Técnicas moleculares no dependientes

de PCR
¿Qué es la hibridación fluorescente in situ?

Definición

• Es una técnica de laboratorio que

permite detectar y localizar una
secuencia específica de ADN en un
cromosoma. La técnica se basa en
exponer los cromosomas a una
pequeña secuencia de ADN llamado
sonda que tiene una molécula
fluorescente pegada a ella.

• Es usada para detectar la presencia o

ausencia de una secuencia especifica
de ADN en el cromosoma
 ¿Cómo trabaja FISH?

La técnica de FISH utiliza fragmentos de secuencias de ADN, sonda marcada con fluorescencia, con
el fin de localizar una secuencia complementaria en el ADN de la muestra.
 ¿Cuántos tipos de sondas existen?

• Existen varios tipos de

sondas, cada una con
una función específica
según lo que se desea Cromosom
Centromero
detectar. a completo

Telomero Locus
¿Qué procedimiento se debe seguir?
• Fijación: Preserva las características igual a cuando esta vivo. La fijación, debe ser
optimizada para cada tipo de célula o tejido.
• Embebido o inclusión en parafina: Necesario si usamos tejido para endurecerlo y
poder seccionarlo.
• Seccionamiento: Se realizan secciones de tejido (7-10 µm) en un micrótomo.
• Pretratamiento del tejido: Hidrolisis de proteínas para aumentar la accesibilidad
de la sonda.
Fijación, embebido en parafina y secuenciamiento del
tejido
 Simbiosis extracelular y mixotrófica en el mejillón adipicola
pacifica: una tendencia en la evolución de la simbiosis extracelular
a la intracelular
Fuente: Fujiwara Y et al. Extracellular and Mixotrophic Symbiosis in the
Whale-Fall Mussel Adipicola pacifica: A Trend in Evolution from Extra- to
Intracellular Symbiosis
Mejillones adipicola. Se muestran imágenes
de microscopía de hibridación fluorescente in
situ (FISH) de simbiontes bacterianos en
secciones transversales de filamentos
branquiales de A. pacifica (A, B) y A. crypta
(C, D). Las hibridaciones con la sonda SymA
específica de Symbiont A marcada con Alexa
647 (que se muestra en rojo) y la sonda
SymCx específica de Symbiont C marcada con
Alexa 555 (que se muestra en verde) se
muestran en A y B.
Las hibridaciones con la sonda SymAc
específica de simbionte de A. crypta marcada
con Alexa 647 (mostrada en rosa) se
muestran en C y D. Todas las imágenes son
secciones incrustadas (4 mm de espesor) que
también se tiñeron con DAPI después de la
hibridación (mostradas en azul ). CZ: zona
ciliada, LZ: zona lateral.
Observaciones del método

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

El protocolo incluye muchos
El protocolo no permite una pasos que pueden dificultar la
comparación cuantitativa de resolución de problemas. Los
El método de
los niveles de expresión entre pasos más críticos del
hibridación in situ permite la
genes. Sin embargo, la alta protocolo son la fijación del
visualización directa del patrón
sensibilidad y resolución del tejido y la selección y
de expresión espacio-temporal
método puede revelar etiquetado de la sonda. Los
de cualquier gen de interés
gradientes de expresión génica tejidos mal infiltrados y las
con gran resolución celular,
dentro de un tejido, lo que no sondas con baja incorporación
alta sensibilidad y
es posible con la mayoría de de DIG producirán señales muy
especificidad. 
los otros métodos para débiles que podrían ser
analizar la expresión génica. difíciles de detectar por
encima del fondo. 
 Hibridación fluorescente in situ con
microautorradiografía (MAR-FISH)

MAR es una herramienta con la

cual se puede determinar la
captación in situ de radioisótopos MAR
específicos por células individuales. FISH
La actividad o
La identidad
función de
filogenética
interés de un
Este método se ha utilizado para grupo de células.
estudiar la actividad metabólica in
situ de los microorganismos en
muchos estudios ecológicos.

Este análisis mostrará qué tipos o grupos

la principal limitación es la filogenéticos absorben activamente un sustrato
incapacidad de vincular la
asimilación del sustrato con sus radiomarcado específico durante un tiempo de
identidades filogenéticas. incubación.
MAR-FISH:
Metodología
 • El biorreactor se alimenta con
sustratos radiomarcados los
cuales son utilizados por los
microorganismos.
• Se deben seleccionar
Incubación sustratos radiomarcados
adecuados o isótopos
adecuados para el grupo o
grupos microbianos objetivo.
(3H, 14C, 35S)
• Las muestras se fijan en
paraformaldehido. Después,
las muestras deben lavarse
mediante centrifugación con
tampón de lavado para
eliminar el exceso de sustrato
Fijación radioactivo y así reducir las
dificultades de interpretación
en las imágenes FISH-MAR.
• Se homogenizan las muestras
y se colocan en cubreobjetos
para realizarse el FISH.
 • Se lleva a cabo utilizando una
sonda marcada con Cy3 y/o Cy5
que muestran una intensidad de
señal más alta ya que cabe
señalar que la intensidad de la
FISH señal de las células hibridadas
tiende a reducirse después del
desarrollo de MAR.
• Una vez realizado el FISH, los
cubreobjetos se almacenan en
la oscuridad a -20 ° C.

• La emulsión previamente
fundida se vierte suavemente
en una cámara de inmersión.
• Se sumerge el cubreobjetos
Procedimiento durante 10 s en la emulsión. Se
autorradiográfi coloca sobre una superficie
metálica plana fría para una
co (MAR) rápida solidificación de la
emulsión.
• Luego, los cubreobjetos
recubiertos se almacenan a 4 °
C durante el tiempo de
exposición requerido.
 • Se recomienda
encarecidamente utilizar un
microscopio láser confocal para
adquirir imágenes FISH nítidas
y combinarlas eficazmente con
imágenes MAR.
• Se podría utilizar un
microscopio invertido Nikon
Eclipse TE300. Los conjuntos de
filtros y bulbos de mercurio de
VISUALIZACIÓN alta presión de 100 W del
microscopio se utilizan para
observaciones microscópicas
de epifluorescencia de las
células marcadas con sonda.
• El microscopio de campo
brillante se utiliza para
observar los granos de plata
(señal MAR) en el
cubreobjetos.
 MAR-FISH: Fundamento
Cuando estos cristales son
golpeados por electrones de
la fuente radiactiva, se forma
Las emulsiones nucleares son
una llamada "imagen latente"
suspensiones de cristales de
debido a la presencia de un
bromuro de plata en gelatina.
núcleo de plata metálica
dentro de los cristales
expuestos.
A través del revelado
fotográfico, esta imagen
latente se convierte en una
imagen real y, en presencia
del agente revelador, el
núcleo de plata metálica
cataliza la conversión de todo
el cristal en plata metálica.
Aplicaciones en
biotecnología ambiental
 Se demuestra la viabilidad en el estudio de
la degradación de compuestos xenobióticos
(contaminantes ambientales).

Se realizó un cocultivo de Pseudomonas

putida B2 y Sphingomonas stygia incubados
con [14C] o-nitrofenol. (sustrato
radiomarcado).

o-nitrofenol tiene importancia ambiental

debido a la contaminación generalizada de
hidrocarburos de petróleo, pesticidas,
colorantes y explosivos, de los cuales el o-
nitrofenol está catalogado como
contaminante prioritario por la Agencia de
Protección Ambiental de los Estados
Unidos.

Se demostró que MAR-FISH permite la

identificación rápida y precisa de los m.o
involucrados en la degradación de COMBINACIÓN DE MICROAUTORADIOGRAFÍA E HIBRIDACIÓN DE
contaminantes ambientales. FLUORESCENCIA IN SITU PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
DEGRADANTES DE CONTAMINANTES XENOBIÓTICOS.
Fuente: Escalante et al. Soil bacterial diversity: microbial culture-independent methods of study and biotechnological implications
Magneto- FISH
 Fundamento
• El método Magneto-FISH combina la selectividad de
la deposición de informador catalizada - hibridación
fluorescente in situ (CARD-FISH) (identificación) con
captura de perlas inmunomagnéticas (separación)
para proporcionar un análisis molecular y
metagenómico dirigido de microorganismos
coasociados en el medio ambiente.
• Desarrollado por Pernthaler et al. (2008) para
enriquecer y caracterizar asociaciones de microbios
de múltiples especies en el medio ambiente.
 Aplicaciones
• “Caracterización de asociaciones microbianas con
arqueas metanotróficas y bacterias reductoras de
sulfato mediante comparación estadística de
enriquecimientos anidados de Magneto-FISH”
• Condujo al descubrimiento de nuevos grupos bacterianos asociados con arqueas
anaeróbicas oxidantes de metano (ANME-2) en filtraciones de metano, y también
proporcionó información sobre su potencial fisiológico mediante la metagenómica.
• Se desarrolló específicamente para estudiar las asociaciones entre
especies entre arqueas anaeróbicas oxidantes de metano (ANME) y
Deltaproteobacterias reductoras de sulfato (SRB) en sedimentos marinos
anóxicos provenientes de sedimentos de filtración de metano de la
cuenca del río Eel.
• Aumentó el porcentaje de ANME-2c recuperado del 26% en los
sedimentos originales a 92 % de la diversidad de arqueas capturadas por
Magneto FISH.
• El desarrollo futuro y la aplicación de sondas FISH más específicas
ayudarán a desarrollar más hipótesis y probar estas asociaciones en las
filtraciones de metano de Hydrate Ridge.
• “Enriquecimiento inmunomagnético de células
completas de consorcios microbianos ambientales
utilizando Magneto-FISH dirigido a ARNr.”

• Magneto-FISH proporciona un método para atacar asociaciones

microbianas a partir de muestras ambientales para análisis metagenómicos
y otros análisis moleculares con alta especificidad. Es adaptable a una
variedad de poblaciones objetivo a partir de la amplia gama de sondas FISH
ya examinadas o desarrollando otras nuevas.
• Se demostró que el método Magneto-FISH concentra con éxito la población
de interés y ayuda en el desarrollo de hipótesis de asociación microbiana
que podrían respaldarse aún más con metagenómica, microscopía y
técnicas de marcado de isótopos.
GENEFISH secuenciar fragmentos genómicos que no llevan un marcador
directo de identidad celular, como los genes de ARNr

hibridación in situ de fluorescencia detección de genes in situ

Preparación de las sondas

Preparar 2 sondas por método indirecto:
1-sonda polinucleotídica marcada con una molécula como la digoxigenina que necesita de
inmuocotoquimica para ser detectada.
(dTTP) se reemplaza con (dig-UTP)

Uridina conjugada La síntesis de la sonda y el marcaje del

con digoxigenina informador se realizan mediante la
incorporación de nucleótidos
modificados en la síntesis de ADN

2-sondas de oligonucleótidos marcadas con peroxidasa de rábano picante (HRP)

 Preparación de la muestra
Esto incluye
1) la selección de fijadores
2) soportes sólidos para la inmovilización celular
condiciones óptimas para la permeabilización

La preservación de la integridad celular mientras se permeabiliza la

PROPOSITO membrana para facilitar la penetración de la sonda modificada en
la célula

Hibridación de la sonda dos hibridaciones consecutivas 32 h

HRP cataliza las tiramidas

primera para la identificación celular :las sondas de oligonucleótidos
marcados (HRP) dirigidos al ARNr 16S hibridan con ARN ribosomales

Después de una etapa de lavado, se retiran las sondas no

hibridadas

células unidas a
amplificación CARD tyramidas marcadas
con fluorescencia
las muestras se incuben con peróxido de hidrógeno y tiramidas
marcadas con fluorescencia.
sondas de oligonucleótidos marcadas con peroxidasa de rá
picante (HRP)

Desactivación de la señal
 la segunda hibridación para la detección de
genes
sonda polinucleotídica marcada con digoxigenina

Incubación

alta temperatura (85 ºC) durante una hora y luego se

enfrían inmediatamente a entre 20-30

incuban en tampones

unión de anticuerpos anti-DIG conjugados con HRP

Amplificación por CARD (para la detección del gen )

contratiñen con el colorante de ADN 4 ', 6-diamidino-2-

fenilindol, DAPI

Las señales de GeneFISH se detectan mediante

microscopía de epi-fluorescencia sensible
Referencias bibliográficas
1. Fujiwara Y, Kawato M, Noda C, Kinoshita G, Yamanaka T, et al. Extracellular and
Mixotrophic Symbiosis in the Whale-Fall Mussel Adipicola pacifica: A Trend in
Evolution from Extra- to Intracellular Symbiosis. PLoS ONE. 5(7): e11808. 2010.
2. Escalante E. Gosset G. Martinez A. Bolivar F. Soil bacterial diversity: microbial
culture-independent methods of study and biotechnological implications.
Agrociencia 38: 583-592. 2004.
3. Lavaut K. Hernandez N. Ruiz V. Fluorescence in situ hybridization: diagnostic tool
for hematological malignancies Revista Cubana de Hematología, Inmunol y
Hemoter. 2016;32(1):99-109. Disponible en:
http://scielo.sld.cu/pdf/hih/v32n1/hih09116.pdf
4. Javelle M. Marco C. Timmermans M. In Situ Hybridization for the Precise
Localization of Transcripts in Plants. J Vis Exp. 2011; (57): 3328. Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3308598/
1. Jiménez G, Dolores M. Hibridacion in situ. Serie: MOOC Biología Molecular Data:
2017.
2. Okabe S, Kindaichi T, Ito T. MAR-FISH—An Ecophysiological Approach to Link
Phylogenetic Affiliation and In Situ Metabolic Activity of Microorganisms at a Single-
Cell Resolution. Microbes Environ. 2004; 19(2): 83-98.
3. Makkar H, McSweeney C. Methods in Gut Microbial Ecology for Ruminants. 1ra ed.
Vienna: International Atomic Energy Agency; 2005.
4. Alonso C. Tips and tricks for high quality MAR-FISH preparations: Focus on
bacterioplankton analysis. Systematic and Applied Microbiology. 2012; 35(1): 503-
512.
5. Yang Y, Zarda A, Zeyer J. Combination of microautoradiography and fluorescence in
situ hybridization for identification of microorganisms degrading xenobiotic
contaminants. Environmental Toxicology and Chemistry. 2003; 22(12): 2840-2844.
6. Trembath E, Case D, Orphan V. Characterization of microbial associations with
methanotrophic archaea and sulfate-reducing bacteria through statistical comparison
of nested Magneto-FISH enrichments. PeerJ. 2016 Apr 18;4:e1913. doi:
10.7717/peerj.1913. PMID: 27114874; PMCID: PMC4841229.
7. Trembath E, Green A ,Orphan V. Whole Cell Immunomagnetic Enrichment of
Environmental Microbial Consortia Using rRNA-Targeted Magneto-FISH. Methods
Enzymol.2013;531:21-44.