TEMA 4: REPLICACIÓN O METABOLISMO DEL ADN.

La replicación del material genético es una etapa del ciclo de vida de una célula.
El ADN es la única molécula que tiene un mecanismo de reparación. El proceso de
replicación es semiconservativo.

REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA.
El modelo de la estructura de la doble hélice propuesto por Watson y Crick, permitió
proporcionar una explicación al mecanismo de replicación del DNA. La estructura de la
doble hélice dejaba claro el hecho de que una de las cadenas de DNA servía de molde
para la síntesis de la nueva cadena. Es decir, cada una de las dos cadenas actuaría como
molde de ensamblaje de bases complementarias para formar una doble hélice idéntica a
la original. Este proceso se denomina replicación semiconservativa, por que cada una de
las hebras parentales permanece intacta (se conserva).
En este tipo de replicación, la doble hélice de cada molécula hija de DNA contiene una
cadena de molécula original y una cadena sintetizada de nuevo.
Experimento Meselson y Stahl
Para determinar que la replicación era semiconservativa, Meselson y Stahl llevaron a
cabo experimentos con la E. coli para distinguir las moléculas de DNA nuevas de las
viejas. Lo hicieron por medio de los isótopos de nitrógeno ( 14N, forma común, y 15N,
forma pesada). Hicieron proliferar E. coli en un medio de cultivo que contenía nitrógeno
pesado como única fuente. Después de muchas generaciones, todas las células de E. coli
habían incorporado el 15N en las bases de purina y pirimidina que formaban el DNA.
Tomaron una muestra de las bacterias, sometieron al resto a un medio que solo contenía
14
N y obtuvieron muestras adicionales después de unas pocas generaciones celulares. El
DNA bacteriano sintetizado después de la modificación estaba compuesto por 14N y era
relativamente ligero. Así se demostró la replicación semiconservativa, que se da en
cualquier célula, tanto procariota como eucariota.

ORIGEN DE REPLICACIÓN. REPLICACION SEMIDISCONTINUA.

Toda molécula de DNA que vaya a ser replicada tiene un origen de replicación desde
donde se inicia el proceso en ambas direcciones hasta que se termina de copiar toda la
molécula de DNA. Las moléculas circulares del DNA bacteriano tienen un único origen
de replicación, mientras que los cromosomas lineales de células eucariotas tienen varios
orígenes donde se iniciará la replicación simultáneamente. En este origen de replicación
se inicia la apertura de la doble hélice, pudiéndose observar las burbujas de replicación.
Cada burbuja de replicación tendrá dos horquillas de replicación que irán desenrollando
la hélice de DNA en direcciones opuestas (apertura bidireccional) mientras las dos
cadenas se van replicando.

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Al centrar la atención en una burbuja de replicación, se observa que una cadena parental
tendrá dirección 5’  3’, mientras que la otra será 3’  5’. Por lo tanto, las nuevas
cadenas de DNA, al ser antiparalelas, tendrán las orientaciones opuestas a las
parentales.
La síntesis de la nueva cadena de DNA seguirá siempre el mismo procedimiento: 5’
3’.
Al observar ahora una horquilla de replicación, la cadena 3’  5’ servirá de molde para
la síntesis de la nueva cadena en dirección 5’  3’; sin embargo, en la otra hebra
parental, la nueva cadena debe seguir el sentido 3’  5’. Se demostró que ésta última,
también seguía creciendo en dirección 5’  3’, solo que lo hacia en pequeños
fragmentos denominados fragmentos de Okazaki.
La cadena o hebra que crece sin interrupción se denomina cadena líder o hebra
continua, mientras que la que crece en pequeños fragmentos se denomina cadena
retardada o hebra discontinua.

Maquinaria enzimática de la replicación

La DNA – polimerasa es la enzima encargada de la síntesis de las nuevas hebras. Pero
participan muchas otras enzimas en el proceso. La helicasa rompe los puentes de
hidrógeno de la horquilla de replicación permitiendo que las hebras se separen. Las
proteínas SSB estabilizan las cadenas separadas, además de evitar que el DNA sea
hidrolizado por endonucleasas que digieren el ADN monocatenario pensando que se
trata de virus. Por otro lado la DNA girasa reduce la fuerza de torsión que se genera
cuando se desenrollan las dos cadenas del DNA (evita los superenrrollamientos
positivos, es una topoisomerasa). La primasa (generalmente es RNA – polimerasa)
sintetiza un fragmento corto de nucleótidos de RNA denominado primer o cebador, que
ejerce como lugar de unión de los nucleótidos de DNA para iniciar la síntesis. El primer
tiene gran importancia sobre todo en la hebra retardada.
Importante: ninguna DNA polimerasa sabe comenzar la replicación. Para ello es
necesario primer.

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DNA – polimerasa.
El sustrato es un desoxinucleótido trifosfato. Las DNA polimerasas sintetizan DNA en
dirección 5’  3’ al añadir nucleótidos nuevos al extremo 3’ de una cadena en
crecimiento. Catalizan la adición, paso a paso, de unidades de desoxirribonucleótidos a
una hebra de DNA.
Suelen actuar con una reacción acoplada, la pirofosfatasa, que juega con el equilibrio
químico de la replicación para mantener la polimerización.
PPi + H2O  2 Pi
Tiene gran importancia ya que sin ésta, el sentido de la reacción puede cambiar, y por
tanto, despolimerizar.
Requerimientos para una actividad polarizante:
- Hebra molde de DNA.
- Cebador (“primer”): fragmento de hebra de DNA o RNA complementario de la
hebra molde. Generalmente es RNA, ya que la RNA – polimerasa es capaz de
comenzar de cero.
DNA – polimerasa:
- DNA – polimerasa I.
- DNA – polimerasa III.
Son procesivas, es decir, hace referencia a la capacidad de la enzima para catalizar
múltiples reacciones consecutivas sin desprenderse del sustrato. La DNA – polimerasa
III es mas procesiva. La primera en ser descubierta fue la I. Las DNA – polimerasas
tienen que hacer una copia de la hebra muy exacta, comete un error cada 10 9 pares de
bases.

DNA – polimerasa III

Es mucho más rápida que la I. Lleva a cabo la mayor parte del trabajo de replicación del
DNA.
- Actividad polimerasa 5’  3’ que permite la síntesis de la nueva hebra.
- Actividad exonucleasa 3’  5’ que realiza la función de corrección durante la
lectura. Esta función es primordial para mantener la fidelidad de la nueva copia
de DNA. La DNA – polimerasa revisa el nucleótido que acaba de incorporar y,
en caso de que se haya equivocado al introducirlo, éste se quedará sin unirse a su
complementario, con lo que la propia DNA polimerasa lo retirará gracias a la
actividad exonucleasa 3’  5’. La DNA – polimerasa siempre necesita revisar el
nucleótido anterior para poder añadir el nuevo.

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DNA – polimerasa I
Tiene las dos mismas funciones que la anterior, pero además, presenta la actividad
exonucleasa 5’  3’. Esta nueva actividad exonucleasa permitirá que la propia enzima
retire el primer de RNA que la primasa ha añadido y rellene este hueco con
desoxirribonucleótidos recién sintetizados, ya que tiene también actividad polimerasa 5’
 3’ y correctora de pruebas.
Por lo tanto, parece que la principal función de la DNA – polimerasa I es la de retirar
los primers y rellenar hueco.
El proceso de síntesis de la cadena de DNA necesita, por lo tanto, la actividad de la
DNA – polimerasa III, que se encarga de sintetizar los tramos de DNA a partir del
primer, y de la DNA – polimerasa I que retira los primers de RNA añadidos por la
primasa y añade nuevos desoxirribonucleótidos.

Las bases nitrogenadas tienden a tautomerizar. Puede ser que una citosina, si esta en
tautomería, unirse a una timina y entrar bien en el centro activo de la enzima DNA –
polimerasa. Para corregir esto, es necesaria la actividad exonucleasa de la DNA –
polimerasa III.
La enzima DNA ligasa es la encargada de unir los fragmentos, mediante enlace
fosfodiéster sin la necesidad de añadir nuevos nucleótidos. Solo se encarga de ligar el
último nucleótido añadido por la DNA – polimerasa I con el primero añadido por la
DNA – polimerasa III.

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Fragmento de Klenow: es el fragmento grande resultante de la digestión de tripsina de la
DNA – polimerasa I. Este contiene las actividades polimerasa y exonucleasa 3’  5’.
En el otro fragmento, el pequeño, la actividad exonucleasa 5’  3’.
Resumiendo, la actividad exonucleasa 5´ 3’ participa quitando los fragmentos de
Okazaki, a la vez que va sintetizando DNA (corrimiento de la mella). La DNA
polimerasa no sabe rellenar, para eso está la ligasa.

La DNA - polimerasa I está formada por una única subunidad, mientras que la DNA –
polimerasa III está formada por muchas subunidades (es un complejo).
El centro activo de la polimerasa tiene cierta topología que solo permite unir las bases
adecuadas, ya que muchas no quedan encajadas en el centro activo. Reduciendo así la
probabilidad de error.

REPLICACIÓN DEL DNA.

Consta de tres procesos: iniciación, elongación y terminación.
La hebra conductora y la hebra retardada se sintetizan de forma coordinada.
Replicación del DNA en procariotas
Iniciación:
Se va a dar en unas secuencias determinadas (locus), que se denominan oriC. Este locus
contiene copias de una secuencia que corresponde al lugar donde se da la unión con la
proteína DnaA, que inicia la construcción del complejo de replicación. Se va a formar
un octámero que hará que la molécula de DNA gire. Además, este locus contiene una
disposición en serie de secuencias ricas en pares de bases A – T denominada Due. Estas
secuencias requieren de menos energía para deshibridarse.
A esta región Due se une la proteína DnaB, que es una helicasa que utiliza la hidrólisis
del ATP para desenrollar la doble hélice, formando un hexámero. Para que se una la
proteína DnaB hace falta la acción de otra proteína
denominada DnaC que gasta ATP.

DNA – polimerasa III:

- Complejo (αβε).
 Subunidad α: actividad polimerizante.
 Subunidad ε: actividad exonucleasa 3’
 5’.
 Subunidad β: procesividad.
- Complejo δ.

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Las abrazaderas forman un anillo que rodea a la doble hélice.

Es importante recordar que la hebra conductora y la retardada se sintetizan de forma

coordinada. La DNA – polimerasa II comienza la síntesis de la hebra conductora
partiendo del RNA cebador sintetizado por la primasa. La doble hélice de DNA situada
por delante de la polimerasa se ha desenrollado gracias a una helicasa. Las SSB se unen
a las hebras desenrolladas, manteniéndolas separadas. La hebra conductora se sintetiza
de forma continua por medio de la polimerasa III. Al mismo tiempo, la topoisomerasa II
introduce superenrollamientos negativos para evitar una crisis topológica.
La forma de sintetizar la hebra retardada es más compleja. El molde de la hebra
retardada se encuentra formando un bucle alrededor del nucleo de la DNA – polimerasa
III. Tras añadir cierto número de nucleótidos la enzima se disocia del molde de la hebra
retardada abriendo la abrazadera. A continuación, se forma un nuevo bucle, se introduce
en la abrazadera deslizante y la primasa vuelve a sintetizar un pequeño fragmento de
RNA cebador para iniciar la síntesis de otro fragmento de Okazaki.
La DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo
en posición 3’ del extremo de una cadena de DNA y el grupo fosfato en posición 5’ del
extremo de la otra.

Elongación:
Momento en el que todos los elementos y todas las proteínas necesarias para la
replicación están introducidas.
El cebador para la replicación del DNA es un corto fragmento de RNA sintetizado por
la primasa (DnaG), una RNA – polimerasa. En una etapa posterior de la replicación se
elimina el RNA cebador. Tenemos un único primer o cebador en la hebra que se
sintetiza de manera continua, y muchos de ellos en los fragmentos de Okazaki.
El último enlace fosfodiester no lo puede realizar la DNA – polimerasa I, por lo que se
produce la traslocación de la mella, realizado por la ligasa y gasto de ATP en eucariotas
y virus, y de NAD en procariotas.

Terminación:
La replicación de E. coli comienza en un sitio específico llamado oriC y es
bidireccional, las dos horquillas de replicación avanzan en sentidos opuestos y como la
velocidad de replicación es la misma para ambas horquillas, se encuentran en el sitio
diametralmente opuesto al origen, donde termina la replicación. Es ahí donde se
encuentran secuencias especiales denominadas Ter.
Esta fase está mediada por proteínas denominadas Tbp.

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Al tratarse de DNA circular, al final de la replicación los cromosomas quedan unidos,
por lo que será necesaria la acción de una topoisomerasa de tipo II para romperlo y
separarlos. Este tipo de cromosomas se denominan encadenados.

Replicación del DNA en eucariotas

En eucariotas, el mecanismo de replicación es similar al de las bacterias auqnue, en tres
aspectos concretos, presentan mayor grado de dificultad. Uno de ellos es el tamaño, ya
que en eucariotas se deberán de sintetizar más pares de bases. Por otro lado, el
cromosoma de la E. coli es circular, mientras que en seremos humanos son lineales.
Debido a la naturaleza de la síntesis del DNA en la hebra retardada, los cromosomas
lineales experimentan acortamiento con cada ronda de replicación, a menos que adopten
medidas para evitarlo.
Un cromosoma de una célula eucariota tiene muchos orígenes de replicación, es
multifocal. Cada origen de replicación presenta una unidad de replicación denominada
replicón.
En este caso, hay varios tipos de DNA – polimerasas que simplemente vamos a
mencionar: pol α, pol δ y pol ε.
Los extremos libres de las moléculas de DNA dan lugar a varias complicaciones. Tras
eliminar el cebador, la hebra retardada tendría un extremo 5’ incompleto. Cada ronda de
replicación acortaría aun más el cromosoma. Para ello está presente la enzima
telomerasa, que no está activa en todas las células del organismo si no en células
germinales y células madre.
Esta enzima alarga el extremo 3’ de la hebra madre para así poder sintetizar el
fragmento. Las secuencias sobrantes serán degradadas.

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