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Centro de Ciencias Básicas.

Departamento de Química.
Academia de Química.
Lic. Químico Fármaco Biólogo.

Reporte 1
“Determinación cuantitativa de la actividad de amilasa en
líquidos biológicos.”

Materia: Bioquímica II
Profesora: María Cristina Serna Gutiérrez.
Alumnas
Flores Ibarra Joselyn Georgina.
Palos Dueñas Dulce María.
Ramos Hernández Alejandra.

Fecha: 16/Febrero/2018
RESULTADOS
Tabla de absorbancia y actividad de amilasa.
Muestra Absorbancia Actividad de amilasa

Saliva 0.034 -71.8390

Suero 0.373 902.299

Control 0.348 -
Tabla 1Tabla 1 En la tabla se muestra la absorbancia obtenida en cada mezcla de la muestra, así
como los resultados de una solución control; a su vez se muestran los valores de actividad de amilasa
que contenía cada muestra. En la sección de anexos se muestra la justificación de los valores de la
actividad de la amilasa.

ANEXOS
Cálculo para la obtención de la actividad de amilasa:
𝑈𝐴 𝑐−𝑑
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 ( )= ∗ 1000
𝑑𝐿 𝑐
Suero:
𝑈𝐴 0.348 − 0.373
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 ( ) = ∗ 1000 = −𝟕𝟏. 𝟖𝟑𝟗
𝑑𝐿 0.348
Saliva:
𝑈𝐴 0.348 − 0.034
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 ( ) = ∗ 1000 = 𝟗𝟎𝟐. 𝟐𝟗𝟗
𝑑𝐿 0.348

La imagen muestra ambas muestras y la solución control ya listas


para la lectura de su absorbancia con la ayuda del
espectrofotómetro.
El tubo marcado con la letra “d” es el tubo que contiene el suero,
se observa una tonalidad oscura y medianamente turbia con un
color verde.
El tubo marcado con la letra “c” contiene la solución control, la cual
solo contiene la solución lugol y agua destilada, se observa que
tiene una coloración azul-plomo con cierto grado de turbidez.
El tubo amarillo contiene la muestra de saliva, este es completamente transparente y con
una tonalidad amarilla.
Imagen 1 Soluciones
con la muestra para la
determinación de
almidón
DISCUSIONES

FLORES IBARRA JOSELYN GEORGINA


Las enzimas son proteínas de peso molecular elevado (más de 10 K daltons). Su estructura
tridimensional está determinada por la secuencia de aminoácidos que caracteriza a cada
una. En su estructura contienen un pequeño espacio llamado sitio activo, catalítico o sitio
isostérico, al que se une una región específica del sustrato, por medio de un acoplamiento
muy específico semejante al de una llave con su cerradura. Esto explica una de las
características de las enzimas: una alta especificidad por su sustrato. La actividad
enzimática puede verse afectada por cualquier factor físico o químico que altere su
estructura tridimensional. (Mathews, 2002)
La digestión es un proceso que involucra la acción catalítica de Hidrolasas, las cuales
rompen uniones covalentes y saturan las valencias libres aprovechando los componentes
de la molécula de agua (C—C + H2O  C—OH + C—H). Así, reducen los compuestos
orgánicos que recibimos en la dieta, hasta moléculas pequeñas que pueden ser absorbidas
por las células del epitelio intestinal. Un ejemplo será demostrado al efectuar la hidrólisis
del almidón por la actividad de la enzima amilasa salival (o ptialina), secretada en las
glándulas salivales, cuyo sustrato (el almidón) será convertido a maltosa, maltotriosa y alfa
dextrinas. (Donald, 2008)
La acción de la amilasa se efectúa mejor a un pH cercano a neutro. Además de la diferencia
en concentración, esta es otra de las causas por las que la amilasa pancreática es más
activa que la salival, ya que en el estómago el pH es muy ácido, pero a nivel del intestino
delgado es alcalino ligero. La determinación de la actividad enzimática de la amilasa se
basa en métodos cromogénicos que emplean substratos polisacáridos unidos
covalentemente a un cromóforo que por la acción de la enzima dan lugar a un cromóforo 4-
nitrofenol. La amilasa es una enzima de bajo peso molecular, y su pequeño tamaño le
permite atravesar con facilidad el filtro renal. A diferencia de la lipasa que es fuertemente
reabsorbida en lo túbulos renales, la amilasa aparece en cantidades importantes en la orina.
(Díaz, 1997)
La comprobación de cifras elevadas de las diferentes enzimas pancreáticas en plasma y
orina apoya fuertemente la existencia de una lesión pancreática. Este hallazgo, junto con la
clínica y los datos obtenidos mediante las técnicas de imagen, constituyen los pilares del
diagnóstico de la pancreatitis aguda. Una enzima que se dosa es la amilasa, ya que en la
práctica y en condiciones normales, sólo el páncreas y las glándulas salivales contribuyen
de forma significativa al mantenimiento de los niveles séricos de esta. No obstante, además
de originarse en el páncreas, esta enzima proviene de otros órganos, como las trompas de
Falopio, los ovarios, las glándulas salivales, el intestino, el pulmón, la próstata y el hígado.
Por esta razón, procesos inflamatorios desarrollados en estos órganos pueden provocar
elevaciones de las cifras de amilasa. (Anderson, 1995)
Se ha de aclarar que las diluciones óptimas para salivas de diferentes personas son
distintas porque las características y concentraciones de los compuestos varían de una
persona a otra. Esto mismo ocurre con el pH salival y el tiempo de referencia. Todas las
enzimas tienen un pH óptimo, en donde tienen mayor actividad, y a medida que se alejan
de ese pH (para ambos lados) disminuyen su actividad. Esto se debe a que algunos restos
aminoacídicos de las enzimas (en el caso de que sean proteínas) tienen cargas y pueden
ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la proteína como de
interaccionar con el sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de iones H+ u OH)
puede modificar las cargas de estos aminoácidos y de este modo incluso desnaturalizar a
la enzima.
PALOS DUEÑAS DULCE MARÍA
La amilasa salival es una enzima responsable de catalizar la hidrólisis inicial de polímeros
grandes de glucosa tales como almidón o glicógeno, en fracciones más pequeñas. Estos
fragmentos eventualmente son fraccionados en sus monómeros componentes por otras
enzimas digestivas en el cuerpo humano. Las unidades de glucosa son usadas
posteriormente por las células como una importante fuente de energía. (Escuela nacional
de deporte. 2016)
Al igual que la amilasa salival existe la amilasa pancreática, la cual ambas se encarga en
degradar los carbohidratos de almidón. Es normal encontrar alto contenido de esta enzima
en la saliva, pero cuando esta se presenta en sangre en cierta cantidad es señal de que
algo está mal en el páncreas, pudiendo ser señal de una pancreatitis aguda.
La amilasa es una enzima que ayuda a digerir los carbohidratos. Se produce en el páncreas
y en las glándulas salivales. Cuando el páncreas está enfermo o inflamado, se libera
amilasa en la sangre. Se puede hacer un examen para medir e nivel de enzima en la sangre.
(medlineplus.gov. 2018)
Para medir la actividad de amilasa en estas muestras se utilizó el método amiloclástico
yodométrico, el cual consiste en la formación de un complejo con el almidón y la solución
lugol, las cuales, al reaccionar se forma un color azul o púrpura, a estar presente la amilasa
esta reacciona rompiendo el almidón en sus monómeros y decolorando la solución,
volviéndola de azul a amarillo o incoloro, después se mide su absorbancia y por medio de
una solución control (ausencia de amilasa) y con la ecuación mostrada en anexos se
determina la actividad de la amilasa.
EL método utilizado se basa en la capacidad de la amilasa para desdoblar el almidón. El
producto de esta hidrolisis está compuesto básicamente por dextrina y maltosa. El almidón
remanente reacciona con el reactivo de yodo para dar un color azul que se lee
fotométricamente. (grupomexlab. 2016)
La reacción de hidrólisis del almidón, involucra la rotura de un enlace glucosidico mediante
la adición de una molécula de agua. La reacción de hidrólisis de almidón por acción de la
amilasa salival, puede ser detectada por la propiedad del almidón no hidrolizado de formar
un complejo púrpura con el yodo. Una vez se inicia la hidrolisis del almidón, el complejo se
rompe y el color púrpura cambia a café- rojizo y eventualmente desaparece para dar una
solución incolora. (Escuela nacional de deporte. 2016)
La taza de hidrólisis puede ser determinada por medición del tiempo empleado en la
reacción, monitoreando la presencia del complejo almidón-yodo, representado como el
tiempo de cambio de color de a solución púrpura a incoloro. (Escuela nacional de deporte.
2016)
Una vez dicho esto se puede decir de manera cualitativa que la muestra de saliva dio
positivo para la presencia de amilasa, y por diferencia de color del tubo de control y el tubo
con la muestra de sangre, la sangre también contenía amilasa, ya que el azul que presento
el tubo es más claro que el del control, (véase la imagen 1).
De manera cualitativa y comparando los valores teóricos con los obtenidos se puede decir
que la persona de la muestra de sangre está en rangos normales, ya que dio negativo el
resultado, mientras que el teórico es de 40 a 140 U/L según medlineplus.gov. 2018, con el
que se puede decir que no existe amilasa en ella, sin embargo, no es normal que el valor
sea negativo, este error pudo ser causado por varios motivos, ya sea de lectura, cantidades
de sustancia, contaminación de muestra, solución y/o materiales. En cuanto al valor de la
saliva es demasiado alto, pero se estima que son normales en saliva, ya que de manera
natural la saliva contiene alta cantidad de amilasa, ya que en la boca es donde ocurre la
mayor degradación del almidón, sin embargo, en cuanto valor exacto no se encontró valores
con el cual comparar.
RAMOS HERNANDEZ ALEJANDRA
La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la
degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está
formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos
de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces
a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones
C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la
amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos)
como productos, estos productos serán la glucosa y maltosa.
La acción de la a-amilasa deshidrolizando el almidón, eso es visible al momento de teñir el
almidón con el Lugol, la coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se
introduce entre las espiras de la molécula de almidón.
No es por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de
inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración
azul violeta. Más específicamente, lo que ocurre con el almidón es que es una sustancia
formada por 2 constituyentes macromoleculares lineales, llamados amilosa ( - amilosa) y
amilopectina ( - amilosa). (Stryer,2009).
“Si disolvemos yodo molecular, ión yoduro y amilosa en agua, obtenemos un
producto de intenso color azul oscuro. Parece que el yodo molecular y el ión yoduro
disueltos forman iones I3− que se quedan introducidos en el eje de la hélice de
amilosa; vista de lejos, esta estructura es de color azul oscuro”. (García, 2010).
El almidón cambia de color en contacto con yodo porque se forma un compuesto de
inclusión al introducirse moléculas de yodo dentro de la molécula de almidón. El almidón es
un polímero, es decir una macromolécula formada por varias unidades idénticas unidas
entre sí (monómeros). El almidón está formado por un gran número de moléculas de
glucosa unidas entre sí en forma lineal, formando una especie de hebra o fibra, la cual tiene
una determinada conformación espacial. Al ponerse en contacto con yodo, éste se coloca
en los espacios intermoleculares del almidón, intercalándose en su estructura, por lo que
modifica las propiedades físicas de dichas moléculas, formando un compuesto de inclusión
que se ve de color violeta o azul.
El modelo llave-cerradura de la acción enzimática, expuesto por Emil Fischer en 1890,
explica en parte la especificidad enzimática. Cada enzima se une a un único tipo de sustrato
debido a que el lugar activo y el sustrato poseen estructuras complementarias. La forma
global del sustrato y su distribución de carga le permiten entrar e interaccionar con el lugar
activo de la enzima. En este caso la amilasa tiene su sustrato correspondiente el almidón.
(McKee et al., 2014).
A 3 tubos de ensayo se les añade 1 mL de sustrato(almidón) y se llevan a baño de maría
con una temperatura constante de 37°C, se les agregaron 0.2 mL de la muestra de saliva,
suero sanguíneo, y solución control correspondientemente ;se incubaron nuevamente a
37.5°C por un periodo de 7.5 minutos, después se procedió a añadir un 1 ml del reactivo de
yodo al momento de añadir este sustrato sabemos que la reacción de hidrólisis del almidón
ha comenzado, esto debido a la afinidad de la enzima a-amilasa por el almidón. Mientras
más hidrolizado se encuentre el almidón, lo encontraremos de un color más claro y
amarillento. Si la solución se encuentra azul oscuro o café oscuro, quiere decir que la
hidrólisis es muy poca o es nula, indica también que todavía reacciona el Lugol; si por el
contrario la solución se encuentra en un color naranja o amarillo anaranjado, quiere decir
que la hidrólisis es parcial; finalmente si la solución se encuentra de color amarillo (claro, o
casi transparente), quiere decir que la hidrólisis es total.
La actividad específica de una enzima, una magnitud que se utiliza para controlar la
purificación de la enzima, se define como el número de unidades internacionales por
miligramo de proteína. (Recientemente se ha introducido una unidad nueva de medida de
la actividad enzimática denominada katal. Un katal (kat) indica la cantidad de enzima que
transforma 1 mol de sustrato por segundo. Un katal es igual a 6 x 107 UI). (McKee et al.,
2014).

CONCLUSIONES

FLORES IBARRA JOSELYN GEORGINA


Se cumplió el objetivo de la práctica ya que se pudo determinar los niveles de amilasa en
el suero sanguíneo de nuestros compañeros y en la saliva de los mismos. Además se
aprendió que la amilasa degrada el almidón, según los factores y medios en donde se da
la actividad enzimática, además de que las enzimas están en el centro de todos los
procesos bioquímicos. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de
reacciones consecutivas en las que se degradan moléculas de nutrientes, se conserva y
transforma la energía química y se fabrican las macromoléculas biológicas a partir de
precursores sencillos.
PALOS DUEÑAS DULCE MARÍA
En esta práctica se logró determinar el nivel de amilasa en la sangre y saliva por medio de
método amiloclástico yodométrico, A su vez se logró conocer en que consiste este método,
los niveles normales de esta enzima en ambos líquidos biológicos, la importancia de estos
valores y lo que conlleva los resultados de estos análisis en el área laboral y la vida
cotidiana, así como en la salud de la persona a analizar. También se conoció más sobre la
enzima, como trabaja y la importancia que tiene ésta.
RAMOS HERNANDEZ ALEJANDRA
El objetivo de la práctica se cumplió satisfactoriamente, debido a que se preparó una curva
patrón para almidón, y a partir de esta curva, se determinó la actividad de amilasa en una
solución problema proveniente de suero sanguíneo y otra solución de saliva humana.
Las enzimas son útiles en la práctica médica moderna por varias razones. Los análisis
enzimáticos proporcionan información importante con relación a la presencia y severidad
de una enfermedad. Además, las enzimas suelen proporcionar un medio de seguimiento
de la respuesta de un paciente al tratamiento. Las predisposiciones genéticas a
determinadas enfermedades pueden determinarse también mediante la medición de
actividades enzimáticas específicas. En el laboratorio clínico, las enzimas se utilizan de
dos formas. En primer lugar, la actividad de determinadas enzimas puede medirse
directamente. Por ejemplo, la medida de la actividad en sangre de la fosfatasa acida se
utiliza para diagnosticar el cáncer de próstata (un tumor del aparato urinario que se produce
en los varones). En segundo lugar varias enzimas se utilizan como reactivos. Debido a la
disponibilidad de las enzimas purificadas, la detección de determinados metabolitos es más
exacta y rentable. Por ejemplo la enzima urato oxidasa se utiliza para medir la concentración
en sangre de ácido úrico un metabolito cuya concentración habitualmente está elevada en
los pacientes con gota.
BIBLIOGRAFÍAS
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Hill.
Díaz, J. (1997). Aspectos Básicos de Bioquímica Clínica. España: Diaz de Santos.
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Argentina, 2008
Escuela nacional de deporte. (2016). Sistema Integrado de Gestión: Enzimas. Versión 2.
Proceso: Investigación – IV. Bogotá Colombia
GARCÍA, Sergio. Yodo y almidón. [En línea]. S.F. España. [Citado 15 de febrero 2017].
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grupomexlab.(2016). BIO-AMILASA reactivo liquido para la determiancion fotométrica de la
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Mathews, C.K. et al Bioquímica. 3ª. Ed. Pearson Educación, S. A. Madrid, 2002.
McKee, T., McKee, J., Araiza Martin ́ ez, M. and Hurtado Chong, A. (2014). Bioquímica.
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Stryer L. Berg J, Tymoczko J. “Bioquímica” Ed. Reverte, 7º edición, 2009.