INHIBICION DE LA ACTIVIDAD UREASICA RUMINAL IN VITRO
POR EL ACIDO ACETOHIDROXAMIC08,b
RESUMEN.•
Este experimento se realizo con la finalidad de me­
dir el efecto inhibidor del acido acetohidroxamico
(AAH) ante diferentes concentraciones de urea y
tiempos de reaccion sobre la ureasa ruminal in vi­
tro.
Como dnnadores de I(quido ruminal se usaron
borregos alimentados con una dieta rastrojo de
ma(z-sorgo con 1.53% de urea. Con ayuda de ca­
maras de Conway. se prepararon soluciones con
cuatro concentraciones de AAH (90, 75, 150 y
225 mg/mlL dos conce~traclones de urea (7.5 y
15 mg/mll, que se aplicaron en forma factorial a
tres tiempos de incubaciOn (60, 120 y 180 min.l
en Hquldo ruminal mantenld~ a 400 C. En capa
una de las 24 celdas producto del arreglo factorial
se conto con seis observaciones.
a Recibido para su publicacibn el 15 de febrero
de 1988.
b Financiado en parte por eI PAIEPEME, A.C.
Este trabajo corresponde a parte de la tesis del
primer autor para la obtencibn del grado de
Licenciado en Medicina Veterinaria y Zoo­
teenia, FMVZ-UNAM.
EI trabajo 58 realize, en el laboratorio de Nu­
triciOn, CENID-Microbiologia, INIFAP, Pa­
lo Alto, D.F., los autores agradecen la rele­
vante participaciOn de la M.Sc. Irma Teja­
da de Hernandez; IU invaluable asesoria en el
montaje da las tflcnicas y al haberla facilitado
el usa del laboratorio.
c CIFAP-HUI. INIFAP, Apdo. Postel 17, Hui·
manguillo, Tab. 86400_
d CENID-Fisiologia, INIFAP. Apdo. Postel 29-A,
Ouer6taro, Oro. 76020.
nco Pee. Mex. Vol. 26, No.2 (1988)
RUBEN CRUZ SOTOc
JUAN LOPEZc
JOSE A. CUARON I. d
La inclusion de AAH resulto en una inhibicion
no-competitiva de la actividad ureasica (P 0.01)
equivalente al 79% de 10 observado sin AAH y si­
milar para los niveles del acido de 75 a 225 mg/ml.
En la interaccion urea x tiempo de incubacion
(P 0.01), los tres tiempos dentro de cada ni­
vel de urea se comportaron diferente, pero entre
niveles de urea solo se encontraron diferenc.ias
(p 0.01) a los 120 min: 42.4 vs. 33.3 mg N-NH 3
para los 15 y 7.5 mg de urea/ml en forma respec·
tiva. La cantidad de N-NH 3 liberado despues de
60 min. sin AAH (32 mg) fue similar a 10 obteni·
do a los 120 min. cuando el AAH se incluyo a
razon de 150 y 225 mg/ml (40 y 37 mg).
INTRODUCCION.
La ureasa es una enzima producida
por gran numero de bacterias anaero­
bias 19 y anaerobias facultativas 6 que
habitan por 10 comun en el rumen. Es­
ta enzima es muy activa, de tal manera
que, al ofrecer dietas con altas concen­
traciones de urea, esta va a ser hidroli­
zada hasta amoniaco (MH3), 10 cual
da por resu Itado que el mayor factor
limitante para el uso de fa urea como
suplemento prote'ico en dietas para ru­
miantes sea su gran velocidad de hi­
dr6Iisis3 . 8 . 9 ! 6 Y, sobre todo si es len­
153
 ta la hidrolisis de los hidratos de car- tro con el AAH, demostro que al aiia­
bono inclu idos en la dieta. dir el compuesto la actividad ureasi­
ca se inhibio en un 84.2% a una con­
Blomfiels y Col. 2 indicaron que la centracion de 0.01 M. cabe aclarar
velocidad de hidrolisis de urea ocurre que las concentraciones del substrato
cuatro veces mas rapido que la incor­ (urea) utilizadas en estos trabajos fue­
poracion de NH3 a la proteina micro­ ron muy bajas para lograr una satura­
biana. De esto resulta en una consi­ cion del sistema, cosa que puede suce­
derable perdida de nitrogeno para la der al ofrecer a los animales dietas con
sintesis. el exceso de NH3 es absor­ altas concentraciones de urea, por 10
bide y despues eliminado sobre todo tanto, se deben probar concentracio­
,en forma de urea por via renal 10 . nes mayores a las utilizadas en dichos
experimentos antes de proceder a su
Bajo condiciones extremas, el NH3 uso en la alimentacion animal. Con el
puede pasar a la sangre en cantidades fin de obtener mayor informacion
tan altas que rebasan la capacidad del acerca del efecto del AAH sobre la
h igado para convertirlo en urea, 10 ureasa en el I iquido ruminal, se plan­
cual provoca una intoxicacion8 • 13 • tearon los siguientes objetivos:
La inhibicion de la actividad ureasi­
ca disminuye la tasa de liberacion de a) Medir el efecto inhibidor del AAH
NH3 en el rumen. Esto origina, en sintetizado en laboratorio, sobre la
forma hipotetica, una mas eficiente ureasa ruminal in vitro.
proteosintesis bacteriana y, aunado a
esto, una disminucion en el riesgo de b) Observar el efecto inhibidor del
intoxicacion 7 ,10. AAH ante diferentes concentracio­
nes del substrato (urea) y diferentes
Los hidroxomatos han probado ser tiempos de reaccion sobre la ureasa
potentes y especfficos inhibidores de ruminal in vitro.
la ureasa, ya sea de origen vegetal 0
bacteria noll . 12, Y se ha establecido MATERIAL Y METODOS.
que el grupo CONHOH es el responsa­
ble de la actividad inhit,~toriall. EI trabajo se realize en el laboratorio
central de nutricion animal del
EI acido acetohidroxamico (AAH) II\JIFAP, ubicado en Palo Alto, D.F.
fue probado por Brent y Col 3 , sus es­
tudios in vitro demostraron que al ser Se utilizaron como donadores de
adicionado directo al I iquido ruminal, IIquido ruminal (LR) dos ovinos de
en una concentracion de 10 mg/ml, la raza Pelibuey, con un peso promedio
produccion de NH3 decrecio en un de 32 ± 1.5 kg, antes desparasitados y
50% y se inhibio por completo ante vitaminados, con fistula permanente a
200 mg/ml. Jones 10 en pruebas in vi­ nivel de rumen.

154
 Se les ofrecio agua y alimento a li­ interno, se anadieron 2 ml de acido
bertad, se adaptaron durante 21 d ias a borico de ConwayS, para adaptar el
una dieta con el 40% del nitrogeno to­ nitrogeno amoniacal (I\I-N H3) vohitil
tal a partir de urea, para facilitar ajus­ producto de la hidrolisis de urea por
tes en la microbiota, de tal forma que la ureasa ruminal.
aumentara la concentracion de ureasa
en LR. EI alimento contenia rastrojo Oespues de colocar las soluciones
de malz (61.1%), sorgo (35.3%), urea respectivas en los compartimientos
(1.5%) y minerales (2%), formulado a externo e interno, las camaras se se­
un 11 % de PC y para satisfacer las de­ lIaron con vaselina, para evitar la fuga
mandas de nutrimentos esenciales se­ de N-NH3 volatil, luego se sometieron
gun 10 recomendado por NRC l5 . a tres tiempos de incubacion (60, 120
y 180 min.) en baFio Maria a 40OC; en
Conclu ido el periodo de adapta­ cada tiempo de incubacion se inclu­
cion, se extrajeron 250 ml de LR di­ veron las dos diferentes concentra­
recto de la fistula de cada borrego, se ciones de urea y a cada concentracion
pasaron por cuatro capas de gasa, para de urea, las cuatro concentraciones de
de inmediato ser vaciados en un solo AAH.
termo con el fin de mezclarlo y con­
servarlo a su temperatura original has­ AI finalizar el tiempo de incubacion
ta el momenta de lIevarlo al laborato­ asignado, se destaparon las camaras
rio l8 • correspondientes y se titulo el acido
borico con HCI 0,001 N para calcular
Para la realizacion de las pruebas in la cantidad de N-NH3 volatil producto
vitro, se utilizaron dos soluciones con de la hidrolisis de urea.
diferente concentracion de AAH, (0,
150, 300 y 450 mg/m), como solven­ Las unidades experimentales fueron
te se utilizo agua deionizada. EI AAH las camaras, se distribuyeron bajo un
utilizado fue sintetizado en este labo­ disefio experimental por completo al
ratorio segun 10 descrito por Lopez azar, en un arreglo factorial 4X3X2
y Cuaron 14 • (concentracion de AAH x tiempos de
incubacion x concentracion de ureal,
Ya en ellaboratorio, el LR se depo­
con seis observaciones por celda, la va­
sito en camaras de Conway. En el
riable de respuesta fue el N-NH3 vola­
compartimiento externo de las cama­
ras se colocaron 2 ml de LR (enzima) til.
+ 1 ml de soludon de AAH (inhibi­
EI analisis de varianza se realizo
dor) + 1 ml de solucion de urea (subs­
tratol, de tal forma que las concentra­ conforme al siguiente modelo.
ciones por cada ml de LR fueron de 0,
75, 150 y 225 mg de AAH, y de 7.5 y Yijkl M + AI + Tj + ATij + Uk
15 mg de urea; en el compartimiento + AUik + ATUijk + E(ijk)1

155
En donde: La comparaclon entre medias se 9 HERMER, LG. an,
Pregress in the utili:
realize conforme al metoda de SNKI. replacer for ruminan
Yijkl ::: la i-esima observacion del k-esi­ 54:25.
mo nivel de urea, del j-esimo tiempo RESULTADOS Y DISCUSION.
de incubacion del i-esimo nivel de 10 JONES, G.A•• 1968
ximic acid on some
AAH; IVI = la media poblacion cons­ Los resultados del analisis de varian­ mun microbiota. (
tante; Ai =:: iesimo nivel de AAH; za mostraron efectos (P < 0.01) del
T = .el j-esimo tiempo de incubacion; tiempo de incubacion del nivel de
11 KOBASHI, K_ Kur
ATij =:: el j-esimo tiempo de incuba­ AAH y de las interacciones tiempo de 1971. Effect of ac
cion, del iesimo nivel de AAH; Uk =:: el incubacion, x urea y tiempo de incu­ acids in urease inhibi
Acta 227:429.
k-esimo nivel de urea; AUik ::: el i-esi­ bacion x AAH.
mo nivel ,de AAH del k-esimo nivel de 12 KOBASHI, K. TAKE
urea; TUjk el k-esimo nivel de urea, EI efecto del tiempo de incuba­ and HASE, J. 1975 I
by hidroxamic acid
del j-esimo tiempo de incubacion; cion (Cuadro 1),semanifesto (P<O.Ol) J. Biochem., 77:837.
ATUijk =:: el k-esimo nivel de urea del, cuando se pronuncio la liberacion de
j-esimo tiempo de incubacion del, N-NH3 al aumentar el tiempo de incu­ 13 LEWIS, D., 1980.
i-esimo nivel de AAH; E(ijk)n = el bacion, 10 cual coincide con la activi­ ruminant. J. AgF. Sci

error distribu Ido normal y en forma dad tfpica de una enzima a una canti­
14 LOPEZ, J. and CU,ll
independiente con media cero y va­ dad de substrato en exceso, en donde
del acido acetohidrc
rianza uno. la cantidad del producto (NH3 en este
CUADRO 1

EFECTO DEL rIEMPO DE INCUBACION Y DE LOS NIVELES DE AAH

A
SOBRE LA LIBERACION DE N-NH l VOLATIL IN VITRO

TIEMPO DE INCUBACION (MINUTOS)

60 120 180 EEM
N-NH 3 (mg/IOO ml ) 37.8C 1.074

ACIOO ACETOHIOROXAMICO (mg/ml)

a 75 150 225 W1

1.24

A) MEDIAS DE MINIMOS CUADRADOS PARA LOS EFECTOS MAYORES DE TIEMPO p~ 0,01)

Y AAH (p< 0_01)­

B,C,D,) VALORES CON D1STINTA LITERAL SON DIFERENTE5 ENTRE 51 (p,(, 0.01)

15G
 CUADRO 2.

INTERACCION ENTRE EL TmlPO DE INCUBACION Y LA

CONCENTRACION DE LA LIBERACION DE NMNH3 VOLATIL
IN VITRM
TIEMPO DE INCUBACION (MINU'TOS)
60 120 180 Wl

UREA 7,5 78.0 B

UREA 15 78.2 8 1.518

A) MEDIAS DE MINIMOS CUADRADOS PARA LA INTERACCION UREA X

TIEi4PO (P<'O.Ol),
B,C,D,E,} VALORES CON DISiINTA LITERAL SON DIrERENTES ENTRE 51 ­
(P<. 0, Ol), EXPRE5AD05 EN MGt100 Ml,

caso) liberado, ira en proporcion di­ En el Cuadra 2 se resume la interac­

4
recta con el tiempo de reaccion • cion entre el tiempo de incubacion y
la concentracion de urea. Se observa
Ante la inclusion del AAH (Cuadro que el valor de N-NH3 en los tres
1) se encontro que a 75, 150 y 225 tiempos de incubacion fue distinto
mg deAAH/ml de LR, la liberacion de (P< 0.01) dentro de los dos niveles de
N-NH3 disminuyo (P < 0.01), en com­ urea (7.5 y 15 mg/ml). En cambio,
paradon con el tratamiento con 0 mg se encontro que entre dichos niveles,
de AAH/ml, los que al analisis esta­ solo hay diferencia (P < 0.01) a los
distico fueron similares (P> 0.01). 120 min. de incubacion, y fue mayor
Los tres niveles de adicion del AAH, con 15 mg de urea por ml, quiza debi­
resultaron en una inhibicion promedio do a que el nivel de saturacion por el
del 79% , de tal manera que, de 75 a substrato esta entre 7.5 y 15 mg de
225 mg/ml de AAH no se observ~ urea/ml de LR, 10 cual se ilustra en la
aumento significativo en la inhibicion Figura 1.
de la ureasa ruminal in vitro bajo las
condiciones del estudio. En contraste Con la interaccion tiempo de incu­
3
con esto, Brent y Col encontraron bacion y AAH los resultados se resu­
que con una concentracion de entre 5 men en el Cuadro 3, en donde se ob­
y 10 mg de AAH/ml hubo una reduc­ serva que la adicion de las diferentes
cion de la velocidad inicial en un 50%, concentraciones de AAH (0.75, 150 y
por otra parte, Jones 10 observo una 225 mg/ml), tienen el mismo efecto
inhibicion del 84.2% a 0.01 M de sobre la liberacion de N-NH3 volatil
AAH, con la consideracion de que en pero al aumentar el tiempo de incuba­
estos dos trabajos se utilizaron con­ cion (de 60 a 180 min, la demanda de
centraciones muy bajas del substrato. AAH para inhibir es mayor). Esto si9­

157
 FIGURA 1

EFECTO DEL TIEMPO DE INCUBACION Y NIVELES DE

UREA SOBRE LA LIBERACION DE N-NH 3 VOLATIL IN

IDlLQ EN LIQUIDO RIH~INAL

100
200
90
.... : 180
/.
80 /.
/. 160
N-NH 3 70 /.
/. 140
/. N-NH 3
60 /.
I11g/100 ml /. 120
50 / mg/lOO m1
100
40 ' - - ' 7.5 mg DE UREA
80
30 _____ .15.0 mg DE UREA
60
20
40
10
, 20
60 120 180
MINUTOS DE INCUBACION

nifica que con I.

CUADRO 3
inhibidor, la ca
INTERACCION ENTRE EL TIEMPO DE INCUBACION Y LA transformado e!
CONCENTRACION DEL AAH SOBRE LA LIBERACION DEL
N-NH 3 .!!i. VITROA porcional al tierr
menor con la adi
ra 2), de tal mal
ACIOO ACETOHIDROXAMICO (mg/ml)
de N-NH3 volatil
TIEMPO (MINUTOS) 0 75 150 225 EH4 hibidor, es simile
reaccion al utiliza
60 32.1 E 6.6 G 5.5 G 5.1 G
tracion de 150 y .
120 97.6 C 19.1 18,4 F 15,gF
180 177 .6 B 46.3 0 40.4 DE 37.3DE 2.147
Lopez y Cuan
cientes en este Ie
A) . MEDIAS DE MINJMOS CUADRADOS PARA LA INTERACCION TIEMPO X AAH ron que el AAH
(P<"O.Ol) de tipo no-comp!
B,C,D,E,F.G) . VALORES CON DISTINTA LITERAL SON OIFERENTES (P~O.Ol) EXPRESA de canavalia, exal
DOS EN MG/IOO ML. ­ bo en el presentl
que en un siste

158
 FIGURA : :

EFECTO DEL TIEMPO DE INCUBACION Y NIVELES

DE AII H FN LA Ll BE RACION 0 E N- Nf! 3 !.!L VIT R0

EN LIOUIDO RUMINIIL.

200

180

160 /
UG DE AAH
/
140

N-NH 3
/
120
o
/ 75
mg/lOO ml 100 / 150
/" 225
80
/'
60 /
/'
40 /'
20

60 120 180
MIMUTOS DE INCUBACION

nifica que con la inclusion 0 no, del
inhibidor, la cantidad de substrato
transformado es directamente pro­
porcional al tiempo de reaccion, pero
menor con la adicion del AAH (Figu­
ra 2)' de tal manera que, la cantidad
de N-NH3 volatil a los 60 min. sin in­
hibidor, es similar a los 180 min. de
reaccion al utilizar AAH a una concen­
tradon de 150 y 225 mg/ml.
Lopez y Cuaron 14 , con pruebas re­
cientes en este laboratorio, demostra­
ron que el AAH ejerce una inhibicion
de tipo no-competitiva sobre la ureasa
de canavalia, exacto como se com pro­
bo en el presente trabajo con LR ya
que en un sistema saturado por el
substrato (urea), la Vmax fue diferen­
te al incluir el inhibidor, porque como
se sabe, si la concentracion del subs­
trato es elevada, la adici6n de un inhi­
bidor competitivo no produce inhibi­
cion y su consecuencia la Vmax no se
modifica 4 •
EI que el AAH actue como un inhi­
bidor no competitivo a nivel de rumen
es de importancia, ya que si su activi­
dad inhibitoria no es alterada por la
concentracion del substrato, se podran
utilizar raciones con niveles altos de
urea sin el peligro de anular fa carac­
tedstica inhibitoria del compuesto y
de esta forma, retardar la liberaci6n
de NH3 para obtener un maximo

159

aprovechamiento del productQ p~r la
microflora ruminal, se subraya que el
que la Vmax se modifique dependera
de la concentracion del AAH y no de
la concentracion del substrato. En su­
rna, la inclusion del AAH en concen·
traciones de 75, 150 y 225 mg/ml,
tiene un efecto inhibitorio de la ureasa
similar y es de un 79% en promedio.
EI tiempo de incubacion tiene una
relacion directa con la liberacion de
N-NH3, cuando existe un sistema sa­
turado per el substrato, sin importar
si se afiade 0 no el AAH.
EI AAH sintetizado actua como un
inhibidor de tipo no competitivo ya
que la Vmax fue diferente al inclu (r el
inhibidor, se toma en cuenta que se
proveyo un sistema saturado p~r el
substrato, as( la liberacion de N-NH3
durante 180 min. de incubacion a una
concentraci6n de AAH, de 150 y 225
mg/ml es similar cuando se incuba 60
min. sin incluir el inhibidor. Ante los
resultados de este trabajo se confirma
la inhibici6n de la actividad ureasica y
quiza que con el producto sintetizado
(AAH), como aditivo alimenticio, se
podr fan obtener mejoras en la utiliza­
cion del nitrogeno alimentario provis­
to p~r la urea y, p~r la modificaci6n
en el metabolismo ruminal, inducirse
alteraciones en los patrones de fer­
mentaci6n.
SUMMARY.
This experiment was designed to measure the
urease·inhibiting activity of acetohidroxamic acid
(AAA) upon different urea concentrations and in
ruminalliquid incubation times.
160
~;<.i . _. .
Rumina! liquid was obtained from sheep pre·
vlously fed with corn stover and sorghum grain,
including 1.53% urea, in Corway chambers Lowr
AAH solutions (0.75, 150 and 225 mg/mi), two
urea concentrations 17.5 and 15 mg/ml) and three
incubation times (60, 120 and 180 min. in ruminal
liquid at 400 C) were used after a factorial arren·
gement of a completely randomized design with six
observations per cell.
The addition of AAH resuted in a non-competi·
tive inhibition of urea se activity IP 0.01) equiva' UREA 7.5
lent to 79% of that observed without the addition UREA 15
of AAH. being similar for any of the AAH levels.
The interaction urea x incubation time (P 0.01)
showed differences within urea levels, but between
this, differences were found only at 120 min: A)
42.4 vs. 33.3 mg N.NH 3 respectively for the 15
and 7.5 mg of urea/ml. The amount of N.NH 3
freed after 60 min without AAH 932 mg) was B,C,D,E,)
similar (P 0.01) to that obtained at 120,min.
when AAH was included at 150 and 225 mg/ml
(40 and 37 mg respectively). caso) liberado, in
recta con el tier.
LlTERATURA CITADA.
Ante la inclusia
1 ANDERSON, V.L. and MC LEAN, R.A., 1974.
Desings of experiments. Realistics aproach. 1) se encontr6 ql
Marcel Dekker, Inc., N.Y. mg deAAH/ml de
2 BLOOMFIELS, R.A... GARNER, G.B. and N-NH3 disminuy6
MUHRER, M.E., 1960. Kinetics of urea meta· paraci6n con el tn
bolism in sheep. J. Anim. Sci., 19: 1248. de AAH/ml, los I
3 BRENT, B.E., ADEPOJU, A. and PORTELA, dfstico fueron si
F., 1971. In vitro inhibition of rumn urease Los tres niveles d,
with acetohidroxamic acid, J. Anim. Sci.,
32:794. resultaron en una i
del 79% , de tal n
4 CON, E.E. y STUMPF, P.K., 1982. Bioquj"· 225 mg/ml de A
mica fundamental. 3ra. ed. Limusa, Mexico.
aumento significat
5 CONWAY, E.J., 1957. Microdifusi6n anallsis de la ureasa rumir
and volumetric error. 4 th ed. Crosby Lockwava
and Son LTD, London. condiciones del es'
con esto, Brent '1
6 COOK, A.R." 1976. Urease activity in the ru· que con una conCE
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teria. J. Gen. Microbiol., 92:32. y 10 mg de AAH/
ci6n de la veloclda
7 CHALUPA, W., 1968. Problems in feeding
urea to ruminants. J. Anim. Sci., por otra parte, J(
27:207. inhibici6n del 84
AA H, con la consi
8 DAVIS, G.K. and ROBERT, H.F., 1959. Urea
toxicity in cattle. Florida Agr. Exp. Sta. Bull. estos dos trabajos
611: 1. centraciones muy
 9 HERMER, LG. and BARTLEY, E.E., 1971. inhibidor "in vitro" sobre la urease de canavilia.
Pregress in the utilization of urea as a protein SARH-UNAM' p. 124.
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161