo energético, no suelen producirse en exceso.
5) La síntesis de la mayoría de estos metabolitos depende de complejas y largas rutas
biosintéticas.
- Por ejemplo, en la síntesis de tetraciclina intervienen por lo menos 72 reacciones
enzimáticas distintas, y ninguna tiene lugar en el metabolismo primario.
Son típicas las rutas de síntesis mediadas por NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases)
y PKS (PolyKetide Synthetases), o por sistemas enzimáticos que combinan NRPS y PKS. Estas
rutas las hay en procariotas e incluso en eucariotas (hongos (penicilina)); pero en humanos
no se conoce.
● NRPS: Non Ribosomal Peptide Synthetases. (sus sustratos son aa o compuestos aminoacídicos).
Son enzimas multimodulares que sintetizan polipéptidos. Son responsables de la síntesis de
muchos metabolitos secundarios en procariotas y hongos.
Son capaces de sintetizar pequeños péptidos por sí mismas, es decir, el producto peptídico no
es codificado como tal por un gen, sino que los aminoácidos que lo conforman (y otros radicales
no aminoacídicos) son ensamblados por estos complejos proteicos multimodulares. Es una
síntesis proteica “no ribosómica”. La propia enzima si que viene de un gen y del ribosoma, pero el
producto que produce, no.

Pueden entenderse como “cadenas de ensamblaje” (tienen una estructura lineal): los dominios
de las NRPS están alineados uno tras otro y constituyen un molde para la síntesis del producto
final. Su disposición en el espacio determina la secuencia de monómeros o unidades que se
ensamblan en el producto.

Además de los 20 aa canónicos, estos complejos emplean hasta 500 monómeros diferentes, que
incluyen, por ejemplo, D- y β-aminoácidos; residuos fosforilados, metilados y glicosilados; α-
hidroxiácidos, heterociclos y ácidos grasos; y todos ellos contribuyen en gran medida a la
enorme diversidad de actividades biológicas de estos compuestos sintetizados por las NRPS.

Mediante el intercambio de sitios de adenilación, se pueden crear diferentes péptidos. Así, los
péptidos microbianos sintetizados por las NRPS muestran una diversidad estructural enorme, y
constituyen una gran parte de los antibióticos más potentes y de moléculas de gran interés
farmacológico. Incluyen sustancias como el antibiótico Penicilina, el antitumoral Actinomicina
D y el inmunosupresor Ciclosporina.

MECANISMO GENERAL DE LAS NRPS:

Cada módulo tiene varios dominios (unidad mínima funcional).

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 - Dominio A (de adenilación): activa el aminoácido entrante, mediante ATP. Es el encargado
de seleccionar cada monómero, tiene una cavidad que SOLO deja entrar al aminoácido
correspondiente, el resto “rebota” y no entra.
- Dominio PCP/T (peptidyl-carrier-protein): une covalentemente, mediante un enlace sulfuro,
el aminoácido.
- Dominio C (de condensación): condensa dos aminoácidos. Reconoce el aa anterior y lo une
covalentemente al siguiente, manteniendo el orden de N-terminal a C-terminal.
- Dominio TE (tioesterasa): libera un producto final mediante hidrólisis.
Los dominios A (adenilación) reconocen cada monómero y lo activan vía ATP. El dominio de adenilación
del módulo 2 está reconociendo y activando otro aminoácido específico, el dominio A del módulo 3 igual.
Esto ocurre de forma independiente y simultánea. Cada dominio A una vez que reconoce y activa el
aminoácido, pasa el monómero al dominio PCP al que se une mediante un enlace sulfuro covalente; este
dominio PCP es equivalente al sitio de peptidilo (P) en el ribosoma. El dominio C "saca" el aminoácido del
módulo anterior y lo agrega al péptido en el PCP de su módulo. El dominio TE (tioesterasa) libera el
producto final por hidrólisis, cortando el enlace éster de -SH. (RESUMEN)

Puede ser una mega enzima con los tres dominios, o varias enzimas bien comunicadas con un
módulo cada una, que pueden formar el mismo producto.

En el caso de que haya dos enzimas, como en la síntesis de Gramicidina S, puede haber otro
dominio de Epimerización (E), que por ejemplo, transforma aa L- en D-.

Vemos que la ez GrsA tiene un solo módulo, mientras que la GrsB tiene 4.

En este caso se hace el ciclo dos veces y se unen ambos péptidos.

● PKS: PolyKetide Synthetases. (sus sustratos son polipéptidos (p.e.: acetil CoA)).
Son enzimas multimodulares con muchas similitudes con las NRPS, pero sintetizan policétidos
en vez de polipéptidos. Cada módulo es responsable de la incorporación y modificación de un
sustrato de acil-CoA (con grupos ceto) para
sintetizar el producto.

Son responsables de la síntesis de numerosos

productos naturales, muchos de los cuales son
utilizados actualmente como antibióticos
(eritromicina), antifúngicos (anfotericina B),
fármacos antiparasíticos (avermectina),
fármacos para reducir los niveles de colesterol
(lovastatina), inmunosupresores (FK506) y para
quimioterapia anticancerígena (epothilone).

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MICROBIAL CELL FACTORY
Microorganismos que se usan para bioconvertir sustratos en productos de interés industrial. Es
un concepto de bio-ingeniería que considera las células microbianas como una entidad
productora y mejorada genéticamente, en la que dicha optimización depende en gran medida
de una ingeniería metabólica.

Es un concepto que va de la mano con la “metabolómica”: identificación, medida e

interpretación de los complejos cambios de concentración respecto al tiempo de la actividad y
de los flujos de metabolitos endógenos en células y tejidos.
CARACTERÍSTICAS PARA QUE UN MO SEA UNA “CELL FACTORY”:
- Fácil de manipular genéticamente, que existan herramientas genéticas para clonación y
expresión de genes.
- Fácil y barato de cultivar, con crecimiento rápido.
- Que tengan óptimas capacidades de secretar proteínas recombinantes (mayor facilidad para
purificar nuestra proteína de interés).
- Que sea un microorganismo GRAS (Generally Recognized As Safe).

EJEMPLOS:
- Procariotas: Bacillus subtilis, Pseudomonas putida (alta capacidad degradante), Escherichia
coli (no es capaz de secretar).
- Levaduras: Saccharomyces cerevisiae.
- Hongos filamentosos: Aspergillus niger.

QTL: loci cuantitativo

SYNTHETIC BIOLOGY
Es una fusión de diseño biológico y
principios de ingeniería eléctrica y
metabólica, que implica el diseño de
nuevos sistemas biológicos, asi como el
desarrollo de herramientas moleculares
utilizadas para construir estos sistemas
desde cero.

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CHASIS: en biología sintética, es un esqueleto biológico reutilizable en el que introducimos
materiales no nativos que pueden ser usados para crear nuevas funcionalidades, es decir, un
tipo de célula optimizada para añadirle modificaciones genéticas a posteriori. Básicamente,
células que usas como base para meterle dentro materiales no nativos.

Los chasis más utilizados son:

- Pseudomonas putida: gran versatilidad metabólica para producir grandes cantidades de
enzimas.
- Bacillus subtilis: producción de proteínas, buena secreción.
- Escherichia coli: para los primeros pasos de investigación, ya que su metabolismo y
regulación génica es muy bien conocida.
- Cyanobacteria: son autótrofas, de muy bajo costo de mantenimiento. Puede vivir en aguas
residuales.
- Vibrio natriegens: con perspectivas de futuro, ya que se tienen un crecimiento muy rápido.

Para que nuestra estrategia funcione, necesitamos saber mucho sobre el microorganismo, la regulación
génica de la bacteria, su transcriptoma, metaboloma…; qué herramientas genéticas vamos a utilizar. Si es
posible, tener librerías de genes, mutantes…

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EJEMPLOS DE SYNBIO:
La SYNBIO (Synthetic Biology) se refiere a la modificación de células microbianas dentro de
posibilidades tecnológicas como la creación de células sensoras de moléculas mediante
ingeniería genética y detección con un gen reportero.
Ejemplo 1. hay varias especies de bacterias terrestres que producen DAPG. El objetivo es diseñar
una cepa capaz de detectar el antibiótico DAPG en muestras de suelo, para ayudar a aislar las
bacterias naturales que lo producen.
El sensor tiene una sensibilidad de alrededor de 20nM de DAPG.
PhIF es un represor natural (codificado por bacterias que en la naturaleza producen DAPG), que
por defecto está siempre reprimiendo un promotor (PphlF) de los genes de biosíntesis de DAPG.
Al unirse a DAPG, el represor PhIF pierde afinidad por el promotor y se libera, dejando de
reprimir ese promotor y permitiendo que se expresen los genes siguientes (genes reporteros).
Por tanto, podemos realizar ingeniería y clonar genes “reporteros” controlados por el promotor
PphlF, que se expresarán alertando de la presencia de DAPG en el medio.

Ejemplo 2. Crear células sensoras de moléculas dentro de la bacteria (chasis inofensivo y

susceptible), usando estas bacterias para localizar moléculas marcadoras de enfermedad,
inflamación, detección de cáncer temprano…
Las bacterias detectan estas moléculas en la membrana que detecta la presencia del compuesto
de interés y transduce la señal dentro de la bacteria, activando a expresión de un gen
informador. También hay sensores que activan la expresión de una recombinasa (escritura de
DNA) que produciría cambios en su propio genoma. Mediante el cultivo de estas bacterias y la
amplificación por PCR de su ADN podemos ver si su genoma ha sido reescrito o no para
determinar la posible presencia de la molécula a estudiar.

Ejemplo 3. Crear bacterias que degraden contaminantes eligiendo propiedades interesantes de

cada microorganismo y combinándolas, para ello es necesario conocer muy bien las rutas
metabólicas, genoma…

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PROSPECCION DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS
¿Dónde buscamos?
- Ecosistemas y nichos ecológicos abundantes en microorganismos, ecosistemas singulares
poco estudiados…
- Suelo (tierra), sedimentos acuáticos.
- Microbiota de otros seres vivos (tubos digestivos y epitelios de animales, biopelículas
asociadas a rocas, algas y animales en entornos acuáticos…).
¿Es posible buscar microorganismos de interés, aunque no sean cultivables? ¡Sí!
- Técnicas metagenómicas: clonar los genes responsables de la síntesis de la molécula de
interés, a partir de las muestras de DNA del ambiente.
Métodos para aislar y seleccionar el microorganismo de interés
- Bioensayos de producción de sustancias inhibidoras (para antibióticos, anticancerígenos…).
- Ensayos de producción de enzimas degradativas, en presencia del sustrato a degradar.
¿Cómo podemos mejorar genéticamente el microorganismo para una producción más eficiente?
Mediante ingeniería genética podemos optimizar mucho la producción:
- Aumentar el número de copias de los genes biosintéticos (clonados en plásmidos multicopia).
- Incorporar un promotor que incremente la tasa de transcripción.
- Mejorar las señales de inicio de traducción en los ribosomas.
- Mutar determinados genes de forma que se promueva la sobreexpresión de otros genes y/o
la sobreproducción del producto de interés.
BÚSQUEDA DE ANTIBIÓTICOS
Los antibióticos son los metabolitos secundarios típicos.
Principales microorganismos productores: hongos filamentosos y bacterias del grupo de los
Actinomicetos (género StreptomycesK y otros).
La principal fuente de microorganismos productores es la propia naturaleza: la búsqueda de
microbios útiles continúa, ya que hasta el momento solo se ha logrado cultivar en el laboratorio
una fracción muy pequeña de los microorganismos del planeta (aproximadamente el 10%).
FASES:
1) Búsqueda y selección (screening/cribado) de microorganismos productores de antibióticos.
2) Purificación y caracterización estructural del agente microbiano.
3) Determinación de toxicidad (baja) y actividad terapéutica (eficacia).

Con la secuencia del gen 16S podemos ver si una especie es nueva o no.
Se puede almacenar bacterias a -80ºC en tubos de 1 mL con glicerol.

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MÉTODOS CLÁSICOS
Los métodos clásicos e indirectos de prospección de nuevas sustancias mediante bioensayos
consisten en cultivar bacterias en presencia de una bacteria que sea sensible a un antibiótico.

Aislamiento y examen de
productores de antibióticos:

a) Aislamiento de Streptomyces e
identificación de los productores
de antibióticos usando un
microorganismo indicador.

b) Método para probar el espectro

de actividad antibiótica de un
microorganismo.

- Ensayos de actividad antibiótica mediante difusión en placa:

Si queremos buscar un antibiótico contra Klebsiella pneumoniae (por ejemplo), primero la
cultivamos y sembramos encima las bacterias (un palo de biomasa encima del césped) que
creemos que pueden sintetizar antibióticos contra K. pneumoniae. Miramos el plato tras un día:

Buscamos halos de inhibición en los que K. pneumoniae no creció, por lo que la bacteria
sembrada en forma de pegote estaría produciendo una molécula inhibidora. El halo será mayor
cuanto mayor sea su agresividad frente a Klebsiella, es decir, con concentraciones muy
pequeñas, Klebsiella tiene poca tolerancia a la presencia de la molécula producida. Estamos
interesados en grandes halos que son producidos por pequeñas concentraciones inhibitorias.

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BÚSQUEDA DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
Hacemos un medio de cultivo con un lípido y tomamos bacterias/hongos del medio para
aislarlos. Cultivamos cada colonia en la placa para observar los halos degradantes que nos
indican la producción de una lipasa efectiva por parte del microorganismo.
Del mismo modo, podemos detectar bacterias productoras de toxinas hemolíticas al sembrarlas
en un plato con agar-sangre.

“THE GREAT PLATE COUNT ANOMALY”

Gran parte de los microorganismos aún no se ha
cultivado en el laboratorio. Hay especies que
solo proliferan si hay otras especies presentes
porque la comunicación interespecífica es clave
para su supervivencia. Así, más del 99% de los
procariotas presentes en una muestra podrían
no ser cultivables.

Además, hay especies que no podemos retener ya que los filtros bacteriológicos son de 0,45 μm,
las llamadas “nano-sizes and filtrable prokaryotes”.
La relación superficie-volumen (SA) es importante porque cuanto más alta, mejor se produce el
intercambio de nutrientes con el medio. La SA aumenta cuanto menor sea la célula.

Ca, Candidatus: se secuenciaron

partes del genoma, pero no fue
posible cultivar el microorganismo en
el laboratorio.

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Estrategias para cultivar especies “no cultivables”
· Cámaras de difusión (“difusión chambers): Las
muestras se cultivan en una cámara de difusión in
situ empotrada en el propio entorno, separada de
éste por una membrana semipermeable. Los
posibles factores de crecimiento necesarios se
extenderán a la cámara y las células microbianas no
escaparán.
Por ej, tomamos una muestra de suelo, la vertemos
sobre el agar y dejamos que se solidifique. Una vez
tenemos el agar solidificado con la muestra, lo rodeamos
con membranas de 0,03 μm que no dejan escapar
bacterias, pero sí propagan metabolitos. Esto recrea
mejor el entorno natural donde viven las bacterias.

· Trampa microbiana: tiene un filtro de 0,2

micrones que es para retener el micelio de
Streptomyces (bacterias Gram + que recuerdan a
los hongos por su micelio multicelular) y para que
los microbios se empapen en el agar.

METAGENÓMICA:
La metagenómica se usa para buscar nuevas actividades enzimáticas y nuevas sustancias
mediante clonación y/o secuenciación de material genético obtenido del ambiente, sin
necesidad de cultivar los microorganismos.

El ADN de la muestra se purifica

y se envía para su secuenciación,
obteniendo secuencias
conocidas y desconocidas que se
pueden comparar en la
computadora o realizando
análisis funcionales por
inserción en plásmidos en E.coli.

Por ejemplo, podríamos

identificar nuevos genes que
codifican lipasas por la presencia
de un halo degradativo en una
placa de lípidos.

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TEMA 2. MANIPULACIÓN GENÉTICA EN MICROORGANISMOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
Si bien los microorganismos sintetizan una amplia variedad de productos de elevado valor
biotecnológico, por lo general producidos en pequeñas cantidades que necesitan para su propio
beneficio.
En los programas de mejora de cepas, se busca una cepa que produzca un elevado título (“high
titer”). En otros casos, lo que se busca es modificar genéticamente el microorganismo para que
produzca una nueva molécula similar, pero no idéntica, a la producida de forma natural (por
ejemplo, modificando dominios de las NRPS y PKS).
En la biotecnología actual, no solo se modifican los microorganismos para producir moléculas
de interés, sino que la biología sintética utiliza las modificaciones genéticas para usos múltiples:
construcción de microorganismos sensores…
Los enormes incrementos de productividad de moléculas producidas por microorganismos, y el
consiguiente ahorro de costes, llegaron sobre todo de la mano de los siguientes procesos de
mejora:
- Mutagénesis y posterior screening/selección de cepas altamente productoras.
- Modificación genética mediante ingeniería del ADN recombinante: esto necesitó de la
puesta a punto de procesos de introducción de DNA por transformación, conjugación o
transducción; lo que llevó más tiempo para unos microorganismos que para otros (más
fácil en bacterias que en levaduras y hongos filamentosos).
CONCEPTOS ESENCIALES DE MANIPULACION DEL GENOMA DE LOS MICROORGANISMOS
SISTEMAS DE RECOMBINACIÓN:
- Recombinación homóloga RecA: proceso universal. En la recombinación homóloga, las
secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos moléculas similares o idénticas de DNA.
Hay otros sistemas de recombinación que derivan de sistemas de recombinación nativos de
bacteriófagos o levaduras, que se modifican para su uso biotecnológico. Por ejemplo:
- Sistema Cre-loxP: sistema específico de sitio. La recombinasa Cre del fago P1 reconoce
secuencias loxP.
- Sistema λ-Red: sistema de recombinación homóloga derivado del bacteriófago λ.
- Sistema Flp-FRT: sistema especifico de sitio, derivado del plásmido de 2μm de
Saccharomyces cerevisiae.
REPRODUCCIÓN PARASEXUAL BACTERIANA:
- Transformación: una bacteria toma un fragmento de DNA que está flotando en el entorno.
- Transducción: el DNA se transfiere de una bacteria a otra mediante un bacteriófago.
- Conjugación: el DNA se transfiere entre bacterias mediante plásmidos a través de sus pili
entre la bacteria F+ y la bacteria F-.
USO DE GENES DE SELECCIÓN POSITIVA: solo crece el clon que contiene el gen marcador (genes
de resistencia a antibióticos, genes metabólicos que complementan mutantes auxotróficos…).
USO DE GENES DE SELECCIÓN NEGATIVA: solo crece el clon que consigue perder el gen
marcador (gen de la toxina ccdB, gen de la levansucrasa sacB).
PLÁSMIDO SUICIDA: plásmidos que aunque puedan mantenerse estructuralmente dentro de la
bacteria, son incapaces de replicarse (habitualmente carecen de la secuencia inicial para formar
nuevas copias de si mismo) por lo que terminan desapareciendo.

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1. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA POR EL SISTEMA RecA
Nos permite introducir nuevos genes, eliminar genes e
intercambiar un gen por otro en un genoma microbiano;
simplemente haciendo una construcción genética in
vitro en la que el DNA nuevo a introducir está flanqueado
por secuencias homologas con el cromosoma de destino
“upstream” y “downstream” del punto donde queremos
hacer la modificación genética.
En este ejemplo, quieren eliminar el ORF, por lo que
sintetizan las secuencian que lo flanquean (L:izquierda y
R:derecha) con un gen de resistencia a clorafenicol
(cam). Se amplifican por PCR y se sintetiza el cassete de
intercambio alélico. Se realiza electroporación para
transformar las bacterias y se cultivan en placa con clorafenicol para seleccionar las bacterias
recombinantes.

¿Cómo funciona RecA?

La proteína RecA, cuando encuentra dos proteínas
homologas o idénticas hace un proceso que termina por
sustituir una por otra.
Hay diferentes consecuencias en función de si la molécula
a introducir es lineal o circular; y también de si la proteína
RecA corta en un sitio o dos.

Estas recombinaciones homólogas son fenómenos poco

frecuentes.

SEGÚN EL TIPO DE MOLÉCULA:

● RECOMBINACIÓN DE MOLÉCULAS LINEALES: son necesarios dos puntos
de cruzamiento para intercambiarse por la secuencia original.
Para introducir el DNA lineal lo hacemos por transformación química o por
descargas eléctricas (solo útil en ciertos mo).
Si solo recombinara una vez, la molécula resultante quedaría lineal y no sería
viable (partimos de un cromosoma circular).
● RECOMBINACIÓN DE MOLÉCULAS CIRCULARES:
o Primer cruzamiento: integra dos secuencias con homología.
Para introducir el plásmido circular (administramos el gen azul en un
plásmido), lo podemos hacer también por conjugación, por lo que
estamos menos limitados que en las moléculas lineales.
Si solo hay un cruzamiento, el fragmento que queríamos intercambiar se
reintegra, quedándonos una molécula con ambos genes. Esta molécula
es muy inestable (tiene 2 secuencias homólogas duplicadas), por lo que
normalmente buscamos una segunda recombinación.

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 o Segundo cruzamiento: puede dar lugar a un intercambio alélico (permutamos lo que
había en el plásmido con lo que había en el genoma) o a la situación de partida.
Partiendo de la molécula anterior (con los dos genes), se produce otra recombinación que
puede ser entre a-a’ o entre b-b’; dando los siguientes resultados:

En general, siempre hay más

porcentaje de colonias que
vuelven a la situación de partida
que recombinantes.

Si realizamos una recombinación para meter un gen a mayores, tras ella, ¿cómo seleccionamos
los recombinantes?
Si realizáramos una selección positiva, por ejemplo, con un medio con Kanamicina, las bacterias
recombinantes con el gen deseado pero sin el plásmido (eliminado en esta segunda
recombinación) morirían porque no tienen el gen de resistencia.
Por lo tanto, hacemos una selección negativa: sembramos las células sin kanamicina y damos
todas las facilidades para que se exprese el gen de selección negativa (por ejemplo ccdB). Así,
morirán todas menos las que tuvieron una segunda recombinación para eliminar el plásmido (y
con él, el gen de selección negativa). De las que crecen, en teoría, el 50% serán revertientes y el
resto serán recombinantes. Si el gen que hemos introducido tiene fenotipo visible, podríamos
seleccionar los recombinantes fácilmente; si no, podemos detectarlos mediante PCR.
2. RECOMBINACIÓN SISTEMA CRE-LOX
En este caso, es un sistema de recombinación “especifico de sitio”. Muchas aplicaciones derivan
de sists de recombinación nativos de bacteriófagos que modificados para su uso biotecnológico.
Una de las utilidades es eliminar
marcadores genéticos que ya no nos
interesan.
A veces, para modificar mo podemos
sustituir un gen por otro de resistencia a
antibióticos. Esto es una “solución”
porque en ocasiones necesitamos
eliminar 10/20 marcadores y no tenemos
tantos genes de resistencia. Estamos
limitados y al final puede llegar a ser un
problema.

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Para poder quitar los marcadores, hay que meterlos flanqueados por las secuencias de
recombinación Cre-Lox para después usar este sistema para eliminarlos. Así, cuando queramos
eliminarlos, introducimos un plásmido de temperatura sensible con el gen de síntesis de la
recombinasa para que, transitoriamente, se exprese la recombinasa, corte esa región y elimine
el marcador. (esto nos sirve para eliminar ya que queda un cachito de la diana Cre-Lox, por lo
que queda un gen no funcional ya que hay un trozo de DNA extraño). Para finalizar, cambiamos
la temperatura del cultivo para que el plásmido no sea capaz de replicarse y se elimine.
<

3. PLÁSMIDOS
The plasmid paradox: ¿por qué existen los plásmidos? Los plásmidos son replicones
independientes de los cromosomas que proporcionan características interesantes. De acuerdo
con los principios de la selección natural, el plásmido cuando se integra en el genoma si es
beneficioso debe mantenerse integrado en el genoma, ya que esta es la forma más estable de
conservación del material genético en las bacterias. Si se quedan ahí es porque, aunque no lo
parezca, aportan elementos esenciales para la vida de las bacterias.
Un plásmido necesita como mínimo 2 cosas para replicarse:
- Origen de replicación (oriV u oriC): lleva la info de secuencia para que se replique.
Normalmente varios cientos de bases cuya estructura secundaria promueve la replicación.
- Genes rep (proteínas necesarias para el control de la replicación): necesitan una o más. Son
proteínas que “se pegan” al plásmido y atraen a la ADNpol para replicarse en el plásmido.
Además, para ser CONJUGATIVO, necesita:
- Origen de transferencia (oriT): secuencia de 200
pb que suele ser reconocible por proteínas que
cortarán el DNA y harán posible el fenómeno de
conjugación.
- Genes “mob”: Relajasas (endonucleasas) y
helicasas (cortan el oriT). Pueden estar o no
codificadas en el plásmido.
- Genes tra (sintetizan el aparato de conjugación):
sin estos genes, no se puede realizar la
conjugación. Hacen el poro de conjugación.
La transferencia por conjugación implica un elevado número de proteínas (sistema de secreción
de tipo IV) codificadas por un grupo de genes conocidos como genes “tra” (de “transferencia”).
Los plásmidos conjugativos contienen estos genes tra de varias kilobases.
Toda esta maquinaria es la que permite transferir la información.
Normalmente está codificada en el propio
plásmido conjugativo; aunque a veces
también hay este tipo de maquinarias en
los cromosomas por integración, que
seguramente acaben desapareciendo.

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TIPOS DE PLÁSMIDOS ATENDIENDO A SUS POSIBILIDADES DE CONJUGARSE
● PLÁSMIDOS NO MOVILIZABLES: carecen de origen de transferencia (oriT) y de genes tra.
Suelen ser plásmidos pequeños y con pocos genes. No tienen como tal manera de ser
conjugados a una célula receptora (no se pueden mover de la célula en la que están). Solo se
podrían transferir si previamente se cointegran en la estructura de un elemento genético
movilizable o conjugativo.
¿Cómo entró si no se puede mover?
- Perdió el oriT y los genes tra después de entrar, por ejemplo por recombinación.
- Que fuera un trozo de cromosoma en el que había un origen de transcripción y se
escindió como un pequeño bucle.
- Que lo adquiriera del medio por transformación.
● PLÁSMIDOS MOVILIZABLES: tienen oriT y normalmente también genes mob de relajasas y
helicasas (cortan el oriT) pero carecen de los genes tra del aparato de conjugación. Por eso,
para movilizarse a una célula receptora, necesitan aprovecharse de los genes tra que puedan
estar presentes en el cromosoma o en otro plásmido. Se “aprovecha” de los demás, se pueden
mover pero dependen de que en la misma célula haya un plásmido o cromosoma con los genes tra.
Para movilizarse, lo único que necesita estar en cis es el oriT, los genes tra pueden estar en
trans. (secuencia cis: en la misma molécula; secuencia trans: en otra molécula).
● PLÁSMIDOS CONJUGATIVOS: codifican ellos mismos TODOS los elementos para poder
conjugarse de forma autónoma. Tienen oriT, todos los genes tra y nickasas y helicasas
necesarias. Son plásmidos grandes.

MARCADORES DE SELECCIÓN POSITIVA

Son aquellos que nos permite que crezca la bacteria que los porta, mientras que las células que
no lo contengan estarán en desventaja y no crecerán.
- Genes de resistencia a antibióticos o antifúngicos.
Útiles en bacterias y
hongos.
Podemos amplificar
por PCR los genes de
resistencia que nos
interesen y clonarlos
a nuestro gusto en el
esqueleto del vector
que queramos.

La selección positiva se basa en añadir al medio de cultivo el antibiótico en cuestión. Solo

formarán colonias las células que porten el gen.
Algunos ejemplos son:
→ Gen bla: proporciona resistencia a ampicilina o penicilina.
→ Gen kan: de resistencia a kanamicina. (ambos codifican moléculas que atacan al antibiótico).
→ Gen cat: cloranfenicol acetiltransferasa (inactiva el cloranfenicol).
→ Gen tet: de resistencia a tetraciclina. Es una bomba de extrusión que se encuentra en la mb
y devuelve la tetraciclina fuera de la célula.
También existe la posibilidad de sintetizar una enzima diana del antibiótico que no pueda unirse
a él y, por tanto, se vuelva resistente.
- Genes que complementan mutaciones nutricionales (auxótrofas).

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Muy útiles en levaduras y hongos filamentosos, ya que no hay tanta variedad de genes de
resistencia efectivos.
Necesitamos que la cepa a modificar sea negativa para este marcador positivo. Por ejemplo, que
sea un mutante auxótrofo incapaz de sintetizar algún metabolito esencial. Este tipo de mutantes
pueden ser espontáneos (naturales) o inducidos en el laboratorio por mutagénesis. El mutante
se mantiene rutinariamente en un medio al que se le añade el metabolito para el que es
auxótrofo.
Cuando se introduce el plásmido con el marcador nutricional positivo, el microorganismo se
cultiva en un medio que carece de dicho metabolito. Así, solo se multiplicarán las células que
portan el plásmido con el marcador.
Un microorganismo protótrofo puede sintetizar por sí mismo un metabolito particular, mientras
que un microorganismo auxótrofo es incapaz de sintetizar ese metabolito y necesita que se le
suministre en el medio de cultivo para poder crecer. En estos mo auxótrofos, si se le añadimos
el gen que codifica la enzima metabólica de síntesis de ese metabolito (normalmente aa y bases
nitrogenadas), podemos hacer una selección de cuales lo han incorporado retirando el
metabolito del medio (los que han añadido el plásmido sobrevivirán y las mutantes, no).

MARCADORES DE SELECCIÓN NEGATIVA, “COUNTERSELECTABLE MARKERS”

Bajo ciertas condiciones de cultivo, la presencia de estos genes es letal.
- ccdB: proviene del plásmido F de E.coli. Codifica una toxina que inactiva la DNA girasa (no se
pueden aliviar los superenrollamientos del DNA, por lo que impide la transcripción y
replicación). Su expresión causa la muerte de la célula bacteriana, por lo que para que solo
se exprese en el momento que queramos que ocurra la selección negativa, tendremos que
clonar este gen bajo el estricto control de un promotor regulable. Al inducirse, se activa el
gen ccdB y solo sobreviven las células que perdieron el marcador. Hay que tenerlo reprimido
hasta que queramos hacer la selección negativa.
- sacB: codifica una levansucrase, enzima que, en presencia de altas concentraciones de
sacarosa (10-15%) causa la muerte de las células de bacterias Gram negativas. La
levansucrase polimeriza los residuos de fructosa obtenidos de la sacarosa y acumula un
polisacárido denominado levano en el periplasma bacteriano (las bacterias Gram + no tienen
este espacio), cuya acumulación es letal. Al plaquear en agar con sacarosa 10%, solo formarán
colonias aquellas células que perdieron el marcador por eventos de recombinación. No hay
que mantenerlo reprimido. Solo para bacterias Gram -.
- rpsL: es el gen de una de las proteínas que conforman el ribosoma. En esta proteína es donde
se une el antibiótico Estreptomicina (Strep), inhibiendo la traducción. Este sistema de
selección negativa es muy sutil y necesita que previamente se obtenga en nuestra especie
de interés (especie que queremos modificar genéticamente) un mutante espontáneo
resistente a Strep. Este mutante, en teoría, tendrá una mutación puntual en el gen rpsL nativo
y le llamaremos gen rpsL*. Entonces, si nosotros clonamos en un vector el gen rpsL nativo
(sensible a Strep) y se la introducimos en un mutante resistente que contiene rpsL*, la
bacteria vivirá tranquila siempre y cuando no añadamos Strep. En el momento en que
añadamos Strep al cultivo, las células con el vector contendrán una fracción de sus ribosomas
formados con la proteína RpsL sensible, lo que le causará un trastorno muy grande y estarán
en franca inferioridad con respecto a las células que perdieron el vector, que tendrán todos
sus ribosomas resistentes. Esto permitirá diferenciar en la placa las colonias procedentes de
células con el plásmido (colonias pequeñas o inexistentes) de las colonias procedentes de
células que perdieron el plásmido (colonias grandes). Este lo podemos usar como pto de partida,
puede salir bien o mal dependiendo de la bacteria.

pSEVA DATABASE :base de datos de origen español. Da plásmidos a la carta de manera gratuita.

18
Todos los plásmidos están formados por la unión de 3 grandes grupos: oriV (5 diferentes), marcadores de
resistencia (6 diferentes) y cargas (diferentes genes o construcciones como MCS (MultiCloning Site), GFP,
lacZ…). De esta forma, los plásmidos se numeran según el marcador, el ori y la construcción que elija.
Siempre llevan oriT, T1 y T0 (terminadores transcripcionales flanqueados por fragmentos de restricción
poco frecuentes). P.e.: pSEVA235 tendría un gen de resistencia a kanamicina (2), el oriV pBBR1 (3) y el gen lacZ (5).
Estos plásmidos vienen en E.coli en un tubo tipo Eppendorf y lo sembramos en un plato para que crezca
la bacteria.

➔ PLÁSMIDOS SUICIDAS
Un vector o plásmido “suicida” es un plásmido que no se puede replicar nunca en la célula
hospedadora que se va a manipular genéticamente (ya que su replicación depende de alguna
proteína de un fago que no está en la bacteria). Solo se puede replicar en determinadas células permisivas
PERO no en ninguna otra, cuando se introduce en una célula no permisiva, no tiene otra opción que
integrarse en el genoma para poder replicarse.

Se trata de un plásmido que se mantiene en una célula hospedadora compatible (en la que sí se
puede replicar y usar durante todo el proceso de clonación mientras construimos el vector con
la modificación genética), pero una vez conjugado (o transformado) en la especie a modificar,
su origen de replicación resulta irreconocible para dicha especie, por lo que nunca se replica.

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Esta situación permite seleccionar un evento de recombinación homóloga, bajo la presión de
selección por resistencia a un antibiótico (codificada en el plásmido). Esto se selecciona porque
la única alternativa que tiene la bacteria de sobrevivir en presencia de ese antibiótico es que el
plásmido se recombine y se cointegre en el genoma bacteriano en el lugar exacto donde exista
homología de secuencia entre el genoma y el plásmido suicida. Por lo tanto, si agregamos un
marcador de selección positivo al plásmido, podemos usarlo para seleccionar las bacterias en las que se
produjo la recombinación homóloga con el cromosoma bacteriano.

Por poco frecuente que sea el evento de recombinación, la selección positiva por antibiótico es
muy poderosa ayudada por el gran número de células en un cultivo bacteriano.
La integración de un vector suicida en un genoma mediante un único evento de recombinación
(“single cross-over”) permite una serie de manipulaciones genéticas, aunque también tiene sus
inconvenientes:

Una de las aplicaciones de insertar un vector suicida en un genoma es generar “mutantes por
inserción”. Si queremos mutar el gen “X”, clonamos en el vector suicida un fragmento interno
del gen “X” (un trozo amplificado por PCR), introducimos el vector en la bacteria y seleccionamos
la cointegración del plásmido suicida en el genoma mediante el antibiótico al cual el vector
confería resistencia. El gen queda truncado, con dos “mitades” a cada extremo del punto de
recombinación, y el vector suicida permanece integrado en el cromosoma de la bacteria. Es un
“mutante por inserción”. Esta estrategia también sirve para introducir genes adicionales en un
genoma bacteriano.
Pero la integración de vectores tiene varias limitaciones/problemas:
1) LOOP-OUT: hay que añadir siempre antibiótico para que se mantenga el plásmido integrado
y no vuelva a escindirse. Al existir dos secuencias duplicadas en tándem (genX’ / gen X), por
recombinación puede perderse el plásmido (“loop-out”). Es como hacer el lazo y volver a escapar.
2) MUTACIONES POLARES: muchos genes procariotas se transcriben en ARNm policistrónicos.
La ruptura de la pauta de lectura de un gen en el operón puede causar la interrupción de la
transcripción de los genes que hay a continuación. Este fenómeno se conoce como
POLARIDAD. Estas mutaciones pueden tener serias consecuencias porque al afectar a la
expresión de genes “downstream”, no se sabe que gen es el realmente responsable de un
fenotipo concreto.
Si el gen siguiente está en el sentido opuesto, no hay problema porque cada uno tiene un
promotor y lo que le pasa a uno, no le pasa al otro. (mutación no polar).

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Sin embargo, si están hacia el mismo sentido no se puede saber con certeza que gen es el
causante del fenotipo. (mutación polar)
En bacterias, la transcripción y la traducción están acopladas. A medida que la RNApol va
avanzando, el ribosoma le va “siguiendo”. Las bacterias tienen sitios para parar la transcripción
y que la RNApol “mire” si hay un ribosoma detrás para poder seguir. Cuando hay un elemento
extraño (el vector suicida), la RNApol no ve que haya un ribosoma siguiéndole y literalmente se
suelta del RNA y deja de transcribir. Por lo tanto, no podemos decir que un gen es responsable
de un fenotipo si hay dos seguidos en el mismo sentido, ya que podría ser cualquiera de los dos.
En otras palabras, si se rompe el primer gen, se aborta la transcripción de los genes del mismo sentido,
no transcribiéndose los siguientes genes (no sería eficiente transcribir los siguientes genes porque el
fenotipo no se desarrollaría adecuadamente).
▪ Mutante polar: aquel que tiene efectos no deseados en genes posteriores.
▪ Mutante no polar: mutaciones limpias.
Para evitar las mutaciones POLARES, y evitar la inestabilidad de la pérdida del plásmido con el
marcador de resistencia, es recomendable hacer las mutaciones mediante “intercambio
alélico”, un proceso en dos pasos que permite eliminar un gen (parcial o total) sin romper las
pautas de lectura del operón génico (es decir, un mutante “no polar”).
La construcción de un mutante no polar exige que se clone en el vector suicida un alelo
“mutante”, al que le falte exactamente un número de pares de bases MÚLTIPLO DE TRES, es
decir, que la deleción elimine un número entero de codones (tripletes) de manera que la pauta
de lectura en el mutante no se rompa. La construcción sintética tiene que estar “in-frame” o en pauta
para que el ribosoma no se entere de que ha cambiado algo y que se traduzca normalmente.

1. El primer paso del intercambio alélico es igual al de los mutantes de inserción: hay que
introducir el vector suicida en la bacteria a mutar y selección la cointegración vector-
cromosoma presionando por el antibiótico concreto.
2. En el segundo paso, se selecciona un evento de recombinación que elimine el vector
cointegrado en el genoma, y para seleccionar dicha eliminación entran en juego los
marcadores de selección negativa. Solo sobreviven las células que pierden el plásmido. La
segunda recombinación dejaría, en el 50% de los casos, la copia mutada intercambiada por
la copia salvaje del gen a modificar. En el otro 50% de los casos, quedaría la versión del gen
como estaba. Que ocurra una cosa u otra depende del punto de recombinación.

21
ESTRATEGIA DE DOBLE SELECCIÓN.
Selección positiva de mutantes de intercambio
alélico en una estrategia de selección en dos pasos,
usando un marcador counterselectable.
La doble selección en dos pasos nos permite la
construcción de mutantes no marcados definidos
con cambios que normalmente son indetectables,
como mutaciones puntuales o deleciones en
marco.

CSM: counterselectable marker (selecc negativa)

SM: selectable marker (selección positiva)
WT: wild-type allele
Mut: mutated allele

4. MUTAGÉNESIS MEDIANTE TRANSPOSONES

Se utiliza para obtener mutantes con una sola mutación en cada
célula (solo muta un gen). El transposón solo suele saltar una vez, lo
que hace que la selección de fenotipo no sea demasiado complicada.
Suelen estar ensamblados en plásmidos suicidas (vehículos de
introducción de transposones).
La transposasa corta en los sitios R e introduce ese cacho en el
cromosoma de la célula a transformar.
El oriR6K es el origen suicida, solo puede replicarse en E.coli permisivas. Al inducir la expresión
del gen tnp (de la transposasa), esta enzima se autocorta sus sitios de reconocimiento (R), en
este caso están flanqueando la secuencia de neomicina que es la que se va a transponer.
PASOS:

1. Por conjugación se introduce el

plásmido suicida que contiene el transposón.

2. Se induce el gen de la transposasa: el

transposón se integra aleatoriamente en el
genoma. En cada célula, en un sitio diferente.

3. El vector suicida, en la siguiente

división celular, no se replica y se pierde.

4. Las células, tras la conjugación, se

siembran en medios que permitan seleccionar o
visualizar las colonias de mutantes.

22
 APLICACIONES:
Nos permite mutagenizar bacterias en un solo gen, luego, mediante análisis de fenotipo,
podemos seleccionar los clones mutados que nos interesen. Finalmente, secuenciamos la
bacteria y localizamos el gen transpuesto.
Casos prácticos:
- Búsqueda de genes con actividad lipasa:
Tras un screening de microorganismos potenciales degradadores de grasas, en un entorno
ambiental contaminado por lípidos, encontramos una bacteria que produce una esterasa/lipasa
que degrada lípidos (colonia número 5: vemos unos puntitos que son subproductos de lípidos).

No sabemos cuál o cuáles son los genes implicados y queremos identificarlos para producir esa
lipasa recombinante y comercializarla para un quitamanchas.
Para identificarlos, mutagenizamos la cepa 5 con un transposón y seleccionamos los clones que
pierden la actividad lipasa para localizar en ellos el punto de inserción del transposón. Al
comparar genomas, se puede identificar el gen con actividad lipasa.

Normal/ usan tween, un lípido de laboratorio fácilmente miscible en agua y que se hidroliza como cualquier otro lípido.

- Búsqueda de genes relacionados con la activación transcripcional de las hemolisinas:

Hacemos lo mismo con una cepa bacteriana que produce una potente hemolisina. Tras la
mutagénesis con transposones, aislamos toda una colección de mutantes con diferentes grados
de afectación en la actividad hemolítica. Conseguimos identificar muchos genes relacionados
con la producción, secreción y regulación de esa hormona:
- Identificación del propio gen que codifica la hemolisina:
mutantes en los que no existe ninguna actividad
hemolítica.
- Identificación de varios de los genes que conforman el
sistema de secreción tipo 2, por lo que se secreta esta
hemolisina al exterior celular: mutantes con muy poca
actividad hemolítica.
- Identificación de reguladores transcripcionales
positivos (activadores): mutantes con diferentes grados
de disminución en la hemólisis, dependiendo del grado
de regulación.

Con este tipo de aproximaciones experimentales es posible identificar muchos genes en

procariotas relacionados con actividades enzimáticas, fenotipos…

23
MANIPULACIÓN GENÉTICA EN HONGOS
Hasta el momento, solo se ha conseguido transformar unas pocas especies de hongos. Cada
especie necesita una optimización de un protocolo muy específico, que puede funcionar en una
especie pero no en otra aunque sean muy próximas filogenéticamente.
Hay que tener en cuenta que los hongos tienen una pared celular compuesta por quitina,
mananos y glicanos; pero esta composición difiere incluso entre hifas y esporas de la misma
especie.
Las terapias antifúngicas son más complicadas que las antibacterianas porque los hongos se parecen más
a nosotros, por lo que hay menos puntos de distinción para atacar.
Podemos encontrar hongos unicelulares (levaduras) o pluricelulares (musgos y hongos
filamentosos).

Muchos protocolos se basan en la obtención de “protoplastos” y esferoplastos como condición

previa, es decir, hay que degradar la pared celular con enzimas líticas. Una muy usada es la
zymolyase, de origen bacteriano.
▪ Protoplastos: células sin pared celular.
o Son células esféricas, carecen de pared celular y están rodeadas de membrana plasmática.
o Se liberan dejando paredes celulares vacías “fantasma” (“ghost cell walls”).
o Son viables, pero osmóticamente muy sensibles y requieren mantenerse en un
estabilizador osmótico.
Estos protoplastos son muy sensibles osmóticamente, por lo que normalmente se consiguen
“esferoplastos”:
▪ Esferoplastos:
o Células esféricas con restos de
polímeros de pared celular.
o Son osmóticamente muy sensibles.
o La presencia de restos de la pared
ayuda a su regeneración después de
la transformación, porque actúan
como cebadores de la iniciación de la
polimerización de la pared.

Solo se fabrican protoplastos o esferoplastos en

el momento de la manipulación genética. Para
el proceso de producción, la pared debe volver
a ensamblarse, de lo contrario, es muy débil.

24
PROTOCOLOS DE TRANSFORMACIÓN DE LEVADURAS (Saccharomyces cerevisiae).
● Electroporación (descargas eléctricas).
● Método del acetato de litio/polietilenglicol (el más utilizado).
● Producción de esferoplastos/protoplastos.

MARCADORES PARA MANIPULACIÓN GENÉTICA EN HONGOS:

● MARCADORES DE SELECCIÓN POSITIVA
- Marcadores seleccionables: los más utilizados son los que confieren prototrofía a cepas
auxótrofas que contienen mutaciones en rutas de biosíntesis de aminoácidos o nucleótidos.
Por ejemplo, los más usados son los marcadores:
o leu2: gen de síntesis de leucina.
o ura3: gen de síntesis de uracilo o uridina.
o pyr2: orotato phosphoribosyl transferase, de la síntesis de pirimidinas.

El uso de este tipo de marcadores nutricionales depende de la previa obtención de cepas

auxotróficas, por ejemplo mediante mutagénesis química o por radiaciones ionizantes.
Algunas de estas auxotrofías pueden causar efectos no deseados, como una baja tasa de
crecimiento y afectación de la síntesis de metabolitos secundarios.
Para mantener los plásmidos con marcadores de selección nutricionales estables en la célula
se utilizan medios de cultivo químicamente definidos (en los que falte específicamente el
metabolito para el que la cepa es auxótrofa), lo que no resulta práctico a nivel industrial, ya
que son caros, producen crecimiento subóptimo y bajas densidades celulares.

- Marcadores de resistencia: evitan el problema de obtener previamente cepas auxótrofas.

o Genes nativos que al sobreexpresarse confieren resistencia a antifúngicos (gen ERG11).
o Versiones mutadas de genes nativos, que confieren resistencia a antifúngicos.

Es difícil encontrar un antifúngico que no sea dañino para los humanos porque, como los hongos
son eucariotas, compartimos con ellos mecanismos de replicación del ADN. Un ejemplo de
antifúngico son los inhibidores de la síntesis de ergosterol, análogo al colesterol de los hongos o
de la pared celular de la quitina.

25
● MARCADORES DE SELECCIÓN NEGATIVA
También llamados marcadores contraseleccionables o “counterselectable markers”.
Los marcadores NEGATIVOS son útiles para varios propósitos, por ejemplo:
- Eliminar un marcador positivo para poder reutilizarlo en una modificación en otro punto
del genoma.
- Seleccionar la pérdida o deleción de algún fragmento del genoma, un plásmido…
Algunos de los marcadores positivos prototróficos utilizados antes, pueden también servir como
marcadores negativos:
o URA3: puede seleccionarse negativamente cuando se añade ácido 5-fluoroorótico (5-FOA),
porque la enzima codificada por URA3 convertirá el 5-FOA en el compuesto tóxico 5-
fluorouracilo, que causa muerte celular (es lo que se denomina “inhibidor suicida”).
o pyr2: también funciona como marcador negativo: si añadimos 5-FOA, la enzima codificada
por pyr2 convertirá el 5-FOA en 5-fluorodeoxiuridina monofosfato (5-FdUMP), un inhibidor
suicida de la timidilato sintasa, que es esencial para la síntesis del ADN.

PLÁSMIDOS USADOS EN S.cerevisiae

● YIPs: Yeast integrative plasmids. Carecen de origen de replicación compatible en levaduras

(se comportan como plásmidos suicidas; se manipulan y se mantienen de rutina en E.coli, por
ejemplo) y solo se propagan en levaduras si logran insertarse en el cromosoma. Es decir,
básicamente son vectores bacterianos que llevan un marcador de selección positiva en
levaduras.

En este ejemplo, el marcador positivo es LEU2 (de

síntesis de leucina). Está diseñado para ser utilizado
en cepas de levadura que son defectuosas en
biosíntesis de leucina (cepas leu2), del contrario no
nos serviría de nada la selección positiva. La cepa
leu2 no crecería en un medio mínimo, pero si
crecería cuando se integre este vector YIP en su
cromosoma.

Algunos son vectores lanzadera (“shuttle vectors”),

es decir, se pueden mantener y manipular en E.coli y también en levaduras. Para que esto
funcione, tienen que tener dos orígenes de replicación, uno compatible con E.coli y otro
compatible en levaduras.

● YRPs: Yeast replicating plasmids. Contienen un origen de

replicación autónoma (ARS: Autonomously Replicating
Sequence) derivada del cromosoma de la levadura.
Aunque tienen un alto número de copias, son poco
estables: en el proceso de división de las levaduras por
gemación, solo un pequeño porcentaje de los plásmidos
que hay en el citoplasma acaba yendo a la gema en
formación, por lo que mucha de la descendencia celular
acaba perdiendo el plásmido, a no ser que se apliquen
fuertes presiones selectivas por el marcador positivo.

MANIPULACIÓN DEL GENOMA DE LEVADURAS (S.cerevisiae)

En levaduras lo que mejor funciona es el sistema de recombinación lineal, que funciona mejor
si encuentra extremos libres. Es un proceso bastante eficiente:

26
Se puede introducir cualquier DNA recombinante en forma lineal, y la célula percibe que es un
fragmento de DNA roto que necesita reparación. Si el fragmento contiene secuencias homólogas
en el genoma, procederá a realizar un proceso de recombinación homóloga.

Pueden transformarse plásmidos integrativos

(suicidas) que llevan un gen (aquí llamado
YFG1: “your favourite yeast gene”) que
queremos introducir en el genoma de la
levadura. El plásmido se linealiza cortándolo
con una enzima de restricción e
introduciéndolo por transformación: la
levadura integra el plásmido en el punto
donde encuentra homología en el genoma,
mediante un proceso llamado “ends-in
recombination”. La modificación genética
resultante de esta integración es inestable,
porque en cualquier momento la proteína
RecA puede recombinar otra vez las
secuencias duplicadas y eliminar el plásmido.

Para evitar que la modificación genética sea inestable, es preferible hacer modificaciones
genéticas que integran DNA por medio de dos eventos de recombinación independientes:
Por ejemplo, deleccionar un gen del
genoma y dejar en su lugar un marcador de
selección positiva. Del mismo modo,
también se puede insertar de nuevo un gen
o genes.
El DNA recombinante que se introduce en
la levadura es un DNA lineal. La zona de
homologia es up-stream y down-stream.
Si presionamos el marcador positivo, las únicas colonias que tendremos en la placa serán las que
hayan introducido nuestro gen.

GENOME SHUFFLING EN LEVADURAS

Es una técnica de fusión de protoplastos haploides que permite cruzar cepas haploides
mejoradas por previa mutagénesis, con el fin de obtener una nueva cepa que junte las diferentes
mejoras genéticas.

Se puede realizar sin tener conocimiento previo de la información genética detalla de los genomas.
No se modifican genes concretos, ni siquiera se conoce cuales se están modificando y seleccionando. La
fortaleza de esta técnica reside en el método de selección de los recombinantes mejorados: sobreviven
mejor las cepas más adaptadas.

La poliploidía de diferentes genes de levadura es una consecuencia tanto de la hibridación

natural como de esta técnica. Por lo tanto, los organismos que se someten a la reorganización
del genoma generalmente no se consideran OMG porque la técnica a la que se someten podría
haber ocurrido de forma natural (se permite en la industria alimentaria).

27
Para seleccionar las levaduras más adecuadas, se someten a las condiciones en las que
queremos que se desarrollen. Se realiza una selección del fenotipo de interés y no se tienen en
cuenta los eventos genéticos.

En este ejemplo se busca mejorar la producción de alcohol por una levadura. La cepa parental
(wt), HAPLOIDE, se mutageniza con luz UV para obtener una biblioteca de mutantes, creando
así nueva diversidad genética.

Las cepas mutantes que exhiban

características fenotípicas
mejoradas (en este caso, las que
más alcohol producen a partir de
glucosa), son las que se usan para el
siguiente paso de fusión de
protoplastos.

Antes de la fusión, se marca

cada cepa con un fluorocromo
para poder seleccionar híbridos.
Estos deben tener doble
fluorescencia (rojo y verde)
mientras que los no
recombinantes tendrán solo una
fluorescencia.

28
MANIPULACIÓN GENÉTICA EN HONGOS FILAMENTOSOS
Los hongos filamentosos son pluricelulares, pero en algún
momento se reproducen por esporas y estas si que son
unicelulares.
Un número limitado de hongos filamentosos son utilizados en
la industria para la producción de enzimas y metabolitos, por
ejemplo: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma
reesei, Penicillium chrysogenum y Myceliophthora thermophila
(antes denominada Chrysosporium lucknowense). Deben
cumplir varios requisitos:
- Capacidad metabólica versátil.
- Crecimiento en medios de bajo coste.
- Capacidad de cultivarse en fermentadores a gran
escala.
- No patógenos ni producir nada tóxico.
- Que sean susceptibles de manipulación genética para
su mejora (ayudado por el conocimiento de las
secuencias completas de los genomas de estas
especies).

PROTOPLAST-MEDIATED TRANSFORMATION (PMT)

Método más común de transformación de hongos filamentosos. Consiste en utilizar enzimas
que degradan la pared celular compleja (con glucanos, mananos y quitina) dando lugar a
protoplastos. Se suelen utilizar conidios (esporas) en Penicillium y Aspergillus, o hifas muy
jóvenes (fase de crecimiento exponencial) en Neurospora.
Luego, en presencia de iones de calcio (pensados para ayudar a abrir los poros en la membrana
celular) y PEG (polietilenglicol), se promueve la fusión de protoplastos y ADN transformante.
Para seleccionar los clones que adquirieron el ADN transformante (que puede ser en forma de
plásmido circular, o en forma de fragmento de ADN lineal, es necesario disponer de genes
marcadores).

MUTAGÉNESIS Y SELECCIÓN DE CEPAS ALTAMENTE PRODUCTORAS DE PENICILINA

Se mejoró la producción de penicilina a partir de la especie Penicillum chrysogenum mediante
mutagenización de variantes espontáneas, irradiación con rayos X, luz ultravioleta, tratamiento
con “nitrógeno mostaza” (classical strain improvement programs, CSI)... a partir de 1940.
Tras mutagenizar, seleccionaron los hongos que sobrevivieron y dio origen al micelio, uno a uno
se realizó un ensayo de producción de penicilina en un matraz, encontrando los que mejor
producían. Recordemos que la penicilina se produce en la fase estacionaria de la curva de
crecimiento microbiano, es un metabolito secundario.

29
30
 TEMA 3. SECRECIÓN DE PROTEÍNAS EN MICROORGANISMOS
Los microorganismos disponen de diferentes sistemas de secreción de proteínas al medio
externo, con el fin de modificar su entorno y obtener ventajas (nutricionales, patogénicas…).
Las bacterias Gram (-) tienen dos membranas lipídicas (la plasmática (interna) y la membrana
externa (que forma parte de la membrana externa)), un desafío para la maquinaria secretora de
proteínas que debe cruzar dos barreras.
En las bacterias Gram (+) y los hongos, las proteínas que se secretan deben atravesar una única
membrana, la plasmática.
Algunos sistemas en procariotas cruzan tres membranas. Por ejemplo, el sistema de secreción
de tipo III (T3SS) de algunas bacterias Gram (-) patógenas, que cruza además la membrana
plasmática de la célula diana en la que inyecta proteínas efectoras (toxinas). El sistema T4SS
(que forma el aparato de conjugación) cruza la membrana externa de la célula receptora. El
sistema T6SS también cruza la membrana de la célula diana en la que inyecta toxinas.
En los hongos, las proteínas secretadas deben pasar por el Retículo Endoplasmático y el Golgi.
Las modificaciones postraduccionales necesarias para la funcionalidad de muchas proteínas
recombinantes de interés biotecnológico (glicosilación, puentes disulfuro, procesamiento
proteolítico…) son más fáciles de conseguir en hongos que en bacterias, aunque incluso en
hongos no siempre se consigue el resultado óptimo.

1. SISTEMAS DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS

1.1. SECRECIÓN EN GRAM (-)
En Gram (-) usan sistemas de secreción de proteínas a través de una, dos o tres membranas
lipídicas. Algunas proteínas son secretadas en dos pasos, siendo primero transportadas al
periplasma mediante el sistema Sec o Tat, y después, si quieren cruzar la membrana externa,
usan el T2SS o el T5SS (en menor medida).

- TIPO I: sirve para echar para fuera pero no hay interacción.

- TIPO III: típico de bacterias patógenas
- TIPO IV: conjugación de plásmidos.
- TIPO VI: inyecta proteínas detectoras, pueden ser sistemas de defensa (evita la competencia).
Estos tipos no tienen intermediaros en el periplasma, forman conductos que pasan el periplasma
sin necesitar intermediarios, pasan de un tirón.

31
SISTEMAS PARA CRUZAR LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
VÍA SEC: solo transporta proteínas NO PLEGADAS.
● Mecanismo post-traduccional: proteínas que van a ser secretadas al periplasma.
Una vez traducida la proteína, se une a un péptido señal separable reconocido por la proteína
SecB. Esta se une a la proteína antes de ser secretada, impide que se pliegue y, junto con la
proteina SecA, la guían hasta el canal SecYEG. A través de este canal de secreción y con gasto
de ATP, la proteína atraviesa la membrana interna y se queda en el periplasma, donde se puede
plegar. Una vez ahí, puede tener dos destinos: quedarse en el periplasma o salir al exterior por
el sistema de secreción tipo II.

● Mecanismo co-traduccional: proteínas destinadas a la membrana interna (prots integrales).

La proteína tiene una secuencia señal en el extremo N-terminal que es reconocida por la
partícula SRP. Durante la traducción, SRP une las proteínas con la secuencia señal mientras
salen del ribosoma, y reclutan la proteína de unión FtsY. Esta FtsY lleva el complejo ribosoma-
proteína al canal SecYEG, que transloca la proteína naciente a través de la membrana interna.
Durante la translocación a través del canal, el dominio transmembrana es capaz de “escapar”
por el lado del canal a la membrana, donde acaba plegando (buscando la conformación de
mínima energía) y queda ligada a la membrana.

Ambas modalidades se basan en el péptido señal hidrófobo del extremo N-terminal de la

proteína secretada, que normalmente contiene 20 aminoácidos y tiene tres regiones: una región
positiva en el N-terminal, un centro hidrofóbico y una región polar en el C-terminal.
Las proteínas que son secretadas al periplasma o al exterior celular contienen secuencias
específicas de SecB; mientras que las proteínas destinadas a quedarse en la membrana interna
contienen una partícula de reconocimiento señal (SRP) específica.

32
VÍA TAT (“Twin-Arginine pathway): secreta proteínas PLEGADAS.
Es un sistema necesario, ya que no todas las proteínas pueden permitirse ser secretadas en
forma no plegada por el sistema Sec. En el péptido señal siempre hay dos argininas juntas.
Por ejemplo, las proteínas que contienen modificaciones postraduccionales que solo se puedan
hacer en el citoplasma, necesitan plegarse en el propio citoplasma y después (una vez plegadas
y con las PTMs) ser transportadas a través de la membrana plasmática por el sistema Tat.
Este sistema consiste en la unión de las proteínas TatB y TatC al péptido señal con dos argininas
de la proteína plegada. Estas dos proteínas conducen al canal TatA de la membrana
citoplasmática, donde la proteína plegada es translocada hasta el periplasma. Como en el caso
anterior, pueden quedarse allí o salir al exterior celular.

Que una proteína se transloque al periplasma por una vía u otra depende de los aminoácidos de
su extremo N-terminal.
Los péptidos señal sel sistema Sec y Tat
tienen una estructura similar: una región N-
terminal positiva, una región central
hidrofóbica y una región C-terminal polar
con el sitio de reconocimiento (AXA) de la
peptidasa SPasa. AXA: tiplete que marca el pto de
corte.
Se diferencian que el péptido señal Tat tiene
un dominio N-terminal más largo, una región
central menos hidrofóbica y un C-terminal
más positivo. Además, tiene un motivo
consenso formado por dos Arg (R) entre el N-
terminal y el hidrofóbico.

Ejemplo real de péptidos señales de tres toxinas hemolíticas secretadas en grandes cantidades
por una bacteria marina Gram (-) del género Photobacterium.

33
1.1.1. SISTEMA DE SECRECIÓN DE TIPO I (T1SS)
Sistema de Gram (-) que permite secretar proteínas en un único paso, desde el citoplasma
hasta el exterior, sin intermediario periplásmico (atraviesa las dos membranas en un único
paso). Sirve para secretar toxinas y otras proteínas que contienen un péptido señal en su
extremo C-terminal que no es eliminado en el proceso.
Tiene tres componentes fundamentales:
- Un transportador ABC (“ATP-Biding Cassette”, una
ATPasa) que hidroliza ATP para obtener energía
para la secreción de la proteína a secretar, y que
se encuentra en la membrana plasmática (por
ejemplo la HlyB).
- Una proteína llamada genéricamente “proteína de
fusión de membrana” (MFP), que sirve de puente
entre el transportador ABC (HlyD en la figura).
- Una proteína que, unida a las dos anteriores, llega
hasta la membrana externa, y suele denominarse
“TolC”.

Entre las tres proteínas forman un canal ininterrumpido

desde el citoplasma hasta el medio extracelular.
Este sistema también lo usan las bacterias para secretar antibióticos.

1.1.2. SISTEMA DE SECRECIÓN DE TIPO II (T2SS)

En las bacterias Gram (-) este sistema T2SS sirve
para que, las proteínas que ya cruzaron la
membrana plasmática por las vías Sec o Tat,
puedan cruzar la membrana externa.
Tiene componentes tanto en la membrana interna
como en la externa. Tiene 12 proteinas integrantes
(a,b,c,d,e…).

E.coli es muy mala secretora de proteínas, esto se

debe a que tienen un gen del sistema de secreción de
tipo II mutado o que no se expresa bien.

Por ejemplo, se comprobó que al mutar el gen epsL

del T2SS se anula la secreción de gran partes de las
proteínas:

1.1.3. SISTEMA DE SECRECIÓN DE TIPO III (T3SS)

Es un sistema asociado a la PATOGENICIDAD y VIRULENCIA de algunas bacterias Gram (-). En
muchas especias, este sistema está codificado en plásmidos de virulencia, que pueden ser
transmitidos mediante conjugación.
Sistema similar a la jeringa proteica para inyectar “proteínas efectoras” (toxinas) directamente
en la célula hospedadora (de un animal, planta…). Estas toxinas tienen un elaborado
mecanismo de toxicidad en la célula diana eucariota.

34
 La parte más distal de la estructura
(“translocón”) atraviesa la membrana
plasmática de la célula hospedadora.

Es un gran complejo macroproteico en forma

de jeringa que atraviesa todas las membranas
(plasmática, externa) hasta la membrana
plasmática de la célula hospedadora para
secretar las proteínas efectoras en el interior.

Este tipo de sistemas son útiles en biología de

vacunas.

1.2. SECRECIÓN EN GRAM (+)

Es mucho más sencillo, ya que solo tienen una membrana plasmática. Básicamente tienen los
sistemas Sec y Tat que cruzan la membrana interna.

A diferencia de las Gram (-), muchas bacterias Gram (+) utilizan un factor adicional en el sistema
Sec, llamado SecA2. Además, existe evidencia de que algunos individuos Gram (+) usan aparatos
secretores conocidos como inyecciones para transportar proteínas desde el citoplasma
bacteriano al citoplasma de la célula huésped en un proceso de dos pasos. El mecanismo
específico de este proceso no está determinado, pero se ha propuesto que el inyectectoma usa
un canal protegido para exportar proteínas a través de la pared celular.

Bacillus subtilis: Bacteria Gram (+) más utilizada en la producción de enzimas para la industria
de detergentes, alimentos y bebidas (GRAS). Secreta proteínas en altas concentraciones al
medio de cultivo, utilizando las vías Sec y Tat. Forman endosporas, al igual que Clostridium.

35
1.3. SECRECIÓN EN LEVADURAS
Las levaduras son eucariotas,
tienen una vía secretora de RE y
aparato de Golgi. Tienen rutas
similares a las nuestras, en las
que utilizan péptidos señales
para secretar a través de la vía
del aparato de Golgi y el RE.

Si la levadura reconoce como

extraña a la proteína, la degrada
entre el camino del RE y el Golgi.

1.4. SECRECIÓN EN HONGOS FILAMENTOSOS

Los hongos filamentosos son excelentes “microbial cell factories” para la síntesis y secreción de
proteínas. Tienen muy buena capacidad de hacer modificaciones post-traduccionales de las
proteínas: glicosilación, corte por proteasas, formación de puentes disulfuro…

Trichoderma reesei puede producir y secretar 100 g/L de celulasa.

2. USO DE MICROORGANISMOS COMO FACTORÍA CELULAR

Los microorganismos también se pueden usar como factoría celular para producir proteínas
recombinantes heterólogas.
Las enzimas
naturales muchas
veces no son
adecuadas para la
catálisis industrial, o
son producidas en
condiciones muy
bajas, por lo que
debe realizarse
ingeniería genética.
Aquí entran en juego
las “microbial cell
factories”.

36
2.1. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓOGAS EN BACTERIAS
El primer paso es diseñar un vector adecuado, con promotores, terminadores de transcripción…
Uno de los primeros problemas que puede aparecer es cuando se pretende producir un péptido
pequeño expresado en E.coli, por ejemplo, que puede ser rápidamente degradado por
peptidasas del citoplasma. Para resolver esto, una estrategia es fusionar el péptido
recombinante con una proteína grande endógena de E.coli. Al expresarse la proteína de fusión,
el péptido recombinante se pliega como parte de la proteína endógena y escapa la degradación.

Para separar el péptido de interés de la proteína endógena (Carrier), hay que cortar la proteína
de fusión mediante sistemas de corte específicos de sitio (tratamientos que rompen la cadena
peptídica en un punto concreto).

Será necesario introducir por ingeniería genética la diana de corte que se desee, entre la
secuencia que codifica el péptido recombinante y la secuencia de la proteína Carrier.

Otra variante de hacer proteínas de fusión, independientemente de que sea para péptidos
pequeños o grandes, es que facilita luego la purificación. La secuencia del péptido heterólogo se
puede fusionar con una secuencia que permita la purificación por cromatografía de afinidad.

Elementos básicos para producir una prot recombinante: necesitar un vector (con promotor,
RBS, secuencia del gen, terminadores y también fusiones con dominios de prots que nos faciliten
la purificación y secreción como las colas de histidina).

EJEMPLO DE PROT DE FUSIÓN: PRODUCCIÓN DE SOMATOSTATINA RECOMBINANTE EN E.coli

La somatostatina actúa a nivel de la hipófisis y del páncreas inhibiendo, respectivamente, la
secreción de la hormona del crecimiento y la de la insulina. Se usaba para tratar gigantismo.
Fue el primer producto génico humano producido en una bacteria. Resulta casi imposible
obtenerla purificándola de fuentes biológicas, solo se podía obtener purificándola de cadáveres
donantes.
Ofrecía muchas posibilidades para la ingeniería genética, por tratarse de una proteína muy
pequeña de solo 14 aa.

En 1977, Itakura y colaboradores, financiados por la empresa Genentech, anunciaron la

clonación de la somatostatina:

37
- Sintetizaron químicamente el gen: sintetizaron 8 fragmentos monocatenarios y los unieron
entre ellos (dando lugar a un DNA bicatenario).
En la síntesis química incluyeron una diana de EcoRI en un extremo y una de BamHI en el
otro; asi como un codón para un residuo de Metionina al principio del gen.

- El siguiente paso fue conseguir un vector para clonar este gen en E.coli, y aportar una
secuencia con las señales de reconocimiento de las maquinarias de transcripción y traducción
en E.coli.
Esta secuencia es un fragmento del operón lac: contiene el promotor y el gen que codifica la
beta-galactosidasa (gen lacZ), y este promotor se regula de la misma manera que el gen lacZ
nativo en E.coli: respondiendo a la presencia de lactosa en el medio. Asi se creó una proteína de
fusión que E.coli no degradaba.

Después de hacer la proteína hibrida (gen casi completo de la beta-galactosidasa y el gen de la

somatostatina), cortan con bromuro de cianógeno donde empezaba nuestra somatostatina y
conseguimos la proteína recombinante.

2.1.1. CUERPOS DE INCLUSIÓN

Otro problema recurrente es la formación de cuerpos de inclusión (“inclusion bodies”).
Cuando se expresan proteínas heterólogas en bacterias, sobre todo si son proteínas de origen
eucariota, pueden formarse agregados insolubles en el citoplasma (cuerpos de inclusión).

Se supone que se forman porque al sintetizarse en alta cantidad, las proteínas heterólogas
establecen interacciones intermoleculares entre zonas hidrofóbicas mal plegadas, lo que lleva a
la agregación y a su plegamiento erróneo. Cuanto más tarden las proteínas heterólogas en
plegarse correctamente, más posibilidades habrá de que se agreguen entre sí.

En E.coli varios motivos podrían contribuir a la formación de cuerpos de inclusión:

- Las condiciones de pH, fuerza iónica y potencial redox del citoplasma bacteriano son diferentes
a las nativas en las células eucariotas, y eso afecta al plegamiento de las proteínas nacientes.
- Muchas proteínas eucariotas no se plegarán bien en el citoplasma de E.coli al no poder
formarse los puentes disulfuro. Estos puentes se forman en eucariotas en el entorno oxidante
del Retículo Endoplasmático, y no se formarán en el citoplasma bacteriano porque este es
altamente reductor (los puentes disulfuro en E.coli se forman en el periplasma, oxidante).

38
- El correcto plegamiento de las proteínas eucariotas suele necesitar de proteínas helper, que
no necesariamente están presentes en E.coli u otros procariotas:
o Chaperoninas: diversas proteínas que ayudan al correcto plegamiento de otras proteínas.

Pueden ser deseados (ayudan a la purificación) o no. En el caso de que no, hay varias formas de
solventar la formación de cuerpos de inclusión:
▪ Una solución es asumir su inevitable formación, romper las células y recuperar los cuerpos
de inclusión por centrifugación. A continuación, solubilizarlos con desnaturalizantes de
proteínas como urea, y renaturalizar las proteínas eliminando gradualmente los
desnaturalizantes. Puede acabar siendo una opción muy costosa, que impida usar bacterias
para producir determinadas proteínas interesantes. Por ejemplo, este problema condicionó
que el factor VII de coagulación se dejase de producir en bacterias y ahora se produzca en
cultivos de células animales.

▪ Otra solución es evitar que se formen cuerpos de inclusión, aunque no existe una forma
universal que evite su formación:
o Bajar la temperatura de cultivo funciona en algunos casos.
o Co-expresar chaperoninas y foldasas recombinantes dentro de la misma E.coli que
produce la proteína de interés.
o Hacer proteínas de fusión entre el gen de la proteína recombinante de interés y el extremo
3’ de genes de otras proteínas que aporten solubilidad a la proteína final. Por ejemplo,
esto funcionó con la tiorredoxina de E.coli y con la maltose-binding protein:

EJEMPLO: Uso de la tiorredoxina de E.coli (una pequeña

proteína de 11 aa) como “fusion partner” para producir
en E.coli la proteína “Stem cell factor” murina (mSCF) en
forma soluble.
Se construyó una secuencia de ADN con el gen de la
tiorredoxina (TRX) que aporta estabilidad; una etiqueta
de histidina (His-tag), 6 histidinas que facilitan la
purificación; la secuencia de corte de la proteasa del
tabaco (TEV cleavage site) y por último la proteína que
queremos producir (mSCF).
Purificación: pasan por columnas con Ni o Co (sobre todo Ni).
Para eliminar parte que no queremos, se añade al cultivo la
proteasa que actuará sobre el punto de corte.

2.1.2. ESTRATEGIAS PARA FACILITAR LA POSTERIOR PURIFICACIÓN

• PROTEINAS DE FUSIÓN CON COLAS DE HISTIDINA (“His-tag”): permite la purificación por
columnas cromatográficas por la afinidad de la His a cationes metálicos, como Co y Ni.

Se añade un mínimo de 6 codones de His en la

secuencia de ADN para que la His se localice en
el extremo N-term o en el C-term de la proteína
final. Hay plásmidos que ya incluyen la
secuencia de la His-tag o se pueden incluir los
codones en un primer y amplificar por PCR el
gen sintético para insertar la His-tag.

39
• PROTEÍNAS DE FUSIÓN CON LA GLUTATION-S-TRANSFERASA (GST): se pasa el extracto
celular por una columna con glutation inmovilizado.
En este ejemplo de vector, la liberación final de la
proteína recombinante se realiza mediante el
tratamiento con 45 trombina (sitio de reconocimiento
de trombina, incluido en la secuencia):

Los vectores PGEX son vectores de expresión de plásmidos que expresan un gen fusionado con
la proteína GST (glutatión-S-transferasa). El represor lac se une al promotor lac y suprime la
expresión de la proteína de fusión GST hasta la inducción de su expresión mediante la adición
de IPTG. El gen de la proteína de interés se puede insertar directamente después del gen GST
usando el sitio polylinker que aparece entre corchetes. Los sitios de escisión de la proteasa
(paréntesis sobre el polylinker: secuencia de trombina) están ubicados entre la proteína carrier
de GST y la proteína de interés para que la porción de GST pueda eliminarse.

• FAVORECER LA SECRECIÓN DE LA PROTEÍNA AL MEDIO EXTERNO: para evitar que la proteína

forme cuerpos de inclusión y sea secretada al medio externo, existen vectores comerciales
que permiten la producción y secreción de proteínas recombinantes.
Un ejemplo es la clonación en Bacillus megaterium, una bacteria Gram (+). Con el vector
comercial MoBiTec GmbH de expresión para producir y secretar proteínas en Bacillus
megaterium, que no produce proteasas (que degradarían el producto final).

Tiene un promotor para la polimerasa t7 y un terminador (por lo que

la bacteria debe ser introducida al gen de la polimerasa en otro
vector); un multiple cloning site (MCS); un péptido señal splipA
correspondiente a una lipasa LipA nativa que utiliza la vía Sec para
atravesar la membrana plasmática; y genes de resistencia contra
ampicilina (AmpR ) y tetraciclina (TetR ).

2.1.3. GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS

Muchas de las proteínas eucariotas nativas de interés terapéutico, son glicosiladas de forma
natural por unión de glucanos mediante procesos de N-glucosilación (en residuos de Asp) o de
O-glucosilación (en residuos de Tre/Ser); en un proceso de modificación post-traduccional. Este
proceso es diferente según la especie.

40
En las células eucariotas, la glicosilación comienza en el retículo endoplásmico y continúa en el
aparato de Golgi. Los glucanos agregados desempeñan un papel clave en la estabilidad, el
plegamiento, la solubilidad, la vida media sérica (“serum half-life”: tiempo que tardan en
degradarse en sangre) y la función de las proteínas.

La glicosilación en procariotas existe, aunque está poco estudiada, durante décadas se pensó
que tal proceso no se producía en procariotas. Sin embargo, las vías de glicosilación procariotas
difieren notablemente de las eucariotas.

Para obtener una proteína recombinante con un patrón de glicosilación lo más parecido al
nativo, la forma más directa sería utilizar una fábrica de células eucariotas.
Las levaduras no son una gran solución, porque los mecanismos de glicosilación agregan
estructuras de manosa complejas y específicas de levadura.
Las células de insecto agregan glucanos
similares a insectos, que difieren de los
glucanos de mamíferos.
La opción más segura es utilizar líneas
celulares de mamíferos (Chinese
Hamster Ovary cells, “CHO”, Human
Embryonic Kidney cells, “HEK”). El
problema es que son sistemas muy caros
de mantener, con baja productividad,
riesgo de contener virus latentes, etc.

• GLYCOENGINEERING
Se están realizando muchas investigaciones para generar cepas bacterianas recombinantes, en
las que se introducen genes que pueden imitar las vías de biosíntesis de glucanos de
mamíferos, con la idea de que estas bacterias pueden glucosilar la proteína recombinante con
el patrón de glicosilación adecuado. Además, las bacterias no forman puentes disulfuro en el
citoplasma, por lo que también se están introduciendo genes para hacer puentes. Se utilizan
tanto genes eucariotas como algunos procariotas que realizan la función biosintética deseada.

Ejemplo de dos operones sintéticos para insertar un glucano en la proteína recombinante

interferón-α2b y en la hormona del crecimiento, por O-glicosilación; también incluye el gen de
una isomerasa de enlace disulfuro para la formación de puentes disulfuro.
Cabe señalar que dos de las proteínas de glicosilación están fusionadas con la proteína de unión
a maltosa (MBP), para proporcionar solubilidad a estas proteínas heterólogas en E. coli. En estos
operones también se incluyeron un sitio de unión al ribosoma (RBS) y el promotor Ptac.

hppGalNAcT2: human polypeptide Nacetylgalactosaminyl

transferase
Cj-Gne: UDPGlc(NAc)-4-epimerase (de Campylobacter jejuni)
CgtB-MBP: b1,3-galactosyl transferase (de Campylobacter
jejuni)
DsbC/hPDI: disulfide bond isomerase/human protein
disulfide isomerase

41
2.2. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN S.cerevisiae
Más del 50% de la insulina a nivel mundial se
produce en S.cerevisiae.
Los antígenos HBsAg de la vacuna contra la hepatitis
B también se producen principalmente en
S.cerevisiae, pero también en las levaduras Pichia
pastoris y Hansenula polymorpha. El antígeno se
produce y luego la levadura se revende y libera.
Los primeros enfoques, en la década de 1980,
clonaron el gen del antígeno HBsAg controlado por
el promotor del gen de la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GPD) de levadura. El gen del virus
se expresa a partir de un plásmido. La proteína
HBsAg se acumula en el citoplasma de la levadura y se purifica por lisis celular.

2.3. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN OTRAS LEVADURAS

2.3.1. Kluyveromyces lactis
El kit de expresión de Kluyveromyces lactis proporciona un método simple para expresar un gen
de interés en la levadura K. lactis. Las proteínas pueden producirse intracelularmente o
secretarse utilizando el vector de expresión integrador pKLAC2. Para lograr la secreción de
proteínas, el gen de interés se clona downstream del dominio del factor de secreción α-mating
(α-MF, en azul en la figura) de K. lactis que se procesa en el RE o Golgi, lo que resulta en la
secreción de la proteína de interés. El dominio α-MF se elimina por una peptidasa señal (SP).

En este ejemplo, la expresión de un gen de interés está bajo el control de una variante del
promotor lac4, que se ha modificado para que carezca de expresión de fondo en E.coli. Por lo
tanto, los genes tóxicos para E.coli pueden clonarse en pKLAC2 en bacterias antes de su
expresión en levadura (vector lanzadera).
El kit incluye células de K.lactis altamente competentes con alta eficiencia de transformación. La
selección de levaduras transformadas utiliza un método libre de antibióticos basado en el hecho
de que la acetamidasa (amdS) expresada por pKLAC2 permite que las células transformadas con
vectores utilicen acetamida como única fuente de nitrógeno en un medio definido, un
mecanismo de selección positivo. La selección de acetamida promueve el crecimiento de células
que contienen múltiples integraciones de pKLAC2, lo que da como resultado mayores tasas de
producción de proteínas de interés.

42
Además, las proteínas expresadas en K.lactis tienen acceso a la maquinaria de plegado y
glicosilación de proteínas eucariotas que las células de E.coli no poseen, lo que constituye una
importante alternativa a los sistemas de expresión bacterianos.
pKALC2 (9107 pb) contiene los extremos 5' y 3'
del promotor lac4 separados por el ADN que
codifica la β-lactamasa y la fuente de replicación
pMB1 (ori) para permitir su propagación en
E.coli. El factor α-MF de K.lactis, el sitio de
clonación múltiple (MCS) y el terminador de la
transcripción lac4 están inmediatamente
downstream a 3' del promotor lac4. El promotor
de levadura ADH1 controla la expresión del gen
de la acetamidasa (amdS). El vector se puede
linealizar por digestión con SacII o BstXI para
crear un fragmento de ADN lineal capaz de
insertarse en la región del promotor lac4 nativo
del genoma de K.lactis por recombinación del
promotor nativo con el del vector (secuencias
homólogas).

2.3.2. Kluyveromyces marxianus

Es un organismo GRAS, seguro, barato y con buen rendimiento. Esta levadura se utilizó para la
producción de VLP (proteínas virales que se ensamblan para formar la cápside del virus sin el
genoma), específicamente PPV VLP (partículas similares a virus de un Parvovirus porcino).
Se usó la cepa auxótrofa para uracilo K.marxianus Fim-1ΔURA3. El gen de la proteína de la
cápside VP2 se sintetizó químicamente (gen sintético), optimizándolo para el sesgo de uso de
codones (sesgo de codones) de la levadura K.marxianus.
El plásmido recombinante se transformó directamente en la cepa Fim-1ΔURA3 mediante el
procedimiento de acetato de litio.
La vacunación de ratones con VLP de PPV purificadas indujo títulos elevados de anticuerpos IgG
específicos en suero.

2.3.3. Pichia pastoris

Pichia pastoris es una levadura metilotrófica: puede usar metanol como fuente de carbono y
energía. Además, no produce etanol, lo que permite conseguir altas densidades celulares en los
fermentadores (el etanol acaba autoinhibiendo a S.cerevisiae).
El primer paso en el metabolismo del metanol es oxidarlo a formaldehido por la enzima alcohol
oxidasa, altamente expresada. El promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) es muy usado para
dirigir la expresión de proteínas heterólogas en Pichia.
La secuencia señal de secreción más usada es la del factor α de S.cerevisiae.
Comparado con S.cerevisiae, Pichia es la mejor para la glicosilación de proteínas secretadas
porque no hiperglicosila.
Tanto en S.cerevisiae como en Pichia pastoris predomina la N-glicosilación del tipo “high-
mannose”. La longitud de las cadenas de oligosacárdiso en Pichia (8-14 residuos de manosa por
cadena lateral) es mucho más corta que en Saccharomyces (50-150 residuos). Esto es menos
alergénico en humanos.
**Pichia pastoris ha pasado a llamarse Komagataella phaffii, aunque todavía es más conocida como antes.

43
Un ejemplo de producción en Pichia pastoris es la expresión
de quimosina recombinante (renina), una proteína que
cuaja la leche en el proceso de elaboración del queso.

El gen de la quimosina de yak (Bos grunniens) se sintetizó

químicamente (gen sintético) y se clonó en el vector
pPICZαA, bajo el control del promotor AOX1 (inducible por
metanol), y se fusionó con la secuencia señal del factor de
apareamiento α de Saccharomyces, para ser secretado.

2.4. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN HONGOS FILAMENTOSOS

Son óptimos productores de proteínas recombinantes con patrones de glicosilación más
próximos al de mamíferos.
El potencial secretor de hongos como Aspergillus sp. y Trichoderma sp. es de casi diez veces más
que la de S.cerevisiae.
Un mutante hipersecretor de Trichoderma reesei (RUT-C30) puede secretar 100 g/L de proteína
total.
Las cepas mutantes se suelen obtener en proteasas nativas, para que no degraden las proteínas
recombinantes.

Este es un esquema de una construcción para la expresión y secreción del inhibidor de

proteinasa α1 humano en el hongo filamentoso Aspergillus niger. El casette de expresión incluye
el promotor constitutivo fuerte gpdAp, el terminador transcripcional del gen TrpC (TrpCt), el
ADNc que codifica la glicilamilasa, que facilita la secreción, y la secuencia codificante del sitio de
reconocimiento Kex2, para la eliminación in vivo de la parte correspondiente a la glucamilasa.
en la proteína de fusión por la endoproteasa Kex2.

2.4.1. Myceliophtora thermophila (Thermotelomyces heterothallica)

Es un hongo termófilo aislado originalmente en suelos alcalinos de Rusia. Fue aislado por su
capacidad de producir celulasas neutras y alcalinas para su uso en aplicaciones textiles.

Su genoma fu secuenciado por lo que se pudo mejorar cepas con una morfología única, con una
mayor tasa de producción enzimática y con una producción más alta de la proteína
recombinante de interés. Además, es GRAS.

2.4.2. Trichoderma reesei

Es un hongo filamentoso Ascomiceto con gran producción de celulasas nativas, por lo que es de
interés para la producción de biocombustibles al convertir celulosa en glucosa.

También se usa como cell factory para producir muchas proteínas heterólogas.

44
3. APROVECHAMIENTO DE ENZIMAS SECRETADAS POR MICROORGANISMOS
Las enzimas microbianas secretadas son fáciles y baratas de obtener y purificar: no tienen que
descomponer las cels y las proteínas se aíslan directamente de los sobrenadantes en los cultivos.
En general, se trata de HIDROLASAS: principalmente amilasas, proteasas y lipasas.
Su uso elimina la necesidad de usar altas temperaturas, pH extremo, solventes orgánicos, lo que
implica un menor impacto ambiental.
Las principales enzimas se utilizan para fabricar detergentes, textiles, cuero, papel,
biocombustibles, alimentos para humanos y animales, medicamentos, etc.

** Ver tablas con ejemplos en la presentación**

TIPOS DE FERMENTACIÓN:
- SSF (Solid State Fermentation):
Los microorganismos se cultivan sobre un sustrato sólido, sin apenas agua libre y con distintos
grados de humedad, dependiendo del caso.
Es una matriz porosa con una gran superficie por unidad de volumen.

- SmF (Submerged Fermentation):

Los microorganismos se cultivan en líquido, con total disponibilidad de agua, en un fermentador.

• AMILASAS
Industria del pan, cerveza. La harina tiene entre el 8-11% de contenido de proteína.
Las enzimas que degradan almidón fueron las primeras producidas a gran escala en la industria
alimentaria.
Hay dos tipos de amilasas que convierten almidón en glucosa: α-amilasa y glucoamilasa.

Las amilasas bacterianas y fúngicas se emplean en la industria del pan para degradar almidón a
disacáridos o monosacáridos fácilmente utilizables por las levaduras (que, en general, no
pueden degradas el almidón).
S.cerevisiae no tiene amilasas por lo que no puede degradar el almidón, solo la maltosa y la glucosa.

• PECTINASAS
Industria de zumos de frutas.
Las pectinasas derivadas de los hongos Aspergillus y Rhizopus se producen en “Submerged
Fermentation” (SmF). Para el tratamiento industrial con pectinasas, las frutas y vegetales se
cortan y se añaden pectinasas para degradar las pectinas de cadena larga (son
heteropolisacáridos de la pared celular vegetal).
Se reduce la viscosidad del zumo, aumenta el rendimiento y facilita la filtración. También se usan
las pectinasas para macerar frutas en alimentos para bebés.

También se usan xilanasas y celulasas para ayudar a liberar el zumo a partir de la pulpa.

• FITASAS
En alimentación se emplean enzimas para incrementar la digestibilidad de nutrientes o degradar
componentes indeseados. En la industria ganadera de aves y porcinos se usan proteasas, fitasas,
glucanasas, α-galactosidasas, α -amilasas y poligalacturonasas.

Los residuos tienen una alta proporción de fosfato y se desperdicia mucho la cantidad de fósforo
que se añade al pienso, si se añaden fitasas al pienso, el rendimiento en el consumo de fósforo
es más rentable, ya que ayuda a que el pienso sea más nutritivos. (los animales monogástricos
no procesan bien el monoinositol y gran parte del fosfato se pierde en las heces).

45
En las semillas de las plantas, el fosfato está en forma de mio-inositol hexakis fosfato, también
denominado fitato, que no es hidrolizable por los animales monogástricos como cerdos y pollos.
Las fitasas microbianas hacen disponible el fosfato del fitato por medio de hidrolisis enzimática.
Las enzimas fitasas son secretadas extracelularmente por varios hongos.

- INDUSTRIA DE LOS DETERGENTES

La industria de los detergentes usa el 25-30% de todas las enzimas producidas industrialmente.

En detergentes se añaden proteasas, lipasas, oxidasas, amilasas, peroxidasas y celulasas. Las

más útiles son aquellas activas a temperaturas cerca de 60ºC y alcalófilas (pH 9-11), y que
funcionen en presencia de otros componentes de los detergentes. (enzimas termoestables).
Las proteasas son muy importantes, porque las proteínas presentes en las manchas de ropa
quedan más adheridas a las fibras textiles. Los detergentes biológicos contienen proteasas
alcalinas, de baja especificidad de sustrato, y degradan todo tipo de proteínas a aminoácidos o
péptidos de cadena corta. Gran parte de las proteasas para estos fines son producidas por
especies de Bacillus.
Los detergentes de lavavajillas cada vez incluyen lipasas y amilasas.

- INDUSTRIA DEL CUERO

Se usan enzimas proteolíticas y lipolíticas para procesar el cuero y eliminar componentes no
deseados.
Se añaden proteasas alcalinas en los primeros pasos para facilitar que las pieles secas se
impregnen de agua y para eliminar proteínas, grasas… En este paso se puede añadir también
tripsina pancreática. Las proteasas en general se añaden para eliminar el pelo del cuero y las
lipasas para desengrasar la piel.

- INDUSTRIA TEXTIL
Se usan amilasas y celulasas para modificar las fibras textiles en los pantalones vaqueros para
aportar diferentes tipos de acabados.
Las catalasas se usan para eliminar el H2O2 después de tratamientos blanqueadores.

46
 TEMA 4. BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA ALIMENTARIA
1. HISTORIA
El ser humano descubre la fermentación de los alimentos como un inevitable cuando las
materias primas se dejan sin preservar. Se descubrió la fermentación alcohólica de la masa del
pan y los cereales, y los zumos de frutas (vino, sidra…); la fermentación láctica de la producción
de derivados lácteos con mejor conservación, el descubrimiento del cuajado de la leche para
producir queso (proceso general enzimático pero también puede ser microbiano).

Los productos fermentados se apreciaron como algo más que un alimento, por sus propiedades
estéticas y organolépticas propias. Son menos perecederos y más seguros microbiológicamente
que las materias primas de las que proceden (con la excepción del pan).

Ventajas de producir cerveza como bebida en la antigüedad:

- Salubridad del agua por la ausencia de contaminación microbiana.
- Bajos niveles de etanol (2%) son suficientes para eliminar potenciales patógenos en el agua.

Se supone que les llevaría mucho tiempo a las sociedades humanas controlar como influenciar
las condiciones para obtener productos fermentados de forma reproducible.

La producción de alimentos fermentados evolucionó de manera independiente en cada

continente, de forma totalmente empírica. Entre 3000 y 400 años AC, hay indicios de la
existencia de la industria panadera en Egipto, y la industria cervecera en Babilonia. Los indicios
de fermentaciones a menor escala son mucho más antiguos (13.000 años como mínimo).

2. ALIMENTOS PRODUCIDOS POR FERMENTACIÓN MICROBIANA

Harina, yogurt, kéfir, cerveza, vino, pepinillos, aceitunas, salsa de soja, embutidos, zorza…
También podemos encontrar fermentaciones en otros alimentos como café o chocolate, a pesar
de que estas no son transformación de la materia prima en sí. El café, por ejemplo, viene
envuelto en una cáscara y lo debemos fermentar para obtener su aroma y sabor característicos.

También los ensilados vegetales para la alimentación animal. Los silos de maíz o de hierva se
cierran en un plástico, generando asi un ambiente anaerobio para que se produzca la
fermentación (conservación).

3. PROCESO DE FERMENTACIÓN
Hay alimentos que sufre cambios rápidamente si los dejamos sin conservar pero, ¿Cuál es la
diferencia entre que algo se pudra o que fermente?

Los procesos de fermentación deseables son simplemente aquellos que constituyen un método
de conservación:
- Por acidificación (bajada del pH): por ejemplo, las fermentaciones del ácido láctico (lácteos
fermentados, encurtidos, embutidos, ensilados para animales…).
- Por producción de etanol: por ejemplo, las fermentaciones alcohólicas por levaduras (pan,
vino, cerveza, sidra) que producen etanol y CO2; o por fermentaciones heterolácticas de las
bacterias lácticas, que producen lactato, etanol y CO2.

47
Por esta razón es crucial que la producción de especies de microorganismos en las materias
primas sea específicamente aquella que propicie las fermentaciones que “conservan”:
▪ Las fermentaciones óptimas para esto son las de los carbohidratos. En general, los productos
fermentados se conservan porque “ganan la batalla” especies bacterianas que proliferan
rápidamente y fermentan los carbohidratos generando ácidos y/o alcohol.
▪ Si ganan la batalla los microorganismos proteolíticos, el resultado puede ser la degradación
de las proteínas de la materia prima con el resultado de putrefacción, generando moléculas
con nitrógeno y azufre que aportan mal olor y sabor.
▪ En las fermentaciones de vegetal (sauerkraut, encurtidos de pepinillos etc), si proliferan
microorganismos celulolíticos o pectinoliticos estropearían la textura de los alimentos.

En resumen: queremos que la fermentación ocurra con los microorganismos deseados, a una
temperatura y ambiente óptimos para obtener el resultado deseado.

4. FERMENTACIÓN ALCOHOLICA
La glucosa se degrada a piruvato por la ruta glucolítica (metabolismo) en la que se reduce NAD+
a NADH. En un ambiente anaeróbico, el piruvato sufre una descarboxilación dando lugar a
acetaldehído y libera CO2. El NADH generado reduce el acetaldehído a etanol, “reciclando” el
NADH para formar NAD+.

Esta fermentación
es típica de
levaduras como
S.cerevisiae y
S.pastorianus.

El piruvato puede tomar dos caminos para

recuperar el NAD+ oxidado: el de la
fermentación alcohólica (produciendo etanol)
o el de la fermentación ácido-láctica.

48
5. FERMENTACIÓN LÁCTICA

5.1. FERMENTACIÓN HOMOLÁCTICA

En esta ruta se produce únicamente lactato. Tiene lugar
la glucolisis clásica hasta el ultimo paso, donde
interviene la LDH.

Son producidas por bacterias Gram (+) que crecen muy

rápido a altas temperaturas (45ºC), lo que es una
ventaja sobre el resto de bacterias. Una vez proliferan,
se acidifica la leche y no dejan crecer al resto de mo.

Algunas bacterias homolácticas son:

- Lactobacillus acidophilus.
- Lactobacillus bulgaricus.
- Streptococcus thermophilus.
Ej: fermentación del yogurt.

5.2. FERMENTACIÓN HETEROLÁCTICA

En esta ruta metabólica se produce ácido acético, etanol,
CO2 y lactato.

Algunas bacterias heterolácticas son:

- Lactobacillus casei.
- Lactobacillus plantarum.
- Leuconostoc spp.

Ej: fermentación del kéfir.

49
6. ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS
El ser humano lleva consumiendo alimentos fermentados desde el Neolítico, ¿de dónde
obtenían los microorganismos?

1) El método más antiguo en la microbiología alimentaria tradicional consiste en dejar que

actúen los microorganismos presentes en la materia prima y en el entorno que producen
cambios inevitables y deseables: microbiota natural de la materia prima, de los epitelios
animales y humanos, del entorno, de los insectos…
- Por este método se siguen fabricando vino, sidra, muchos embutidos y encurtidos
(pepinillos, aceitunas…).
- Las fermentaciones caseras naturales son producidas por una amplia variedad de bacterias
y hongos: por ejemplo, el mosto de uva es fermentado por muchas más especies que
S.cerevisiae.
- La masa madre del pan tradicional contiene diferentes levaduras y también bacterias del
ácido láctico. Esta masa es simplemente agua con harina y esperar a que vengan insectos (avispas,
abejas, moscas) para que regurgiten y echen sus enzimas.

2) Otro método, prácticamente tan antiguo como el anterior, consiste en aprovechar una parte
del material de una fermentación que ocurrió con éxito y transferirla a un nuevo recipiente
con una nueva materia prima para iniciar una nueva fermentación.
- Este método, conocido como “recebado” o “backslopping”, funciona para casi todas las
fermentaciones, y aún se usa en la fabricación de la cerveza, vinagre y algunos quesos y
derivados lácteos.
- También se usa en la producción de alimentos fermentados a pequeña escala, productos
caseros…
- El principio siempre es el mismo: un producto fermentado contendrá un número
relevante de microorganismos necesarios, que cuando sean añadidos a la nueva materia
prima, iniciarán la fermentación.
- Este método también sirve para seleccionar las cepas más adaptadas y con rasgos
deseados para obtener el producto final esperado.

3) El tercer método, el más usado hoy en día, consiste en añadir cultivos bacterianos o fúngicos
denominados “iniciadores” o “starters”, que son cultivos puros de cepas seleccionadas
producidas industrialmente.
- Los microorganismos iniciadores dominan el cultivo y desplazan a la microbiota
preexistente en la materia prima. Con esto se consiguen productos homogéneos,
predecibles, alimentariamente seguros…
- La industria del pan (1860s) y la cervecera (1883, Carlsberg, Dinamarca) fueron pioneras
en desarrollar cultivos iniciadores, seguidas de las de productos lácteos, todas antes de
1900. La industria del vino tardó mucho más, hasta 1960s.

50
Ejemplo: producción de starters de levaduras (levaduras “secas”).

Las levaduras que están en los sobres están secas pero vivas, al
rehidratarlas y seguir las instrucciones, empiezan a metabolizar y
dividirse.

Hay que hacer muchos controles de calidad durante el proceso.

Se consigue un cultivo y después hacer un

escalado de este (primero en un volumen
pequeño y después en el fermentador grande).

7. PRODUCCIÓN DE CERVEZA
Probablemente la cerveza fue el primer alimento fermentado producido por el ser humano
desde el Neolítico.

Los granos de cereales contienen almidón (polisacárido), cuya degradación a maltosas

(disacárido) y glucosa (monosacárido) necesita de amilasas.

Saccharomyces solo puede fermentar de manera óptima los mono-, di- y trisacáridos (maltosa,
glucosa, fructosa, maltotriosa…). Esta no produce α-amilasas (que degradan almidón,
fragmentando los enlaces α 1-4 internos), pero algunas cepas producen glucoamilasas que
liberan, de forma poco eficiente, residuos de glucosa a partir del extremo no reductor del
almidón.

Para una fermentación alcohólica óptima es necesario romper el almidón en maltosas y

glucosas. En la fabricación de la cerveza esto se soluciona dejando germinar los granos de cebada
para que se exprese el gen de la amilasa en los tejidos de la semilla y se degrade el almidón.

Una vez “malteada” la cebada, se puede inocular con Saccharomyces spp. para que tenga lugar
la fermentación etanólica de la glucosa. En una cepa nativa, si no se maltea la cebada, casi no produce
etanol; en cambio, si le introducimos un plásmido con el gen de la amilasa sí que hay producción.

La cebada se hace germinar para introducir la síntesis de α-amilasa. El almidón se hidroliza a

maltosas (proceso de malteado, de producción de “malta”). El malteado es esencial, ya que, de
lo contrario, la levadura no dispondría de la maltosa y glucosa fermentables.

La maltosa se tuesta en un horno (“kilning”), se muele (“milling”), se añade agua y lúpulo, y en

ese caldo se añaden las cepas seleccionadas de Saccharomyces producidas industrialmente y
comercializadas.

Las cepas de levadura para la producción de cerveza tienen la particularidad de que “floculan”
al acabar la fermentación, facilitando que sean retiradas del líquido. Finalmente, la cerveza se
filtra y/o se pasteuriza.

En la antigüedad, parece ser que a cerveza se elaboran a partir de pan, que se sumergía en agua
y se fermentaba con levaduras tipo Saccharomyces y bacterias del ácido láctico que estaban en
el ambiente. Como alternativa, los sedimentos de una fermentación terminada podían utilizarse
como cultivos iniciadores de una nueva fermentación.

51
7.1. TIPOS DE CERVEZA
CERVEZA TIPO “ALE” o “BITTER”
- Fermentación de superficie (“top fermentation”).
- Temperatura de fermentación: 18-27ºC.
- Las cepas de S.cerevisiae floculan en la superficie una vez acabada la fermentación.
- Típica cerveza británica, más lupuladas y amargas y menos carbonatadas.
- Variedades IPA (India Pale Ale): más alcohólicas y muy lupuladas, para que aguantasen el
viaje en barco desde Inglaterra a la India a finales del S. XVIII (propiedades antimicrobianas
del alcohol y del lúpulo.

CERVEZA TIPO “LAGER”

- Fermentación en el fondo (“bottom fermentation”).
- Temperaturas de fermentación inferiores a 15ºC.
- Cepas de S.pastorianus que floculan en el fondo (también denominada S.carlsbergensis).
Hay hipótesis de que esta especie es realmente un híbrido entre S.cerevisiae y otra especie
no determinada.
- La cerveza lagger fue creada por los monjes de monasterios alemanes en la Edad Media,
con fermentación a temperaturas más frías.

52
7.2. FERMENTACIÓN ALCOHOLICA EN Saccharomyces cerevisiae
Es anaerobia facultativa, capaz de vivir respirando o fermentando.
Puede realizar la fermentación alcohólica incluso en aerobiosis (proceso conocido como
“glucosa effect” o “Crabtree effect”), en presencia de altas concentraciones de azúcar porque la
glucosa reprime la ruta respiratoria.
Esto explica que la fermentación de la cebada y del zumo de uva, aunque sea en recipientes
abiertos en contacto con el aire, da lugar a vino y cerveza. La levadura usa dos tipos de enzima
alcohol-deshidrogenasa (ADH), una produce alcohol y la otra lo degrada.

Una pequeña parte de los azucares deben destinarse para crear carbono celular, por lo que una
parte del piruvato es desvaída vía piruvato-deshidrogenasa al ciclo de Krebs para sintetizar
precursores. En este caso, la re-oxidación del NADG requiere otros aceptores de electrones,
dando lugar a la formación de glicerol y otros alcoholes que aportan otras características a la
cerveza.

La fermentación es exotérmica, los tanques deben refrigerarse a 8-15ºC para Lager y 15-22ºC
para Ale.

7.3. MEJORA DE LAS CEPAS DE LEVADURA PARA LA INDUSTRIA CERVECERA

Hay muchas dianas potenciales susceptibles de mejora en las levaduras cerveceras:
- Búsqueda de cepas que degraden las dextrinas (polímeros de varias glucosas en cadena) para
bajar la carga calórica de la cerveza.
- Búsqueda de cepas que degraden los β-glucanos, procedentes de las paredes celulares de las
células de la cebada, que dan viscosidad a la cerveza y dificultan la filtración.

En general, estas mejoras se solucionan añadiendo enzimas purificadas, procedentes de cultivos

de bacterias y hongos.
La percepción social negativa del uso de levaduras genéticamente modificadas hace que apenas
se usen como tal las levaduras “GMO”.

53
Desde los inicios de la producción de cerveza por el ser humano hasta hoy en día, las cepas
cerveceras se fueron transmitiendo de un lote de fermentación a otro nuevo, sin discontinuidad.
Así, estas cepas están muy adaptadas al mosto de la cebada y al entorno de la cerveza, y son
muy diferentes a las cepas de levaduras estudiadas en el laboratorio.

Existen cultivos iniciadores comerciales, pero muchas cervecerías utilizan sus propios cultivos
iniciadores caseros.

Un dato muy importante es que, mientras las cepas de laboratorio de Saccharomyces son en
general diploides (16 cromosomas) y capaces de esporular y formar esporas haploides (ascas),
las cepas cerveceras son poliploides, con frecuentes aneuploidías, y contienen múltiples alelos
diferentes para muchos genes. Estas cepas esporulan mal.

Las estrategias clásicas de mejora de cepas consisten en la selección de mutaciones

espontaneas, o después de mutagenizar en el laboratorio, buscando mejoras en las
fermentaciones y en las propiedades organolépticas. También, entre las técnicas estándar de
modificación de cepas en laboratorio, encontramos los apareamientos e hibridaciones entre
cepas distintas, pero son técnicas muy poco eficaces en cepas cerveceras.
ESPECIES DE HONGOS:
• Ascomicetos: forman ascas mediante meiosis. La mayoría de hongos de interés
biotecnológico.
• Basidomicetos: forman esporas alargadas. (setas)
• Zigomicetos: los del pan cuando se pone malo.

Las cepas cerveceras casi no esporulan, y

si lo hacen, las esporas no son capaces de
volver a aparearse. Se reproducen
principalmente por gemación multilateral
(gemas por toda la superficie celular, no
por gemación estrictamente polar).

7.3.1. ALE (Adaptativ Laboratory Evolution)

Consiste en seleccionar variedades interesantes partiendo de la cepa original pero modifcada.
La mejora de cepas por ingeniería evolutiva, también llamada Adaptative Laboratory Evolution
(ALE) se basa en los principios básicos de la variabilidad genética (natural o inducida por
mutágenos) y la posterior selección que actúa sobre dicha variabilidad.

Una población de células de levadura se cultiva durante muchas generaciones bajo una selección
continua por el fenotipo de interés. Con el tiempo, aparecen las mutaciones al azar (o se inducen
para incrementar la variabilidad). Si una mutación en concreto, o combinación de mutaciones,
le aporta una ventaja a una célula en esas condiciones, esta variante se enriquecerá en la
población y será seleccionada. Llega un momento en el que se alcanza el tope de mutacionies
que puede soportar el genoma y no se pueden conseguir más mejoras.

54
ALE se puede realizar en el laboratorio de distintas formas:
a) Pases de diluciones seriales en “shake flasks”, donde los nutrientes no van a ser limitados y
algunos parámetros de crecimiento puede fluctuar bastante.
b) Cultivadas en quimiostatos, donde normalmente un nutriente es limitante y la densidad
celular puede ser mucho mayor que en los shake flasks. Además, la densidad celular y las
condiciones ambientales pueden mantenerse constantes y se pueden implementar
estrategias de cultivo más complejas.

El incremento de actividad durante la evolución del experimento es grande en la primera etapa

pero normalmente se ralentiza durante la selección prolongada; en cambio, las mutaciones
crecen de forma lineal.

Hay diferentes tipos de mutaciones en los estudios ALE que contribuyen a los cambios genéticos
y de actividad durante la selección para los fenotipos mejorados:
- SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms.
- Indels: inserciones y deleciones pequeñas.
- Duplicaciones o deleciones a larga escala.

ESTRATEGIAS DE MEJORA:
Para seleccionar nuevas cepas de levadura para aplicaciones industriales, hay varias estrategias:
• Levaduras no GMOs:
o Diversidad natural: se genotipan y
fenotipan cepas salvajes de
distintas partes.
o Diversidad artificial:
▪ Mutagénesis: por luz UV, EMS…
▪ Hibridación sexual: puede ser con
tratamiento previo para obtener
protoplastos o no.
▪ Citoducción: raro.
▪ Ingeniería evolutiva.

55
• Levaduras modificadas genéticamente: basadas en ingeniería
genética, donde un fragmento de DNA recombinante es
transformado en una cepa para conferirle un fenotipo
específico. Puede ser muy eficiente pero su uso está limitado
en fermentaciones alimentarias.

7.3.2. GENOME SHUFFLING (YA VISTO)

Técnica de fusión de protoplastos haploides que
permite cruzar cepas haploides mejoradas por previa
mutagénesis, con el fin de obtener una nueva cepa
que junte diferentes mejoras genéticas.Se puede
realizar sin conocimiento previo de la información
genética detallada de los genomas.

No se modifican genes concretos, ni se conoce cuales están siendo modificados y seleccionados. La

fortaleza de esta técnica reside en el método de selección de los recombinantes mejorados: sobreviven
mejor las cepas más adaptadas.

8. PRODUCCIÓN DE VINO
Las cepas de levadura que fermentan el vino son muy diferentes a las de la cerveza. Fueron
sufriendo una selección a lo largo de la historia de la viticultura y son linajes adaptados a
fermentar mostos y a sobrevivir a altos contenidos de etanol.

Realmente, la presencia natural de S.cerevisiae en la piel de las uvas es muy baja, e incluso en
los inicios de la fermentación, su presencia es minoritaria. La fermentación suele iniciarse por
especies de levaduras de otros géneros, como Kloeckera, Hanseniaspora, Brettanomyces,
Debaryomyces, Candida, Metschnikowia, Pichia, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces e Rhodotorula.
Kloeckera apiculata y Hanseniaspora uvarum son algunas de las especies predominantes.

El mosto tiene un pH bajo (3-4) y un alto contenido en azúcar, lo que impone una fuerte selección
de especies microbianas que puedan sobrevivir en él. Además, el ambiente anaerobio que se
produce durante la vinificación y la adición de SO2 (sulfito) (usado por su poder antioxidante y
antimicrobiano), inhiben el crecimiento de microorganismos aerobios como bacterias acéticas,
mohos y levaduras oxidativas.

Así, las levaduras no-Saccharomyces, con poca capacidad fermentativa (debido a su baja
tolerancia en etanol), son sustituidas por dos especies de este género; S.cerevisiae y S.bayanus..

La tendencia actual es utilizar cultivos iniciadores de levaduras mixtos, con diferentes especies
aisladas en el entorno de cada bodega, para aportar cualidades diferenciadoras en cada lugar.
Las levaduras no-Saccharomyces producen compuestos responsables de propiedades
organolépticas únicas, aromas afrutados…

8.1. ORIGEN DE LAS LEVADURAS QUE FERMENTAN EL MOSTO

La idea más extendida es que las levaduras están previamente colonizando la piel de la uva, y en
el momento en que la uva se rompe, se inicia la fermentación del mosto.

Sin embargo, en un experimento de 1995 se demostró que solo una de 2.016 uvas intactas inició
la fermentación en un tubo de mosto.
Si la levadura estuviera en la piel de las uvas, habría fermentación en todos los tubos.

En otro experimento de 1999, separaron las uvas rotas de las intactas y las frotaron en placas
Petri, y observaron que solo había crecimiento de S.cerevisiae en la placa de uvas rotas.

56
Estudios de marcadores genéticos demostraron que las levaduras de una bodega provienen del
entorno circulante, de múltiples nichos ecológicos; barriles de madera usados anteriormente,
flores y suelo, corteza de árboles…

Las levaduras llegan a las uvas gracias a los insectos: avispas (tienen las levaduras en su tubo
digestivo y van de los árboles a las uvas a las flores…). También pegadas a las alas de las abejas,
y en menor medida en las antenas de las moscas.

8.2. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA EN EL VINO

Principal diferencia entre el vino tinto y el blanco es que:

- En el vino tinto el mosto se deja fermentar en presencia de

la uva completa, para adquirir pigmentos taninos, aromas…

- En el vino blanco, el mosto se fermenta como líquido ya

separado de los restos de la uva.

8.3. FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA

Es el proceso enzimático por el cual el ácido L-málico del vino (ácido abundante en las uvas) se
convierte en ácido láctico. Tiene lugar una vez acaba la fermentación alcohólica de las levaduras.
La fermentación maloláctica es realizada principalmente por la bacteria Oenococcus oeni,
aunque algunas especies de Lactobacillus también la realizan.
Esta fermentación ocurre de forma natural en el vino (lleva ocurriendo en las fermentaciones
del vino desde el Neolítico, sin más intervención humana que dejar que los mostos evolucionen
solos). En el caso de los vinos industriales, lo que se suele hacer hoy en día es inocular cultivos
estandarizados de Oenococcus oeni para agilizar el inicio del proceso.

La fermentación maloláctica suaviza el tacto y la textura del vino, le añade matices y complejidad
y ayuda a la estabilización del vino antes del embotellado.

La diferencia en el transporte es que la permeasa de O.onei es uniporte, mientras que la otra

actúa como antiporte (la exportación de lactato lleva a la importación de malato).

Las bacterias del ácido láctico pueden ser utilizadas como cultivos iniciadores para mejorar las
propiedades organolépticas; coloración, densidad…
Cuando el vino tiene una textura gelatinosa se debe a la producción de dextrano por bacterias,
cuando ocurre esto, se dice que el vino está picado.

57
8.4. MEJORA DE LAS CEPAS DE LEVADURA PARA LA INDUSTRIA DEL VINO
Las cepas “domesticadas” en el entorno de las bodegas de vino tienen genomas poliploides,
comparadas con las cepas encontradas en la naturaleza lejos de los entornos vitivinícolas. Esto
es aún más exagerado en cepas híbridas industriales, que suelen tener variaciones en los
números de cada cromosoma (de un cromosoma puede tener más copias que de otro).

Las cepas vínicas comerciales, seleccionadas después de un largo proceso, tienen muchas
ventajas sobre las cepas naturales; como la elevada eficiencia de fermentación, resistencia a
altas concentraciones de etanol, azúcar y sulfitos, resistencia a bajas temperaturas…

El uso de cepas comerciales evita que domine alguna especie natural de “killer yeast”: muchas
levaduras de la naturaleza producen péptidos tóxicos (killer toxins) que matan a otras levaduras.
Hay más de 200 cepas comerciales de levaduras para vino, lo que posibilita producir diferentes
variedades. La elevada competencia entre marcas de vino estimula la búsqueda de nuevas
cepas, y algunas bodegas usan su propia tecnología con cepas propias aisladas en su ambiente.

9. PRODUCCIÓN DE VINAGRE
Probablemente el vinagre fue descubierto al mismo tiempo que la fermentación del vino, ya que
el vino expuesto al aire se transforma en vinagre en cuestión de días. Además de empezar a ser
utilizado como aditivo alimentario, se utiliza como conservante de otros alimentos, o incluso
como bebida (diluido en agua).

Se produce por la oxidación del etanol al ácido acético por parte de bacterias aerobias,
principalmente del género Acetobacter.

Cualquier sustrato que contenga etanol puede dar lugar a vinagre, por eso hay vinagres de
distintas procedencias (vino de uva, vino de arroz, restos de malta de cebada, cereales
fermentados, sidra…). Para ser denominado vinagre, debe contener un mínimo de 4% de ácido
acético y debe ser producio por “fermentación del etanol”, es decir, la obtención de acetato
por síntesis química no se considera vinagre.

Es un proceso AEROBIO, realizado por cuatro géneros de bacterias Gram (-):

- Acetobacter.
- Gluconobacter.
- Gluconoacetobacter.
- Acidomonas.
Estas son habitantes naturales de plantas, especialmente en frutas y néctares.
Las bacterias del ácido acético arrancan los
electrones del etanol y utilizan el O2 como
aceptor, y estas reacciones ocurren en el
periplasma y en la membrana citoplasmática.
Cuando se termina el etanol, estas bacterias
pueden degradar el acético, pero mientras
haya algo de etanol, la vía catabólica de
acético está reprimida. De manera industrial
se produce en cultivos semi-continuos, con
constante entrada de nuevo sustrato.

58
FORMAS DE HACER VINAGRE:
9.1. MÉTODO DE CUBA O TINA ABIERTA (“OPEN VAT”)
La forma más primitiva. Método basado en el crecimiento en superficie de bacterias acéticas en
recipientes en los que se añade el sustrato etanólico. La fermentación empieza por bacterias
que contaminan el recipiente de forma natural o por añadir vinagre de una fermentación previa.
El sustrato está expuesto al aire, pero no se remueve ni se toca. Así, las bacterias solo crecen en
la superficie, formando una biopelícula o biofilm de polisacáridos (la “madre” del vinagre, una
capa flotante que básicamente es un conjunto de bacterias y polisacáridos) en la interfase
líquido-aire.
Básicamente
dejas un frasco
con vino abierto
para que se
contamine por si
solo con bactrias
acéticas, que
están por todos
lados.

9.2. MÉTODO DEL GOTEO (“TRICKLING SYSTEM”)

Método basado en incrementar lo máximo posible la superficie de la interfase entre el sustrato
etanólico y el oxígeno del aire, para acelerar la oxidación de etanol a acetato, ya que el factor
limitante es la difusión del oxígeno.
El sustrato etanólico se dispersa por goteo
en un recipiente (fermentador) que
contiene un sustrato inerte lo más
particulado posible (sin que se apelmace),
con mucha relación superficie/volumen,
por ejemplo, con virutas de madera o
cascara de maíz.
A medida que el sustrato se va pingando de
arriba abajo, la concentración de etanol
disminuye y la de acetato aumenta. Cuando
llega al fondo de la cámara de recolección,
se puede volver a reinocular por la parte de
arriba, así hasta que el efluente llegue al
nivel de acético deseado.

9.3. MÉTODO DE FERMENTACIÓN EN LÍQUIDO (“SUBMERGED FERMENTATION”)

La fermentación ocurre en un fermentador de acero inoxidable, con gran oxigenación y

agitación, que son los factores clave. La mayor parte del vinagre hoy en día se produce así.

En un ciclo de 16-24h, el etanol se puede reducir en n menos de 0,5%, y el acetato alcanza

niveles de 7-12%. En este punto se retira la mitad del vinagre y se reemplaza con sustrato
etanólico fresco, continuando así con el proceso.

El crecimiento celular de las bacterias del ácido láctico en uno de estos ciclos típicos de
fermentación es muy modesto; más o menos un único ciclo de duplicación. Caso todo el etanol
se gasta en producir energía, pero muy poca biomasa celular.

59
10. PRODUCCIÓN DE PAN
La fermentación del pan es producida por
S.cerevisiae, y se trata de una fermentación
etanólica. A pesar de que lo que se está
fermentando son los carbohidratos (glucosa
derivada del almidón), la proteína del trigo
(gluten), que suponen entre el 8 y el 15% de la
harina, cumple un papel importante, ya que
proporciona la matriz necesaria para retener el
CO2 producido durante la fermentación
alcohólica y ayuda a levedar la masa.
Las cepas de levadura de panificación son muy
diferentes a las usadas para las bebidas
alcohólicas. Se seleccionaron a lo largo del tiempo
por su capacidad para producir CO2, dar buen
sabor y aroma al pan, y por la estabilidad y
viabilidad que tienen (pudiendo así almacenarse
en diferentes formatos).
La producción de levadura para panificación es
una actividad muy importante a nivel mundial,
con miles de Tm anuales y con un enorme valor.
Las levaduras son un producto biotecnológico de primer orden.
Se cultivan en condiciones muy aerobias y con fuerte agitación, para promover la formación de
biomasa celular. Como nutrientes para estas levaduras, se utilizan restos de otras industrias
alimentarias, como la del azúcar (melaza de las cañas de azúcar y remolacha).
El maíz no tiene gluten, por lo que la masa no tiene elasticidad.
PRODUCCIÓN DE LEVADURA:

Puede obtenerse:
- Levadura hidratada (cream yeast): usada en industria.
- Levadura prensada (cake yeast).
- Levadura deshidratada (dry yeast).

10.1. MEJORA DE CEPAS DE LEVADURA PARA LA INDUSTRIA DEL PAN

La levadura de panadería es susceptible de mejoras ya que existe toda una serie de limitaciones
para las que hay que buscar soluciones. Por ejemplo, conviene añadir a la harina enzimas
amilasas y otras que ayuden a la degradación de almidón en glucosa.
Hoy en día, en la industria, se añaden a la harina enzimas amilasas, hemicelulasas y proteasas
para mejorar la textura de la masa, pero no se utiliza ninguna levadura modificada
genéticamente en la elaboración de pan.
Las levaduras comerciales se obtienen tras procesos de selección genética en el laboratorio
(“adaptative ale evolution”; ALE) o por procesos de “genome shuffling” (2 celulas de estirpes
distintas que se fusionan y recombinan sus genomas). En ambos casos, no se consideran
organismos modificados genéticamente, ya que no se le introducen genes heterólogos, sino que
son cepas derivadas de procesos de selección equiparables a procesos naturales.

60
MODIFICACIÓN GENÉTICA: levaduras GMO para producción de pan (solo en FASE DE
INVESTIGACIÓN, no se usa en la industria).
- Demostraron que una cepa de levadura mutada con una alfa-amilasa de Aspergillus oryzae
utiliza el almidón mejor que una cepa nativa.
- La fermentación del pan funciona aun sin amilasas, aunque con estas es más rápida.

11. FERMENTACIÓN DE LA LECHE

La leche de vaca contiene un 5% de lactosa y 3,3% de proteína. Las bacterias del ácido láctico
fácilmente superan a otras en el uso de la lactosa. Al fermentarla, acidifican la leche y crean un
entorno inhóspito para bacterias competidoras.

En teoría (y en la práctica), muchos derivados

lácteos pueden hacerse sin necesidad de cultivos
bacterianos iniciadores, simplemente añadiendo
acidulantes. Pero dichos productos no son
fermentados, carecen de las propiedades
organolépticas de los fermentados, así como de
sus propiedades nutricionales.

La función de las bacterias del ácido láctico en la

producción de derivados lácteos es muy simple;
fermentan la lactosa a ácido láctico, de forma que
el pH baja y se alcanza el punto isoeléctrico de la
caseína (principal proteína de la leche), que es
4,6. A este valor, la carga neta es cero y la caseína
tiene menor solubilidad, cuajándose así la leche.

El metabolismo del cultivo bacteriano también aporta otras moléculas orgánicas pequeñas
(acetaldehído, diacetilo, ácido acético y etanol) en bajas concentraciones, aportando muchas
propiedades organolépticas).

Hay muchas rutas colaterales, las bacterias del ácido láctico no solo degradan glucosa y lactosa.

Se pueden producir diferentes derivados lácteos por acción de bacterias y hongos:

61
11.1. PRODUCCIÓN DE YOGUR
Los cultivos iniciadores de yogur contienen Streptococcus termophilus y Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus normalmente en ratio 1:1. Ambas son especies HOMOFERMENTATIVAS. Para
cada estilo de yogur, se seleccionan las cepas concretas de estas especies para ser utilizadas
como cultivos iniciadores, aportando cada cepa distintos matices (aromas, texturas…).

No utilizan la galactosa, la excretan fuera de la célula, pero en este producto no tiene más
consecuencias. En algunos cultivos de yogur, se utilizan Lactobacillus helveticus (degrada
galactosa) en vez de L.delbrueckii subsp. bulgaricus.

El yogur también se utiliza como vehículo para otros microorganismos que no son necesarios en
el proceso de fabricación, pero que se administran como probióticos, como por ejemplo
Lactobacillus acidophilus y varias especies de Bifidobacterium.

Es importante cumplir la ratio 1:1 de S.termophilus y L.delbrueckii subsp. bulgaricus. Si el yogur

se hace con solo una de las dos especies, no sale bien.
S.thermophilus crece mejor al principio ya que el entorno de la leche es menos óptimo para
L.delbruekii. Con el paso del tiempo, S.thermophilus disminuye el pH y el Eh a niveles preferidos
por L.delbruekii. Además, S.thermophilus es débilmente proteolítico y carece de la capacidad de
hidrolizar la caseína, sobreviviendo al principio con los aa libres de la leche. Cuando se agotan
estos aa libres, S.thermophilus se beneficia de la presencia de L.delbruekii, que sí produce una
proteinasa. Finalmente, L.delbruekii produce niveles de acético intolerables para S.thermophilus
y su población disminuye en el yogur final.

Si estos microorganismos se propagasen de manera continua como cultivo mixto,

S.thermophilus desaparecería después de varios pases, por eso, en la manufactura de yogures
comerciales, los streptococos y los lactobacilos se cultivan por separado en condiciones óptimas
para cada uno, y posteriormente se mezclan.
Esto explica el porqué, si hacemos yogur en casa, tras varios recebados (backslopping) acaba
sabiendo mal, formando cuajos en el suero que flotan, sin llegar a producir un yogur
homogéneo.
Seleccionando cepas bacterianas ácido-sensibles, que paran la producción de ácido láctico
cuando se llega a un pH determinado, se consiguen yogures menos ácidos de lo normal.

11.2. PRODUCCIÓN DE KÉFIR

El proceso tradicional se basa en el uso de gránulos que contienen diversas
especies de bacterias y hongos. Los microbios producen polisacáridos
(kefirán) que mantienen la estructura en gránulos insolubles. Son como
“biorreactores celulares”.

Al terminar la fermentación, los gránulos se pueden recuperar y reutilizar.

Los sabores y aromas son debidos al ácido láctico y acético, diacetilo y acetaldehído, producidos
por bacterias lácticas homo y heterofermentativas. También se produce etanol por las levaduras
(pudiendo llegar hasta un 2%).

No siempre se hace con gránulos. Por ejemplo, en EEUU la leche se inocula en un cultivo iniciador
de Lactobacillus kefiranofaciens y Lactobacillus kéfir.

62
11.3. PRODUCCIÓN DE QUESO
La formación del queso se piensa que fue descubierta en la antigüedad por un accidente:
guardar la leche en el estómago de una cabra/oveja.

El paso fundamental es que algo hizo cuajar la leche, y esta se separó en 2 fases; una sólida
(masa del queso o cuajado), y fase líquida (suero). Los otros productos lácteos no causan una
separación de sólidos y líquidos.
El cuajado puede producirse por 2 mecanismos básicos:

- Ruptura enzimática de la caseína, haciéndola insoluble (acción de la enzima quimosina o

renina, la más utilizada). Esta enzima la podemos encontrar en los becerros (rumiantes
lactantes), cabras, ovejas… El estómago de los rumiantes tiene 4 partes diferenciadas; panza,
redecilla, libro y cuajar (llamada así por ser la parte en la cual se fermenta el queso. La ruptura
de la caseína también puede ser producida por la acción de proteasas vegetales como las de
algunos cardos.
- Por acidificación causada por bacterias del ácido láctico (la caseína precipita a pH 4,6).
Después del cuajo, tiene lugar la retirada del suero, el prensado y la maduración, con muchas
variables que dan lugar a las variedades que se producen en el mundo.

En muchas industrias usan “starter cultures” para el queso. Especies mesófilas como
Lactococcus lactis subsp.lactis y Lactococcus lactis subsp.cremoris; termófilas como
Lactobacillus helveticus y Streptococcus termophilus.

En los procesos industriales de producción de queso, se añaden los cultivos iniciadores y a

continuación la quimosina.

La mayoría de estos cultivos son homofermentativos. En algunos tipos de quesos se añaden

especies de bacterias del ácido láctico heterofermentativas como Leuconostoc mesenteroides
subsp.cremoris y Lueconostoc lactis. Estas especies fermentan el citrato y producen diacetilo,
que otorga el aroma y sabor de la mantequilla, típico de los quesos holandeses (como el Gouda
y Edam). Además, la formación de CO2 produce la aparición de pequeños ojos.

La quimosina se extraía, y se sigue haciendo, de la cuarta cavidad del estómago de los rumiantes,
sobre todo de becerros. También se utilizó mucho la pepsina extraída de estómago de porcino.
Obviamente esto no cubre la demanda mundial.

En la década de 1990 se avanzó en la producción de quimosina recombinante para surtir al

mercado FPC (Fermentation Produced Chymosin).

Actualmente se usa mucho la quimosina producida en Kluyvernomyces lactis y Aspergilus niger.

Algunas peptidasas de hongos, como Rhizomucor miehei sirven también para cuajar la leche y
hacer queso.

11.3.1. Pichia pastoris: cell factory para producir proteínas

recombinantes

El gen de la quimosina del yak (Bos grunniens) se sintetizó

químicamente (gen sintético) y se clonó en el vector pPICZαA,
bajo el control del promotor AOX1 (inducible por metanol), y
fusionado a la secuencia señal del α-mating factor de
Saccharomyces, para poder ser secretada.

63
11.3.2. MADURACIÓN DEL QUESO CON BACTERIAS DEL ÁCIDO PROPIÓNICO
En la fabricación de queso suizo Emmental, el cultivo iniciador contiene Streptococcus
termophilus > Lactobacillus helveticus > Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii (esta
última realiza la fermentación propiónica).
Cuando las ruedas de queso se meten en la nave de maduración, a 20º-25ºC, Propinobacterium
empieza a crecer, en la atmósfera anaeróbica del interior del queso. La lactosa ya ha sido
fermentada por las otras bacterias, y esta fermenta el ácido láctico, produciendo acetato,
propionato y CO2. La acumulación de CO2 da lugar a los “ojos” de este queso.

11.3.3. MADURACIÓN DEL QUESO CON HONGOS AZULES

Se añaden esporas del hongo Penicillum roquefortii a la leche o al cuajo. Los cultivos iniciadores
suelen contener Lactococcus lactis, además de un heterofermentativo como Leuconostoc, para
que produzca un entramado de galerías, permitiendo la oxigenación del queso ya que el hongo
es aerobio.

Para ayudar a la aireación, el queso ya con la forma final se perfora con agujas para crear el
entramado, pudiendo así crecer más el hongo.
Las piezas de queso se dejan madurar en entornos frescos (10-12ºC) y con un 90-95% de
humedad relativa.
Los hongos consumen ácido láctico, y producen proteasas y lipasas; se liberan amoniaco, aminas
y cetonas, aromas y sabores únicos

11.3.4. MADURACIÓN DEL QUESO CON HONGOS BLANCOS

Como pueden ser los quesos Camembert y Brie.
La leche se inocula en un cultivo iniciador bacteriano para producir el ácido láctico y a
continuación se añade la quimosina. Después, se añaden las esporas del hongo Penicillum
camemberti o bien se añaden en la superficie del queso. Se usa otro hongo; Penicillum
caseicolum que forma micelios blancos.

La degradación de proteínas por las proteasas del hongo produce amonio y metanothiol,
mientras que la degradación de los triglicéridos por lipasas de hongos produce metil-cetonas.
Estos compuestos aportan aromas y sabores únicos.
La proteólisis es la subida del pH por el amonio. Colabora a aportar textura blanda y cremosa en
este tipo de quesos.

En 1935 se descubrió que los bacteriófagos que infectan las bacterias del ácido láctico, son la
principal razón por la que los cultivos iniciadores pueden fallar. El resultado es una fermentación
más lenta de lo deseado, o la total inhibición.
Tienen especial transcendencia los fagos de Streptococcus termophilus y de Lactococcus lactis.

64
MEDIDAS DE CONTROL:
- Cultivos iniciadores libres de fagos.
- Los fagos se transmiten por aerosoles, aire y personal de la fábrica.
- Entorno de la quesería limpio, lejía y calor inactivan los fagos.
- Separar áreas de producción de queso de las áreas de manejo de cultivos, presiones positivas
y filtros HEPA en el laboratorio de los cultivos.
- Rotación de cultivos iniciadores (no usar siempre las mismas cepas).

11.4. SELECCIÓN DE BIMs (Bacteriophage-Immune Murant bacteria)

Las BIMs son cepas de bacterias del ácido láctico inmunes a los bacteriófagos. Desde mediados
del siglo XX se aislaron innumerables cepas resistentes de manera espontánea (selección en
laboratorio).

Actualmente se siguen seleccionando mutantes inmunes, pero de manera más selectiva:

• Cepas de BIMs de Streptococcus termophilus que adquirieron nuevos spacers en los loci de
su sistema CRISPR-Cas.
• Cepas de Lactobacillus lactis que acumularon deleciones espontáneas o mutaciones
puntuales que inactivan los genes yjaE y pip, dos proteínas de membrana a las que se unen
los fagos del grupo Cedouvirus. Así, estos mutantes son resistentes a la infección por los
fagos.

Por el momento, no se utiliza en la industria láctea ninguna bacteria modificada genéticamente

como tal. (es decir, ninguna bacteria que entre en la legislación GMO).

Cómo se seleccionarían estas bacterias, para buscar cultivos iniciadores libres de fagos.
HEAPLAWRENCE TEST: el principio de este test está basado en la premisa de que las cepas
capaces de crecer y producir ácido después de varios desafíos contra bacteriófagos tienen unas
resistencia innata contra fagos. La idea, el que resiste es el más fuerte.

Cultivo iniciador + cultivos de fagos (mezcla, contra la

bacteria del ácido láctico), para poder buscar las bacterias
resistentes a estos. Todo esto lo metemos en leche,
incubándolos, dándoles choques térmicos (el proceso debe
de ser lo más similar a la producción de leche).

Ojo, también miran el pH, si estaba muy ácido funcionaba,

había pocos fagos, y de manera igual si estaba muy alcalino,
no había funcionado y repetían. Cogen el suero, y vuelven
a infectar (unos 4 ciclos). La bacteria que quede sin infectar,
la mejor.

Los Lactobacillus que salgan, no son OMGs, son

únicamente seleccionados.

65
12. PRODUCCIÓN DE VEGETALES FERMENTADOS
Las bacterias lácticas de la propia microbiota natural de los vegetales es suficiente, en la mayoría
de los casos, para realizar la fermentación.
Estos procesos se realizan en el seno de salmueras con diferentes concentraciones de sal, que
en sí mismas ya condicionan las poblaciones bacterianas que proliferarán en el recipiente de
fermentación.

Las aceitunas verdes se tratan con sosa, para extraer la sustancia amarga,
se lavan, se les echa sal y se dejan fermentar. Esta fermentación la
produce la microbiota que haya por el lugar (entorno de las fábricas).

Lo mismo ocurre con los pepinillos.

Son fundamentalmente bacterias del ácido láctico.

13. PRODUCTOS CÁRNICOS FERMENTADOS

En la carne para embutir (zorza), se añaden cultivos iniciadores de bacterias del ácido láctico, y
cocos Gram (+) catalasa-positivos (Staphylococcus y Kocuria, siendo estos últimos bacterias
asociadas a epitelios de los animales).

El ácido láctico conserva la actividad nitrato- y nitrito-reductasa de los cocos Gram (+), que
transforma los nitratos (que se añaden como aditivo a la carne) en óxido nítrico, que contribuye
al color típico de los embutidos.

En la superficie de los embutidos (en la tripa) se inoculan hongos seleccionados, que compiten
con la microbiota no deseada, y por la actividad proteolítica y lipolítica, otorgando sabores y
aromas únicos.

Hay compañías biotecnológicas que venden inóculos de Lactobacillus buchneri (bacteria

heterofermentativa) para ensilado de alimentación animal.

66
 TEMA 5. PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS Y ADITIVOS
En 2014 se produjeron más de 5 mill. de toneladas de aa y casi la mitad corresponde al glutámico
(glutamato monosódico). Solo de lisina, ya se producen anualmente más de 2 mill. de toneladas.

Los aminoácidos se obtienen de tres fuentes principales:

- Hidrólisis de proteínas (por ejemplo, la cisteína por hidrólisis de queratina, a partir de plumas
y pelo de animales).
- Síntesis química (procesos caros) o bioconversiones. La diferencia entre estas es que la
síntesis química consiste en construir polímeros a partir de un monómero y la bioconversión,
en dar un intermediario y que los mo lo transformen.
- Fermentación microbiana (fundamentalmente bacterias), sobre todo con Corynebacterium
y Brevibacterium (Gram +).

Tradicionalmente, las cepas productoras naturales se mejoraron por mutagénesis y selección de

cepas superproductoras (métodos clásicos). Actualmente se busca mejorar la producción
mediante la manipulación genética de las enzimas y de las rutas biosintéticas, construyendo así
Microbial Cell Factories.

Todos los aa 20 tendrían algún

uso de interés industrial: como
por ejemplo: saborizantes
(glutamato...), edulcorantes,
soluciones intravenosas...
aditivos alimentarios (sobre
todo para alimentación
animal).

Aminoácidos esenciales en el ser humano y animales: Lisina, Metionina, Treonina, Triptófano,

Fenilalanina, Leucina, Isoleucina, Valina e Histidina. (en algunos libros dice que son 10 porque mete
también la cisteína, pero esta se puede interconvertir de la metionina).

1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GLUTÁMICO (GLUTAMATO MONOSÓDICO)

El ácido glutámico (Glu, E) es el aminoácido de mayor producción industrial en el mundo. Se usa
como aditivo alimentario por el intenso sabor de su sal sódica GMS: Glutamato MonoSódico.
Esta sabe a “umami”, uno de los cinco sabores básicos junto al dulce, ácido, agrio y salado.

Desde 1908 (descubrimiento del L-glutamato como responsable de este intenso sabor) hasta
1957, se purificaba a partir de hidrolizados de proteína, o se sintetizaba; ambos procesos muy
costosos.

Las cepas que sobreproducen L-glutamato son auxotróficas (de forma natural) para la Biotina,
y en la producción industrial debe mantenerse muy baja la concentración de Biotina.

67
 Si no das biotina, crecen muy poco. Al ir aumentando, es
favorable la ratio producción:crecimiento, PERO si
aumentamos mucho (25) la biotina, aunque la bacteria
crece mejor, la producción se reduce mucho.

El glutamato es secretado por Corynebacterium glutamicum al medio externo por un proceso

que no se conoce bien (hay hipótesis de que mutaciones que afectan a la permeabilidad de la
membrana celular facilitan que se secrete el glutamato).

La sobreproducción de glutamato se debe a que se desvía α-ketoglutarato del ciclo de Krebs

hacia la síntesis de glutamato.

2. PRODUCCIÓN DE LISINA
El mercado biotecnológico de la producción de lisina está en constante aumento (más de 2
millones de toneladas anualmente). Es un aminoácido esencial para animales, y se usa como
aditivos en piensos de pollos y cerdos, y en el pienso para peces en acuicultura ya que es el
primer aminoácido esencial limitante en materias primas proteicas para peces.

A finales de 1950, se descubrió un mutante de C.glutamicum, auxótrofo para homoserina, que

secretaba grandes cantidades de lisina al medio. Estos mutantes se patentaron y durante
décadas produjeron lisina con rendimientos de 40-60 g/L.

Actualmente se produce en grandes fermentadores de 500 m3. Las plantas de producción están
en partes del mundo con una gran producción de maíz, ya que se utiliza como sustrato para el
cultivo.

68
Con el paso de los años, se siguieron seleccionando mutantes mejorados de Corynebacterium
glutamicum; mutaciones que causan que determinadas enzimas no sean inhibidas por
productos de la ruta biosintética.

Cepa salvaje (WT): no sobreproduce lisina ya que la acumulación de Lys inhibe el paso enzimático anterior.
Mutante 1: mutado en homoserina (rodeada de naranja), ambos son insensibles a la inhibición. Hay una
baja producción de Met y Tre, por lo que la ruta no se inhibe por treonina y se produce más Lys.
Mutante 2: la enzima aspartato-kinasa está mutada y es insensible a la inhibición por producto final, por
lo que hay un aumento de Lys.

La secuenciación del genoma de las cepas productoras clásicas reveló un número de mutaciones
y modificaciones genéticas que mejoran el rendimiento. Por ejemplo, algunas mutaciones
causaron este tipo de efectos:
- Que la glucosa entre en la célula por un transportador de inositol (ioLT) y no por la vía
fosfotransferasa (PTS) clásica.
- Que la glucosa se derive a la Ruta de las Pentosas Fosfato y no a la glucólisis, para producir el
NADPH necesario (1 mmol de Lys necesita 4 moles de NADPH).
- Que se asegure una gran producción de oxalacetato, que es precursor de la lisina.

El próximo paso es reunir muchas de las mutaciones útiles individuales en una sola cepa
mediante ingeniería genética, y determinar si combinadas entre sí mejoran más la producción.

69
 PRODUCCIÓN DE CEPAS SUPERPRODUCTORAS:

Tenemos un productor industrial (que

funciona), secuenciamos el genoma
(vemos las mutaciones), cogemos una
cepa nativa e introducimos las
mutaciones.

3. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO

La producción anual es mayor a 1.750.000 Tm. Se usa en alimentos y bebidas (conservantes,
saborizantes, antioxidantes…) y en la industria farmacéutica (antioxidantes, efervescentes,
conservantes…).

Se produce desde 1916 por fermentación con el fungo

Aspergillus niger, con una eficiencia del 80% (el 80% del
azúcar aportado al cultivo se convierte en ácido cítrico).

Es un proceso “inseperado”, ya que A.niger puede degradar el azúcar completamente en el ciclo

de Krebs. Solo se produce secreción de ácido cítrico a altos niveles cuando:
- Está en fase estacionaria.
- El medio es muy ácido (pH 1,6-2,2).
- Hay mucho azúcar en el medio (120 a 250 g/L).
- El medio es deficiente en Mn2+, ya que dicho cofactor haría que las enzimas prosiguiesen el
ciclo de Krebs con normalidad.

70
4. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SUCCÍNICO (SA)
El ácido succínico se usa como aditivo en comidas y bebidas (saborizante), en la producción de
colorantes, perfumes, resinas y varios medicamentos; en la síntesis de bioplásticos y poliésteres.

Tradicionalmente se producía a partir del petróleo. Se puede sintetizar

químicamente por hidrogenación catalítica del ácido málico. PERO es mucho más
interesante producirlo a partir de fuentes renovables, mediante la fermentación
microbiana (“Bio-based succinic acid”).

Aunque muchas especies lo sintetizan, solo unas pocas bacterias anaerobias, o anaerobias
facultativas, lo producen a altos niveles (Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus
succinogenes, Mannheimia succiniproducens, Basfia succiniproducens), las cuatro aisladas del
rumen de los rumiantes. (los mo que están en el rumen degradan la celulosa a ácidos grasos de
cadena corta, no a glucosa).

Desafortunadamente, estas especies producen simultáneamente y excretan cantidades

importantes de otros ácidos (acético, fórmico y láctico) que, además de reducir el rendimiento
del ácido succínico, dificultan el proceso de purificación.

Para aumentar la producción en Mannheimia

succiniproducens, se eliminaron secuencialmente los
genes involucrados en la síntesis de otros ácidos por
manipulación genética.

Con cuatro mutaciones acumuladas, se consiguió pasar

de 10,5 g/L de succínico a 52,4 g/L en un fermentados
semicontinuo (fed-batch).

Otros planteamientos biotecnológicos van

encaminados a sobreproducir la enzima
MaeB, que desvía el piruvato a la síntesis de
malato.

También hay estrategias encaminadas a construir Microbial cell factories que produzcan
succínico en distintas especies (levaduras, E.coli…)
- Myriant: utiliza una cepa de E.coli modificada por ing.genética.
- BioAmber: utiliza Pichia kudriavzevii
- Succinity: utiliza una cepa modificada de Basfia succiniproducens. La cepa salvaje, que
producía 0.75 mol SA/mol de glucosa, se optimizó por ingeniería metabólica. La cepa
mejorada usa glicerol y maltosa, y produce 70g/L de SA.
- Reverdia: usa una cepa propia de S.cerevisiae que fermenta a bajo pH. Produce 43 g/L SA en
condiciones aerobias.

71
72
 TEMA 6. PROUDCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS
Existen 2 grandes grupos de microorganismos productores de antibióticos (son metabolitos
secundarios por excelencia):
• Hogos filamentosos (Penicillium spp.).
• Actinobacterias (género Streptomyces y otros).

1. Streptomyces spp.
Son bacterias Gram (+) de alto contenido en G+C. Son del filo Actinobacteria, clase
Actinobacteria y género Streptomyces. Sus colonias recuerdan a las de los hongos filamentosos, peor
no son tan blandas.

Son habitantes típicas de suelos. Producen geosmina, un sesquiterpeno volátil que confiere el
típico olor a tierra mojada. Producen enzimas extracelulares hidrolíticas que degradan polímeros
complejos, como lignina, polisacáridos, quitina y queratina. (son heterótrofas y secretan
enzimas para degradar la materia orgánica).

Hay más de 500 especies, de las que la mitad producen antibióticos. Son el principal grupo
bacteriano productor de antibióticos.Una misma especie de Streptomyces puede producir
varios antibióticos diferentes.
Tienen genomas de gran tamaño, de hasta más de 8 Mb (el doble que el genoma de E.coli) que
consta de un cromosoma LINEAL (no circular).

Pueden tener formas filamentosas complejas, micelios ramificados y producen esporas

(conidiósporas).

Los Streptomyces son procariotas “miceliares”, esporulantes, su ciclo comienza cuando brota
una espora. (el sufijo -myces se debe a que están relacionadas con los hongos).

El tubo germinal se extiende por crecimiento polar en los extremos. A ciertos intervalos el
filamento o hifa se ramifica, y este proceso lleva al final a la formación de un micelio vegetativo.

Las células no sufren la típica división celular, si no que se forman septos a lo largo de las hifas
(se supone que son como barreras para controlar la difusión de moléculas). Los cromosomas se
replican a lo largo de ellas y por las ramificaciones que van surgiendo.

En condiciones desfavorables (desecación, agotamiento de nutrientes), del micelio vegetativo

crecen hifas aéreas no ramificadas, recubiertas de una capa proteica hidrofóbica, que les
permite extenderse aéreamente y las protege de la desecación. Estas hifas aéreas se
transforman en esporas por un proceso de división celular y segregación cromosómica. Son
esporas resistentes que se dispersan por el ambiente.

73
 Los micelios vegetativos
crecen hacia abajo y, cuando
las condiciones se vuelven
desfavorables por la
desecación, se empieza a
emitir un micelio aéreo. Solo
se forma el micelio aéreo
cuando la bacteria quiere
entrar en el ciclo de
esporulación. Al crecer este,
se está replicando el ADN
tantas veces como tabiques
se van a formar: cada espora
lleva un equivalente
genómico. En esta fase es
cuando empieza a cambiar la
coloración del micelio (como
en los hongos).

Es importante destacar que los antibióticos son producidos por Streptomyces en el momento
de la diferenciación entre el micelio vegetativo y el aéreo.

Llama la atención la similitud estructural y de ciclo de vida entre Streptomyces (procariota) y los
hongos filamentosos (eucariotas).

Parece que el modo de vida micelar es una convergencia evolutiva, que surgió
independientemente en la evolución en organismos procariotas y eucariotas (cuando 2 grupos
independientes de seres vivos llegan a tener aspectos similares, sin tener nada que ver genéticamente
(tampoco tienen ancestros comunes)).

1.1. AISLAMIENTO DE ESPECIES DE Streptomyces A PARTIR DE MUESTRAS NATURALES

Principalmente se aíslan del suelo. Una gran parte de los antibióticos utilizados hoy en día se
aislaron de Streptomyces del suelo en la década de 1940/1960 (era dorada de los antibióticos).

Los medios son bastante específicos: con azúcar, carbonato cálcico, extracto de levadura…

74
BÚSQUEDA DE GENES BIOSINTÉTICOS:
Hoy en día se buscan clusters biosintéticos por tecnologías más sofisticadas: genome mining,
metagenómica (obtener por mutagénesis un mutante que no produzca, a continuación
transformarlo con una genoteca hecha con la cepa original y ver cual es capaz de producir
antibiótico)…
La secuenciación de genomas revela que el potencial biosintético de los Streptomyces está aún
poco explorado.

Los genomas contienen como promedio entre 20 y 40 clusters génicos biosintéticos de

metabolitos secundarios. La mayoría de estos son únicos de cada especie, o incluso de cepas
concretas, y codifican nuevas moléculas para la ciencia.

Como ya dijimos, los antibióticos son producidos por en la fase de diferenciación morfológica
(formación del micelio aéreo a partir del micelio vegetativo) en cultivos sólidos. En el caso de
tener cultivos en medio líquido, el momento de producción de antibióticos coincide con el inicio
de la fase estacionaria del crecimiento.

1.2. MÉTODOS CLÁSICOS DE CLONACIÓN DE CLUSTERS DE BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS

El DNA cromosómico de tipo silvestre productor de
antibiótico, se empalma en un vector de clonación de
Streptomyces. La librería de clones se utiliza para
transformar una célula no productora de antibiótico,
como el vector que lleva un reporter, las células
transformadas podrán seleccionarse fácilmente y el DNA
del plásmido insertado será caracterizado.

Caso similar al de prácticas: usamos Pseudomonas rubra

(pigmentada) y el mutante (despigmentado). Vimos que
en el mutante no se producía antibiótico, o que el
pigmento es la propia molécula antibiótica o comparten
ruta biosintética.

Streptomyces tiene un cromosoma lineal, y el tamaño del genoma es enorme (de 8 a 11 Mb). El
cromosoma tiene una región central conservada, y los brazos laterales son muy variables y de
evolución rápida, sufriendo numerosos eventos indel (reorganizaciones genéticas), y
adquisiciones de nuevo DNA por transferencia horizontal. Las partes terminales de los extremos
de los cromosomas lineales contienen “Terminal inverted repeats” (TIRs), que sirven de
telómeros para la replicación de los cromosomas lineales.

Los cluster biosintéticos de antibióticos, están localizados en los extremos del cromosoma
lineal, en los brazos laterales variables. (los clusters de producción de antibióticos están
normalmente en las esquinas, lo que explica que una misma cepa produzca muchos antibióticos
diferentes).
En la figura de la izquierda, se representa un modelo de la evolución
del cromosoma de nuestro microorganismo, por acumulación de
indels en las regiones terminales. La acumulación a lo largo del
tiempo aumenta la diversificación en los extremos terminales,
mientras que en la zona central se mantiene mas conservada. Las
cepas procedentes de un ancestro común difieren más en las
regiones terminales, que en la que tiene los genes más
conservados.

75
1.3. CONJUGACIÓN Y TRANSFORMACIÓN
Los Streptomyces se pueden modificar genéticamente introduciéndoles ADN por CONJUGACIÓN
usando E.coli como donadora. (sorprende porque la conjugación es más evidente entre Gram (+) o
entre Gram (-)).
Si puede ser, se usan esporas de Streptomyces frescas, recién obtenidas de una placa
esporulada, sacudiendo el cultivo con bolas de cristal (utilizadas para sembrar como sustituto
da asa o también para resuspender) y recogiendo las esporas en un medio liquido o solución
tampón (en el caso de Streptomyces que esporulen mal en laboratorio, hay protocolos para
conjugar E.coli y micelios de Streptomyces).
Se realiza un choque térmico a la suspensión de esporas, entre 45-50ºC durante 10 min, con el
fin de inducir su germinación. Se mezclan las esporas de la cepa receptora con las células de
E.coli donadora (cepa que contiene el plásmido recombinante).

Para una conjugación óptima, cada especie de Streptomyces suele necesitar una optimización
en el laboratorio de las condiciones del medio de cultivo usado durante la conjugación:
temperatura, presencia de cationes concretos…

Así, por conjugación se pueden

inducir plásmidos suicidas con
construcciones recombinantes
para realizar inserciones o
deleciones en Streptomyces,
basándose en la
recombinación homologa.

También se pueden usar protocolos de TRANSFORMACIÓN. En este caso se obtienen

protoplastos y se individualizan las células, ya que de lo contrario tendríamos micelios
recombinantes mixtos, derivados de la división de un micelio con células transformadas y células
no transformadas.

76
1.3.1. EJEMPLOS DE CLUSTERS DE BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS

Las penicilinas y cefalosporinas se sintetizan a

partir de un tripéptido δ-(L-α-aminoadipyl)-L-
cysteinyl-D-valine, que se forma mediante
enzimas NRPS (non ribosomal peptide
synthetase) codificada por pbcAB. Ambas
(penicilinas y cefalosporinas) se sintetizan a
partir del mismo precursor, tanto en hongos
como en bacterias.

Existen clusters de genes similares tanto en

hongos (Penicillium) como en bacterias
(S.clavuligens). La base de estos antibióticos
son los aminoácidos ACV (ácido
aminoadípico, cisteína y valina).

Las tetraciclinas son policétidos naturales, producidos por policétido sintetasa (PKS) de tipo II.
La diferencia de las PKS de tipo I y de las NRPS, es que son megaenzimas con múltiples módulos,
responsables de ir añadiendo nuevos monómeros a la cadena creciente, y las PKS de tipo II,
funcionan como subunidades separadas. Por tanto, son muchas enzimas individuales las que
participan en las reacciones que van sintetizando el policétido.

En la figura podemos observar el cluster de genes de S.rimosus, que participa en la biosíntesis

de oxitetraciclina.

77
RECORDATORIO:

• NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases)

A: Adenylation domain (activa el aa entrante, mediante ATP) (dominios que tienen la capacidad
de escoger los aa que formarán el péptido).
T/PCP: Peptidyl-carrier-protein domain (une covalentemente el aa).
C: Condensation domain (condensa dos aa).
TE: Thioesterase domain (libera el producto final mediante hidrólisis).

• PKS (PolyKetide Synthetases)

Son enzimas multimodulares con muchas similitudes con las NRPS pero sintetizan Policétidos en
vez de péptidos. Son responsables de la síntesis de numerosos productos naturales, muchos de
ellos utilizados actualmente como antibióticos (eritromicina), antifúngicos (anfotericina B),
fármacos antiparasíticos (avermectina), fármacos para reducir los niveles de colesterol
(lovastatina), inmunosupresores (FK506) y para quimioterapia anticancerígena (epothilone).

Las PKS tienen varios módulos, cada uno responsable de la incorporación y modificacion de un
sustrato de acyl-CoA para sintetizar el producto policétido.

78
2. BIOTECNOLOGÍA DE LA PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS
2.1. Mejorar los procesos de producción industrial de antibióticos ya diseñados.
- Mejoras en las condiciones de cultivo (investigación de moléculas/condiciones que induzcan
más producción).
- Modificación genética de las cepas productoras para obtener mayores rendimientos:
o Procesos clásicos de mutagénesis y posterior selección de cepas mejoradas, que contienen
mutaciones puntuales o que contienen los clusters biosintéticos en multicopia…
o Ingeniería genética dirigida: eliminar represores, incluir promotores más fuertes, clonar los
genes biosintéticos en Microbial cell factories heterólogas…

2.2. Diseño de NUEVAS moléculas.

1) Modificando químicamente antibióticos naturales: se produce el antibiótico en un
fermentador, se purifica y se somete a modificación química. Es un proceso químico, no
biotecnológico como tal. De hecho, es un proceso que se lleva haciendo muchas décadas.
Por ejemplo, genes bacterianos de resistencia a la kanamicina codifican enzimas que
fosforilan a kan en posición 3’ y 4’, que eran los puntos diana de las enzimas que confieren
resistencia. El compuesto resultante, dibekacina (3’,4’-dideoxykanamycin B), es insensible
a esas enzimas. Se trata de lo que se conoce como “antibiótico semisintético”.
2) Producir nuevos antibióticos por el proceso de BIOSÍNTESIS COMBINATORIA. Proceso
muy interesante en la ingeniería genética de las líneas de ensamblaje de NRPS y PKSs y
sistemas híbridos de ambas: proceso puramente biotecnológico y con perspectivas futuras
prometedoras.
La biosíntesis combinatoria utiliza enzimas y rutas modificadas por ingeniería genética, para
producir nuevos productos “no-naturales”, lo que permite incrementar la diversidad de
productos naturales con potencial farmacológico. Las PKSs y las NRPSs son las principales
candidatas para la biosíntesis combinatoria, gracias a su organización modular y a su mecanismo
de biosíntesis paso a paso.
Hay varias estrategias dentro de la biosíntesis combinatoria:
- Enzyme-level modification: modificar o intercambiar dominios enteros, módulos y
subunidades, mediante mutagénesis dirigida o por evolución dirigida (directed evolution).
- Pathway-level recombination: hacer rutas nuevas introduciendo enzimas procedentes de
distintas cepas y rutas biosintéticas.

79
2.2.1. BIOSÍNTESIS COMBINATORIA MEDIATE EVOLUCIÓN DIRIGIDA

Consiste en generar una gran diversidad genética de genes concretos, mediante técnicas in vitro,
por replicación del DNA mediante sistemas propensos a introducir errores, como es “epPCR”
(error-prone PCR).

Si tenemos indicios de aa “llave” concretos para la función de la proteína, se pueden modificar

directamente. Si no tenemos datos previos de la proteína, podemos hacer una mutagénesis al
azar. Así se crean bibliotecas de muchos miles de variantes genéticas.

A continuación, sobre esta diversidad genética creada, se aplican sistemas masivos de screening
para encontrar las variantes génicas que interesan.

La andrimida se biosintetiza mediante NRPS. AdmK es responsable de la incorporación de valina

y se seleccionó por evolución dirigida. AdmK se eliminó del cromosoma de la bacteria productora
nativa, Pantoea aagglomerans, seguido de una transformación con una librería de mutantes
AdmK. 4 compuestos se identificaron utilizando un método de screening high-throughput LC-
MS/MS y se ensayó la bioactividad en una placa de agar, observándose que los compuestos 5, 6
y 7 eran nuevos derivados de la andrimida (el compuesto 1 se corresponde con la andrimida
WT).

¿Podemos predecir cual va a ser el monómero reconocido y activado por un dominio de

adenilación en una NRPS que no está bien estudiada aun?

Si, la comparativa de secuencias de dominios de adenilación ayuda a “predecir” cual es el

sustrato reconocido por cada domino A. Mediante alineamiento de las secuencias, se
encontraron la secuencia que determinaba los residuos que se iban a incorporar en las NRPS. Es
lo que se conoce como “código no-ribosómico”.

80
En la figura se representan las estrategias de ingeniería basadas en la NRPS.
(A) un módulo mínimo de NRPS se define como la unidad catalítica responsable de la
incorporación de un aa específico, y se asocia a las modificaciones funcionales de ese grupo,
dentro de la cadena peptídica creciente.
(B) Representación esquemática de la mutagénesis dirigida por un cambio en la especificidad
del dominio A, que se modifica para aceptar un sustrato diferente.
(C) Sustitución del módulo C-A-T, permitiendo la producción de un producto análogo.
(D) sustitución del dominio A-T-C.

81
82
 TEMA 7. BIOTECNOLOGÍA DE VACUNAS
Las vacunas son suspensiones de microorganismos patógenos muertos o atenuados, o
fracciones aisladas de ellos, que cuando se inyectan en un animal producen inmunidad frente a
una determinada enfermedad.

1. VACUNAS TRADICIONALES
1.1. Vacunas de subunidades: preparado de subunidades antigénicas: lipopolisacáridos,
proteínas purificadas… (no hay por qué usar ingeniería genética, se puede hacer purificando
determinadas fracciones de los microorganismos, no tienen el ente microbiano completo).
1.2. Vacunas inactivadas: microorganismos enteros inactivados mediante diversos métodos
físicos o químicos (calor, formaldehido, glutaraldehído, β-propiolactona).

Las vacunas de subunidades y las inactivadas son menos intensas y duraderas. No existe riesgo
de desencadenar la enfermedad después de la vacunación. Son necesarias dosis de recuerdo.

1.3. Vacunas vivas atenuadas: los agentes inmunizantes se replican en el organismo sin causar
la enfermedad. Es una vacuna de larga duración, similar a la natural. PERO tienen el riesgo
de, al ser microorganismos vivos, podrían desencadenar la enfermedad.

2. VACUNAS BIOTECNOLÓGICAS
2.1. Vacunas de subunidad: producción de componentes acelulares inmunogénicos.

2.2. Vacunas vivas atenuadas: microorganismo atenuado por ingeniería genética (eliminando
genes indispensables para la virulencia).

2.3. Vacunas vectorizadas: expresión de antígenos heterólogos en un sistema vector.

2.4. Vacunas de ADN o ARN: introducción en las células diana de ADN o ARN que codifica el
antígeno.

TIPOS DE VACUNAS:

El toxoide es una toxina inactivada que se utiliza como vacuna, por ejemplo, la vacuna del
tétanos es la toxina de la bacteria Clostridium tetani.

VPLs (virus like particles): partículas de proteínas víricas ensambladas pero carentes de genoma,
por lo que no son infecciosas, pero provocan una respuesta inmune.

OMVs (outer membrane vesicle): las Gram (-) liberan vesículas de la membrana externa, que
contienen proteínas externas de la bacteria, por lo que son altamente inmunogénicas sin ser
infecciosas (no se pueden replicar, por lo que son más seguras) y no hay que inactivarlas.

Los protein-polysaccharide conjugates son conjugados entre un polisacárido bacteriano y una

proteína bacteriana.

Las viral vectored y bacterial vectored expresan antígenos de otro organismo.

83
 <

3. VACUNAS TRADICIONALES BACTERIANAS INACTIVADAS

También conocidas como “bacterinas”. Son muy utilizadas para bacterias de importancia
veterinaria.

Se cultivan las bacterias en fermentadores y luego se inactivan con formalina al 0,1-0,7% (la
formalina es una disolución de formaldehido [40% v/v] en agua). 48 h de inactivación.

Se mezclan con “adyuvante”. Puede ser hidróxido de aluminio, otras contienen aceite mineral
como adyuvante, y se trata de emulsiones acuosas-oleosas. Pueden ser sin adyuvante o con
adyuvante (acuosas u oleicas).

Son muy fáciles de reproducir, algunas tienen elevadas tasas de protección, otras funcionan
peor.

84
Si se fabrican con una cepa aislada de un brote concreto, la vacuna se va a utilizar solo para
prevenir más brotes en ese mismo entorno, son las llamadas “autovacunas”, solo están
autorizadas cuando no existe un tratamiento comercial disponible. (no es comercial, tiene que ir un
veterinario/biólogo a la explotación y aísla la cepa que causa esa enfermedad en concreto. es como una
vacuna personalizada).

Entre los inconvenientes podemos encontrar:

- Toxicidad del formaldehido.
- El formaldehido desnaturaliza a las proteínas; puede afectar a la capacidad inmunogénica.
- Mala representatividad de determinados antígenos: no sabemos si la bacteria en cultivo en
el fermentador está realmente expresando antígenos importantes que también expresaría
in vivo durante la infección. Muchas bacterias tienen plásmidos que se pierden in vitro muchas
veces, por lo que el cultivo final de la bacterina no contiene todos los genes o antígenos que tendría
la bacteria patógena in vivo.

CALENDARIO DE VACUNACIÓN INFANTIL DE GALICIA:

3.1. EJEMPLOS DE VACUNAS TRADICIONALES DE USO ACTUAL

Vacunas que utilizan subunidades de los microorganismos
- Neisseria meningitis del grupo C (vacuna a base de polisacáridos)
- Clostridium tetani + Corynebacterium diphteriae: vacuna de tipo “toxoide”, las toxinas
tetánica y diftérica se inactivan con formaldehido.
- Streptococcus pneumoniae (pneumococo): la vacuna “Prevenar 13” consiste en polisacáridos
purificados de varios serotipos del pneumococo.

Vacunas que utilizaron microorganismos inactivados (muertos)

- Hepatitis A (transmitida por vía oral-fecal).

Vacunas que utilizan microorganismos atenuados. (pueden tener algo de replicación pero no causan
infección completa).
- Varicela-zoster: vacuna “Varivax”, virus vivos atenuados de la varicela, producidos en células
humanas MRC-5.
- Vacuna “Priorix”, frente al sarampión, Parotitis y rubeola. (virus atenuados).

En la mayoría de los casos, para aumentar la eficacia y la inmunogenicidad, las vacunas

contienen adyuvantes: moléculas que estimulan el sistema inmunológico (Ej: sales de aluminio).

85
4. VACUNAS DE SUBUNIDAD
Contienen moléculas de los microorganismos, pero no el microorganismo completo:

- CLÁSICAS: obtenidas mediante purificación de sub-componentes del microorganismo:

polisacáridos, toxina, proteínas de la mb celular, proteínas de la capsula vírica, de la
envuelta lipídica de virus envueltos…
- BIOTECNOLÓGICAS: obtenidas mediante la producción biotecnológica de moléculas
recombinantes. Los ejemplos más abundantes consisten en producir proteínas del
microorganismo, en huéspedes heterólogos (levaduras, bacterias, líneas celulares…).

Para la producción de estas vacunas, primero se produce la proteína antigénica de forma

recombinante. Es posible incluso producir pequeños fragmentos peptídicos inmunogénicos. Se
puede empezar por una predicción in silico de proteínas epítopos en una proteína de interés, y
luego realizar pruebas experimentales de antigenicidad.

Ejemplos de vacunas de subunidad utilizadas en la actualidad en España (en negrita las

recombinantes: solo hay 3)

4.1. BACTERIANAS
• Haemophilus influenzae tipo B: vacuna de polisacáridos purificados.

Bacteria Gram (-) que puede causar meningitis, otitis… Produce una cápsula polisacarídica de
Polirribosil-ribitolfosfato (PRP) responsable de la virulencia y de la inmunidad. La vacuna se
fabrica con polisacárido purificado, al que se le conjuga el toxoide del tétanos (toxina tetánica
inactivada). (es una vacuna conjugada).

Se conjugan los polisacáridos con las proteínas transportadoras ya que, los polisacáridos por si
solo no producen una respuesta inmune fuerte y duradera (solo habría inmunidad humoral, no
celular). Para mejorar esto, los polisacáridos se conjugan con una proteína “Carrier”
(transportadora). Por ejemplo, el toxoide tetánico, que incrementa mucho la respuesta inmune
e induce memoria.

Los antígenos polisacarídicos son poco

inmunogénicos por si solos, dando lugar a una
leve respuesta de anticuerpos (a), mientras que
las vacunas que consisten en polisacáridos
conjugados con proteínas (b) consiguen una
elevada respuesta. La respuesta inmune de
este tipo de vacunas se encuentra en las
gráficas, en las que se representa la leve
producción de linfocitos B y de anticuerpos en
la respuesta a los polisacáridos, y a falta de la
respuesta de linfocitos T, mientras que la
respuesta en vacunas conjugadas provoca una
respuesta de producción más elevada en todo,
además de durar más tiempo.

También hay respuesta inmune frente a la proteína transportadora conjugada con el

polisacárido, por eso se usan proteínas con interés vacunal (toxoide del tétanos y de la difteria).

86
• Streptococcus pneumoniae (Pneumococo): vacuna de polisacáridos purificados.

Bacteria Gram (+), puede causar pneumonia y meningitis. Produce una capsula polisacarídica.
La vacuna se fabrica con polisacáridos purificados de 13 serotipos diferentes de bacterias, a los
que se les conuga un derivado de la toxina diftérica como proteína transportadora.

• Bordetella pertussis (tos ferina), Clostridium tetani (tétanos), y Corynebacterium diptheriae

(difteria): vacunas tipo toxoide, de toxinas inactivadas, enriquecidas con otras proteínas de
B.pertussis (hay vacunas trivalentes, para las 3 bacterias juntas). Vacuna trivalente

Son vacunas de tipo toxoide, de toxinas inactivadas de cada una de las 3 especies, enriquecidas
con otras proteínas adicionales de B.pertussis.
- Pertactina: proteína de membrana de B.pertussis altamente inmunogénica y responsable de
la adhesión de bacterias a las células de la tráquea humana.
- Proteína FHA: una hemaglutinina filamentosa involucrada en la adhesión de la bacteria al
epitelio. Hemaglutinina: todas las proteínas microbianas que al interaccionar con la sangre aglutinan
eritrocitos, se denominan así.

Hay vacunas trivalentes, para las 3 bacterias juntas: por ejemplo la vacuna comercial Boostrix.

• Neisseria meningitidis (Meningococo): para serogrupos C y B (la B no está en el calendario

vacunal).

Coco Gram (-) causante de la meningitis, produce una capsula polisacarídica. Vacunas diferentes
para serotipos B y C (Los más abundantes de Europa)

o Vacunas contra Meningococo C: vacuna de polisacáridos capsulares. (NO recombinante).

o Vacunas contra Meningococo B: vacuna Bexsero®, tres proteínas recombinantes
producidas en E.coli. Vacunas RECOMBINANTES que contienen proteínas de Neisseria
producidas en E.coli, además de vesículas de membrana externa de la bacteria (OMVs:
Outer Membrane Vesicles):
▪ Neisserial adhesion protein A (NadA). (para pegarse a las paredes)
▪ Factor H-binding protein (fHBP)
▪ Neisserial heparin-binding antigen (NHBA) (para coger nutrientes)

4.2. VÍRICAS
• Virus de la Hepatitis B (HBV): vacuna recombinante, antígeno producido en levaduras.
El virus de la hepatitis B posee 3 antígenos: el superficial (HBsAg), el interno (HBcAg) y otro
denominado (HBeAg). El exceso de ag superficial se agrupa, formando esferas o túbulos que se
detectan en el suero de personas infectadas.

Para la vacuna, el antígeno HBsAg se produce de manera recombinante en levaduras

(Saccharomyces cerevisiae) y se autoensambla en el citoplasma de la propia levadura, formando
esferas, que posteriormente se purificarán a partir del cultivo del fermentador.

Es un virus
envuelto de DNA
bicatenario.

Transmisión
sérica o por
contacto sexual.

87
• Papilomavirus (HPV): vacuna recombinante, antígeno producido en líneas celulares.

Son virus de DNA eicosaédrico que están formados por una proteína mayoritaria que es la L1.
La variación de los aa en esta proteína son los que dan lugar a los diferentes serotipos. La vacuna
actual intenta cubrir los serotipos que dan lugar al cáncer de útero.

Hay 2 vacunas recombinantes: (ambas producidas en S.cerevisiae recombinantes)

- GARDASIL: vacuna tetravalente frente al VPH-6/11/16/18

- GARDASIL-9: vacuna novalente frente a VPH-6,11,16,18,31,33,45,52 y 58

- CERVARIX: vacuna bivalente frente a VPH-16/18, producida por un sistema de expresión en

Baculovirus, en líneas celulares de Trichoplusia ni. En estas líneas, o en levaduras, es donde
vamos a producir las proteínas L1 del eicosaédro.

BACULOVIRUS-INSECT CELL EXPRESSION SYSTEM

Son virus con un genoma de ADN bicatenario circular que es semejante a un plásmido. El sistema
de expresión cuenta con:

88
- Genes de interés (genes del antígeno a producir en grandes cantidades) se clonan en un
plásmido (donor plasmid).
- Genoma del Baculovirus, está contenido en otro plásmido (Bacmid). Ambos plásmidos se
introducen en una cepa de E.coli especialmente preparada (por ejemplo, DH10Bac cells) en
las que el gen de interés puede saltar por trasposición a una zona del genoma del bacalovirus
que no es esencial (gen de la proteína “polihedrina”). (es una proteína no esencial).
- Este baculovirus recombinante se utiliza para infectar células de insecto, en las que se
producirá la proteína recombinante.

• Vacunas de subunidad para la Gripe: recombinantes por Baculovirus

Virus fragmentado bicatenario de ARN envuelto. Como es de ARN, varía mucho (porque la RNA
pol no tiene actividad reparadora e introduce fallos en la transcripción).

- FLUBLOK QUADRIVALENT: el gen de la hemaglutanina del virus se introduce en un vector

Bacalovirus, que se utiliza para infectar la línea celular eucariota que produce el antígeno.
1) La hemaglutanina, las proteínas o los antígenos que se encuentran en la superficie del
virus influencia se identifican para su inclusión en la próxima vacuna para la gripe, en la
siguiente estación.
2) Los antígenos se transcriben a una secuencia de DNA.
3) La secuencia de DNA se inserta en un plásmido.
4) La secuencia del plásmido se combina en un Bacalovirus recombinante.
5) Los bacalovirus recombinantes transportan las secuencias importadas hasta las células
huésped.
6) Las células huésped se reprograman para producir grandes cantidades del antígeno.
7) Los antígenos se separan y se colectan de las células huésped, para purificarlos y forman
la vacuna.
8) Los antígenos estimulan el sistema inmune para que el cuerpo produzca anticuerpos que
ayudan a neutralizar el virus influencia (de la gripe) cuando una persona se expone a dicha
enfermedad.

89
NOTA: los virus envueltos suelen necesitar contacto muy próximo para contagiarse, mientras que los
desnudos se transmiten más fácilmente.

5. VACUNAS ATENUADAS POR INGENIERÍA GENÉTICA

Están vivas pero atenuadas, se pueden replicar en el organismo, pero no hacer un cuadro grave.

Atenuación por deleción de genes necesarios para sintetizar moléculas esenciales. Por ejemplo;
Salmonella entérica. Puede llevarse a cabo una de las siguientes estrategias, pero normalmente
se realizan de manera simultánea:

1) Deleción de genes aro (codifican enzimas que participan en la biosíntesis de compuestos

aromáticos, como varios aminoácidos).
2) Deleción de genes pur (codifican enzimas para el metabolismo de purinas).

Es una estrategia de elaboración de vacunas que consiste en reducir la capacidad proliferativa

en el huésped. Este tipo de mutantes no pueden captar los monómeros y la tasa necesaria para
reproducirse rápidamente. En otros ejemplos, se delecionaron genes esenciales para la
supervivencia de la bacteria in vivo.

Actualmente se pueden utilizar como vacunas en sí mismas y como método para expresar
antígenos de otras especies. Por ejemplo, la vacuna atenuada de Salmonella, en la que se
expresan antígenos de otras especies, sería una vacuna atenuada multivalente, pero también
se puede considerar vectorizada, ya que expresa antígenos heterólogos.
* Vectorizada: que lleva antígenos contra otros patógenos.

Se usa Salmonella porque se puede tomar de forma oral

90
6. VACUNAS VECTORIZADAS
6.1. VACUNAS VECTORIZADAS EN BACTERIAS
Utilización de bacterias vivas atenuadas como vectores. Ventajas:
- Fácil manufactura, barata y escalable.
- Múltiples vías de vacunación posibles, especialmente por la rotura de la mucosa oral.
- Se conocen muchos genes cuya mutación atenúa la virulencia de una bacteria.
- Se pueden seleccionar cepas vectoras muy sensibles a antibióticos, por si hubiese
reacciones adversas.
- Pueden inducir fuertes respuestas inmunitarias frente a antígenos homólogos (propios) y
heterólogos (de otras especies).

(I-IV) clonación del gen heterólogo de inserción dentro del vector en la bacteria, puede
insertarse en el cromosoma o ser portado como un plásmido. (V) Expresión del antígeno
heterólogo. (VI) Adaptación del sistema inmune. (VII) Protección frente a los patógenos.

6.2. VACUNAS VECTORIZADAS EN VIRUS

Podemos utilizar virus de 2 tipos:
- Virus atenuados, pero capaces de replicarse en el huésped final.
- Virus deficientes de su replicación: no se van a replicar en el huésped que recibe la vacuna.

Proporcionan inmunidad
frente a 3 virus distintos

91
6.2.1. VACUNAS VECTORIZADAS EN VIRUS ATENUADOS REPLICATIVOS

Vacuna vectorizada contra el Ébola (rVSV-ZEBOV) de la empresa

MERCK: utiliza como vector el virus de la estomatitis vesicular (VSV),
atenuado pero replicativo. VSV es un rhabdovirus, de la misma familia
que el virus de la rabia (Virus de ssRNA -), virus envueltos.

Es una vacuna viva atenuada. Está aprobada y en uso actualmente.

Se elimina el gen de la glicoproteína G de la envuelta del VSV u se sustituye por la glicoproteína

GP de la envuelta del virus Ébola. La propia partícula viral ya expresa el antígeno de interés en
su propia envuelta (cosa que no ocurre con los vectores derivados de Adenovirus, que son virus
sin envuelta).

Se produce en la línea celular VERO (línea de células renales de mono).

7. VACUNAS DE DNA
Vacunas en las que se administra directamente el gen que dirige la síntesis del antígeno. Este se
sintetiza en el huésped y genera una respuesta inmunitaria similar a la de las vacunas atenuadas.

El DNA que codifica el antígeno se introduce en un vector de expresión transitoria que, al carecer
de origen de replicación reconocible por el organismo hospedador, es incapaz de replicarse en
células de mamíferos.

Generalmente se utilizan vectores de E.coli que contienen el gen de interés adyacente a un

promotor viral de expresión fuerte en el organismo del hospedador.

92
EJEMPLO: Las vacunas de DNA de INOVIO’s distribuyen plásmidos optimizados directamente
dentro de las células, intramuscularmente, o por via dérmica utilizando los pequeños
dispositivos CELLECTRA, que mediante un pulso eléctrico abren los pequeños poros reversibles
en las células, que permiten la entrada del plásmido, superando la limitación que supone la
entrada de los ácidos nucleicos en las células, como el mRNA.

8. VACUNAS CONTRA EL SARS-CoV-2

Es un virus envuelto que obtiene dicha envoltura de la célula que infecta, de la membrana del
Golgi, del RE o de la membrana plasmática. Las proteínas de membrana están mayoritariamente
codificadas por el genoma del virus, aunque hay alguna proteína codificada por el genoma de la
célula, que fueron arrastradas con la mb.

Es un virus de RNA + que se traduce directamente. Lo primero que se traduce son las
polimerasas, para poder replicarse.

93
8.1. VACUNAS DE COVID-19 DE mRNA
El mRNA que codifica la proteína de la espícula del SARS-CoV-2 se empaqueta en una
nanopartícula lipídica que, tras la inyección intramuscular, es introducida por las “células
presentadoras de antígenos”. Los ribosomas traducen este mRNA. La proteína de la espícula
puede ser fragmentada en pequeños péptidos por acción del proteasoma (1), o bien puede ser
transportada a través del Golgi al exterior de la célula (2).

(1): Los fragmentos que quedan en la célula se unen al complejo mayor de histocompatibilidad
de clase I (MHC I) en el RE, y son presentados en la superficie celular. Este complejo es
reconocido por los linfocitos T CD8, que generan inmunidad mediada por células.

(2): Por otro lado, las proteínas de la espícula que se transportan fuera de la célula pueden ser
captadas por distintas células inmunitarias, y se rompen en fragmentos en el endosoma. Dichos
fragmentos se presentan en la superficie celular con el MHCII, que es reconocido por las células
T CD4, las cuales facilita que las células B produzcan anticuerpos específicos para el antígeno.

Para poder hacer la vacuna, se clona el gen de la espícula (S), sintetizado normalmente por
síntesis química o por constructos de DNA con las regiones 5’-UTR, 3’-UTR, con la cola de poliA…
que es lo que se clona en el plásmido. Este va a ser el molde para la formación de RNA mediante
transcripción in vitro (proceso cell free) por la polimerasa T7 (en el plásmido el gen tiene que
estar bajo el control del promotor T7). Estos transcritos se van a empaquetar en vesículas
lipídicas:

- Vacuna Comiraty BNT162b2: BioNTech y Pfizer.

- Vacuna ARNm-1273-CoV-2: Moderna.

94
En ambas vacunas, la ficha técnica las describe como vacunas de mRNA encapsulado en
nanopartículas lipídicas SM-102, monocatenario con 5’-cap, producido mediante transcripción
in vitro acelular, a partir de los moldes de DNA correspondientes, que codifica la proteína de la
espícula (S) viral del SARS-CoV-2.

Ventaja sobre otro tipo de vacunas. Son vacunas “cell-free”, no se necesitan células huésped
para fabricarlas.

Una vez puesta a punto la plataforma de fabricación, es fácil producir cualquier otra nueva
vacuna, simplemente diseñando una nueva secuencia molde.

Primero se construye un plásmido de expresión, que contiene un promotor muy fuerte

(normalmente promotores derivados de fagos T7, T3 o SP6), y a continuación, la secuencia
candidata para la vacuna (en este caso, la secuencia codificadora para la espícula del
coronavirus).

Para vacunas de mRNA convencionales, la secuencia antigénica está flanqueada por regiones 5’
y 3’ no traducibles (UTRs). La cola de poly(A) puede o bien estar ya incluida en la secuencia 3’
del ADN molde original, o añadirle enzimáticamente después de terminar la transcripción in
vitro.

Los moldes de ADN para las vacunas autoamplificables “saRNA” contienen genes de replicación
y amplificación del RNA, ya que formarán el complejo RdRP (RNA-dependent RNA polymerase).

Finalmente, el mRNA se produce mediante transcripción in vitro a partir de un molde de DNA

lineal, usando la RNA polimerasa del bacteriófago T7.

95
 • VACUNAS DE mRNA CONVENCIONALES vs AUTOAMPLIFICABLES
Las convencionales no replican el RNA introducido, pero las autoamplificables se introducen en
las células con los constructos y las polimerasas, capaces de replicarlos.

Para las vacunas de mRNA convencionales, la secuencia antigénica esta flanqueada por
regiones 5’, 3’ no traducibles (UTR). La cola de polyA puede o bien estar unida a la secuencia 3’
del DNA molde original, o bien añadirse enzimáticamente tras finalizar la transcripción in vitro.
Una vez llegan a la célula, el mRNA se libera al citoplasma a través del endosoma, y se traduce
inmediatamente. Al entrar, el mRNA se va a traducir o a degradarse.

Los moldes de DNA para las vacunas autoamplificables “saRNA”, contienen genes de
replicación derivados de Alphavirus, así como diferentes secuencias conservadas. Codifican las
secuencias antigénicas y las proteínas no estructurales virales (nsPs). Las denominadas proteínas
no estructurales 1, 2, 3 y 4 (nsP1-4) son esenciales para la replicación y amplificación del RNA,
ya que forman el complejo RdRP (RNA-dependent RNA polymerase), dando lugar a muchas
copias del molde de mRNA, que contiene la secuencia antigénica y las nsPs. Finalmente, el mRNA
se produce mediante la transcripción in vitro a partir de un molde de DNA lineal, utilizando RNA
polimerasa del bacteriófago T7. El saRNA contiene el antígeno y la maquinaria viral de
replicación para una amplificación intracelular de RNA, lo que lleva a altos niveles de expresión
antigénica.

En el método C), hay

moléculas distintas
para el GOI y para la
polimerasa: VENTAJA.

Se puede hacer la
misma molécula de
polimerasa para
distintas vacunas.

96
8.2. VACUNAS DE COVID-19 VECTORIZADAS
Usan adenovirus (virus sin envoltura).

• Vacuna Vaxzevria ChAdOx1-2: Astrazeneca & University of Oxford

Está basada en un vector adenoviral de chimpancé de replicación deficiente, ChAdOx1, en cuyo
genoma se incluye el gen del antígeno de la glucoproteína de la espicula del SARS-CoV-2. Se
produce en la línea celular HEK (células embrionarias de riñón) modificadas genéticamente
(para permitir la replicación de los adenovirus defectivos). El virus entra en la célula e introduce
el DNA en el núcleo. El adenovirus está diseñado para que no realice copias de si mismo, pero el
gen de la proteína de la espícula del coronavirus es transcrito en la célula diana, y se traduce en
los ribosomas. Las proteínas de la espícula estimulan a las células del sistema inmune.

• Vacuna de Janssen (Ad26.COV2-S): Janssen Pharmaceuticals Companies Jhonson&Jhonson

Mecanismos de acción similar a la anterior. En este caso es un adenovirus tipo 26, que codifica
la glucoproteína de la espícula del SARS-CoV-2 (ad26-COV2-S), producido en células PER.C6
(células de la retina humana).

Las 2 vacunas anteriores solo varían en la variedad del virus, y en la célula huésped que utilizan
para fabricarla, no en el sistema en el que se basan.

• Sputnik V: Gram-COVUD-Vac
Está basada en utilizar dos adenovirus recombinantes de 2 serotipos diferentes (rAd26 y rAd5)
para cada una de las dosis. Los adenovirus recombinantes llevan el gen de la glucoproteína S del
SARS-CoV-2. El uso de 2 vectores diferentes está encaminado a minimizar a que haya respuesta
inmune contra el vector en sí, que podría dar lugar a una RI indeseada contra el vector en la
segunda dosis.

Usa dos vectores de Adenovirus

diferentes para cada una de las
dos dosis.

1ª dosis: tapa azul y

componente 1 (rAd26-S);

2ª dosis: tapa roja y

componente 2 (rAd5S).

97
VACUNA VECTORIZADA EN PROYECTO: uso del VSV (Virus Estomatitis Vesicular) como vector.

Este tipo de vacunas está autorizada para el ébola.

98
 TEMA 8. CONTROL DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
1. INSECTICIDAS MICROBIANOS
PROBLEMAS de los INSECTICIDAS QUÍMICOS TRADICIONALES:

- Cuando se usa un pesticida único de forma global, es muy fácil que aparezcan descendientes
resistentes. Es lo que pasó con la mosca común, resistente a casi todos los pesticidas.
- Muchos pesticidas afectan a especies que no son diana a eliminar, lo que puede tener
consecuencias ecológicas desastrosas: la eliminación de un insecto predador de otras
especies puede causar la multiplicación descontrolada de una plaga que hasta entonces se
mantenía más o menos controlada.
- La persistencia en el ambiente y la toxicidad de muchos pesticidas químicos.

ALTERNATIVAS basadas en la BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA

- Los insectos son susceptibles a la infección por microorganismos, muchos de los cuales tienen
un rango muy estrecho de hospedador, no causan la destrucción masiva de especies
beneficiosas y no tienen toxicidad para vertebrados.
- A pesar de todas estas ventajas, los pesticidas de origen microbiana solo presentan el 1% del
mercado.

1.1. BACILLUS THURINGIENSIS

Es una bacteria Gram (+) que vive en el suelo alimentándose de materia orgánica.
Ocasionalmente tiene un modo de vida parasítico infectando insectos.

La bacteria se descubrió a principios del S.XX porque infectaba larvas de la mariposa de seda y
otras especies.

Parece tener baja capacidad de transmisión entre insectos. No es especialmente “contagioso”.

Por eso, para usarlo como insecticida, hay que obtener sus proteínas tóxicas, pero no se usan
las células bacterianas como agentes infecciosos.

Muchas de estas toxinas son de codificación

plasmídica.

Durante el proceso de esporulación (formación de endosporas), produce los denominados

“cuerpos de inclusión cristalinos parasporales”, formados por las proteínas tóxicas con
actividad insecticida. Por tanto, las células en crecimiento activo no producen estos cuerpos de
inclusión y no son tóxicas para insectos. Los cristales pueden estar formados por varias prots distintas.

* Delta-endotoxinas: gran familia de toxinas que forman parte de los cuerpos de inclusión de
B.thuringiensis.

99
Se conocen muchas cepas diferentes, que tienen distintos espectros de toxicidad frente a
diferentes especies de insectos (hay cepas patógenas para lepidópteros (mariposas y polillas),
dípteros (moscas y mosquitos) y coleópteros (escarabajos). También hay tóxicas para
nematodos (Caenorhabditis elegans)).

En Israel se aisló una cepa, llamada Bacillus thuringiensis var. israelensis, muy interesante para
combatir los mosquitos. Pensemos que los mosquitos son transmisores de muchas
enfermedades causadas por virus, bacterias y parásitos (la malaria por ejemplo, con 200-300
millones de casos anuales).

También existen plantas transgénicas de soja, maíz, algodón y patata, que expresan proteínas
insecticidas de B.thuringiensis.

1.1.1. δ-ENDOTOXINAS
Las proteínas tóxicas que constituyen los cristales en las esporas de B.thuringiensis se
denominan genéricamente δ-endotoxinas, y se pueden clasificar en dos familias:
- Toxinas “Cry” (crystal): proteínas de los cristales parasporales, que tienen toxicidad en
organismos diana. Hay mucha diversidad de proteínas Cry.
- Toxinas “Cyt” (cytolytic): proteínas de los cristales paraspoolares, que tienen actividad
hemolítica (citolítica).

Estas toxinas (denominadas δ-endotoxinas) de los cuerpos de inclusión están en forma de

protoxina inactivada. En el intestino de las larvas hay proteasas que procesan la protoxina
convirtiéndola en toxina activa. El pH intestinal también juega
un papel en el procesamiento. Los diferentes grupos de
insectos tienen distintos rangos de pH intestinal y esto
contribuye también a la especificidad de las toxinas de
B.thuringiensis.

Se necesita que los insectos coman las toxinas (condiciones de

pH específicas para cada toxina y tratamiento proteolítico). Si
ese insecto no tiene el pH ni las proteasas específicas, la toxina
no le afecta porque no se transforma en su forma activa.

100
 Las toxinas se unen a receptores específicos en la
membrana plasmática de las células intestinales de la
larva, y forman poros que trastocan el flujo de iones,
causando la lisis celular.

Recreación química de lo que pasaría dentro del intestino de un

insecto de forma biótica:

Representación esquemática de un cristal parasporal de

B.thuringiensis compuesto de la protoxina Cry1. La conversión de la
protoxina a la toxina activa requiere la combinación de un pH
ligeramente alcalino (7,5-8) y la acción de proteasas específicas,
ambas de las cuales se encuentran en el estómago del insecto. La
toxina activada se une con los receptores de superficie en la
membrana epitelial del estómago.
Las larvas de mosquitos se comen las toxinas.

EJEMPLOS:
• Dipel ® contiene un cultivo esporulado de B.thuringiensis subsp. kurstaki, que se aplica en las
plantas después de su resuspensión en agua.
El ingrediente activo son las esporas y los cristales de la proteína tóxica (cuerpos de
inclusión), que serán ingeridos por las larvas de los lepidópteros.
Estos cristales contienen cinco proteínas tóxicas diferentes.
• Bti: Bacillus thuringiensis subsp. israelensis: produce 3 toxinas tipo Cry y 1 toxina tipo Cyt,
tóxicas para larvas de mosquitos. Se utilizan para control de plagas de cultivos, pero también
para evitar transmisiones de enfermedades humanas por mosquitos.
Ocasionalmente la bacteria puede reproducirse dentro del insecto, produciendo una
infección. Esto no es especialmente contagioso, como ya habíamos comentado.

MEJORAS BIOTECNOLÓGICAS POSIBLES EN LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS INSECTICIDAS

Las protoxinas de B.thuringiensis son producidas en la fase de esporulación, los genes de las
toxinas están controlados por factores sigma que solo son activos en esta fase. Tienes que esperar
a que la bacteria termine de esporular y después vaciar el reactor: tienes que tener reactor batch.
- Si queremos desacoplar la síntesis de toxinas de la fase de esporulación, y permitir que las
toxinas se produzcan en la fase de crecimiento vegetativo, como mínimo hay que cambiar
los promotores. La producción en la fase vegetativa permitiría hacer cultivos continuos
(fermentadores más pequeños, producción más económica).
- Los genes de las toxinas se pueden clonar bajo control de promotores constitutivos e
introducirlos en mutantes de B.thuringiensis incapaces de esporular: la síntesis de las toxinas
ocurre en ausencia de esporulación. El rendimiento es mayor y se ahorra tiempo y sustratos
nutricionales.
- Generar una cepa de B.thuringiensis recombinante que produzca simultáneamente varias
toxinas diferentes con especificidades frente a diferentes ordenes de insectos.
- Producción de toxinas duales, hibridas, resultado de fusionar una toxina especifica, por
ejemplo para lepidópteros con otra específica para coleópteros o para dípteros.

101
2. PARATRANSGÉNESIS
La paratransgénesis consiste en llevar a cabo una modificación genética de las bacterias
simbióticas del microbioma de insectos que actúan como vectores de enfermedades, para que
estas bacterias simbióticas produzcan alguna molécula efectora que limite la prevalencia de los
patógenos en la población. En fase experimental: muchos condicionantes (liberación de OMGs).
* La transgénesis consistía en modificar el genoma del mosquito (para hacerlo estériles, matarlos, que
deje de ser un hospedador bueno para el patógeno…).

Se trata por lo tanto de modificar las bacterias que viven en simbiosis con mosquitos, por
ejemplo, para que produzcan una determinada molécula que impida el desarrollo de patógenos
que utilizan dicho insecto como vector de transmisión. La idea no es afectar al insecto vector,
sino al microorganismo patógeno.

Esta estrategia abriría nuevos horizontes en el control de enfermedades humanas o animales

transmitidas por insectos vectores, por ejemplo la malaria, chafas, leishmaniosis…

Hay que tener en cuenta varios requisitos indispensables para que la paratrasngénesis funcione:
- Después de llevar a cabo modificaciones genéticas de las bacterias simbiontes, estas deberán
ser incorporadas de nuevo en el vector, ya sea en el vector adulto (en el caso de insectos se
aporta la bacteria en una solución con azúcar) o bien en vectores en estado larvario
(incorporando las bacterias en su hábitat para que sean ingeridas). Las bacterias simbiontes del
mosquito tienen que ser cultivables y modificables en laboratorio.
- Las bacterias modificadas deberán seguir teniendo la capacidad de poblar el vector
(transferencia vertical) y vivir en simbiosis con él. Ya que los mosquitos tienen un ciclo de vida
pequeño.
- Las moléculas efectoras (toxinas en general) deberán ser eficientemente producidas in vivo
por las bacterias modificadas. Y si son secretadas mejor.
- Los efectores deberán tener actividad contra el patógeno diana. Sería muy deseable que las
moléculas efectoras fueran secretadas, ya que así se facilita su interacción con el patógeno.

102
MOLÉCULAS EFECTORAS UTILIZADAS EN LA PARATRANSGÉNESIS
Uno de los elementos clave en la paratransgénesis son las moléculas efectoras que queremos
que produzca la bacteria simbionte modificada genéticamente, que deberán ser capaces de
inhibir la proliferación del patógeno diana.

Las moléculas efectoras deben afectar solo al patógeno, pero no deben afectar al insecto vector.

Incluso lo ideal sería que la incorporación de los simbiontes modificados en el vector mejorasen
la supervivencia del vector, ya que así la selección natural favorecería a los vectores que
contienen simbiontes modificados que producen la molécula efectora.

La molécula efectora no debe afectar a la propia bacteria simbionte modificada que la produce.

MOLÉCULAS EFECTORAS

1) MOLÉCULAS EFECTORAS QUE PROVOCAN LA MUERTE DIRECTA DEL PARÁSITO (TOXINAS):

escorpina, defensinas, cecropinas… Categoría más abundante.
2) MOLÉCULAS EFECTORAS QUE INTERACCIONAN CON EL PARÁSITO REDUCIENDO SU
PROLIFERACIÓN. Dentro de estas encontramos diferentes tipos de anticuerpos que
interaccionan con la superficie del parásito provocando la inhibición de su unión a los
tejidos diana del insecto.

3) MOLÉCULAS EFECTORAS QUE INTERACCIONAN CON EL EPITELIO DEL INTESTINO O DE LAS

GLÁNDULAS SALIVARES DE LOS VECTORES. Para que el parásito Plasmodium pueda
completar su ciclo de vida necesita atravesar el epitelio del intestino y de las glándulas
salivares del vector, de forma que a este nivel se puede tratar de inhibir al parásito.

4) MOLÉCULAS EFECTORAS QUE PERMITEN MODULAR EL SISTEMA INMUNE DEL VECTOR.

Otra alternativa es usar moléculas que potencien el sistema inmune del vector, de forma
que sea él mismo quien reduzca la proliferación del parásito.

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