Microbiología Clínica

TEMA 7.- PROTOCOLO DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS

GRUPOS BACTERIANOS MÁS IMPORTANTES

Existen multitud de pruebas de identificación bacteriana que pueden emplearse

en el diagnóstico microbiológico.
La elección de las pruebas a realizar, así como la secuencia de las mismas
depende de factores como el origen de la muestra clínica, el tipo de infección,
el presunto género o especie a identificar, la fiabilidad de las pruebas, el coste
de las mismas…
Cada laboratorio microbiológico establece sus propios protocolos de
identificación, aunque se suelen seguir unos patrones básicos.
La primera diferenciación se consigue mediante la tinción de GRAM, con la
que observamos la morfología de las bacterias, su agrupación y su respuesta al
Gram.

A. COCOS GRAM POSITIVOS

Existen tres géneros de cocos grampositivos con especial relevancia clínica:
Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus. Todos ellos son
anaerobios facultativos. Un cuarto género que aparece con relativa frecuencia
en las determinaciones analíticas, Micrococcus, pertenece a la microbiota
normal del organismo, pero no suele provocar infecciones en el ser humano, y
casi siempre se consideran contaminantes de muestras clínicas.

1. CATALASA POSITIVOS (Staphylococcus y Micrococcus)

Para diferenciar Micrococcus de Staphylococcus se realiza la prueba de la

OXIDASA (Micrococcus + y Staphylococcus –)
• Micrococcus
Normalmente, una vez identificado el género Micrococcus se suele descartar al
considerarse un contaminante. Sin embargo, en pacientes inmunodeprimidos
puede actuar como patógeno oportunista.
Para la caracterización de Micrococcus se realiza el estudio de la oxidación de
la glucosa y el citrato.
Las tres especies más significativas son: M. varians (Gluc. +, Cit +),
M.roseus (Gluc.+, Cit –), y M.luteus (Gluc. –, confirmar con Ure+).

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• Staphylococcus
Se presentan en racimos irregulares, cadenas cortas o incluso aislados.
Entre los estafilococos que se asocian con infecciones humanas tenemos
S.aureus (la mas virulenta), S.saprophyticus, y con menor frecuencia
S.epidermidis, que pueden originar infecciones cutáneas y de mucosas
(impétigo, forunculosis, conjuntivitis…), meningitis, artritis, endocarditis,
sepsis, ITU, enterocolitis, neumonías.
En los últimos años han aparecido cepas de S. aureus con resistencia a los
antibióticos, entre ellos los SARM (S.aureus resistentes a la meticilina) que
provocan infecciones graves difíciles de tratar. Por ello es imprescindible
cuando identificamos un S.aureus la realización de un estudio de resistencia a
los antibióticos (antibiograma)
Dentro del género Staphylococcus tenemos que diferenciar S. aureus de S. no
aureus, para ello pueden utilizarse distintas pruebas como son: la Dnasa, la
coagulasa, la observación de la hemólisis o el crecimiento en manitol sal
(Chapman) o en Baird Parker.
2. CATALASA NEGATIVO (Streptococcus y Enterococcus)
La diferenciación de Enterococcus y Streptococcus se efectúa mediante la
siembra en bilis–esculina, donde los enterococos producen el ennegrecimiento
del medio al hidrolizar la esculina y dar lugar a esculetina que reacciona con
los iones férricos del medio. Para confirmar enterococos se puede sembrar en
caldo salado con 6,5 % de NaCl, donde los enterococos crecen (+) o realizar
un PYR (+).
• Streptococcus
Dan lugar a cuadros clínicos multiformes que pueden cursar como infecciones
localizadas o procesos sépticos.
Se presentan aislados, en diplos, o en cadenas. En muchos se observa cápsula.
Estreptococos alfa-hemolíticos: Realizan una hemólisis parcial que provoca
la aparición de un halo verdoso alrededor de las colonias. La principal especie
de este grupo es S. pneumoniae cuyo hábitat natural es la orofaringe. Produce
infecciones respiratorias (neumonía, sinusitis) conjuntivitis, otitis, meningitis,
sepsis.
Estreptococos beta-hemolíticos: realizan una hemolisis total, que provoca
la aparición de un halo transparente alrededor de las colonias. Dentro de esta
categoría los agrupamos según la clasificación de Lancefield (grupos A-V),
basados en la detección serológica de antígenos de su pared.

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Los grupos de mayor importancia clínica son:

o Grupo A de Lancefield. A este grupo pertenece el S.pyogenes.
Aunque en ocasiones puede encontrarse en la faringe sin producir
ningún síntoma, generalmente causa faringitis purulenta. También
puede provocar infecciones de la piel (escarlatina, piodermitis)
glomerulonefritis aguda, fiebre reumática.
o Grupo B de Lancefield. Dentro de este grupo está el S. agalactiae
que se localiza en el tubo digestivo, pero puede colonizar la vagina
produciendo vaginitis, y meningitis neonatal
Estreptococos gamma hemolíticos: La mayoría de los S. viridans (agrupa a
distintas especies) son  hemolíticos, pero solo algunas  hemolíticas se han
asociado a endocarditis y septicemia tras extracciones dentarias.
Para caracterizar a los estreptococos realizamos el siguiente procedimiento:
Valoración de la hemólisis en agar sangre: estreptococos del grupo viridans y
S. pneumoniae (hemólisis ), S. agalactiae y S.pyogenes (hemólisis )
El S. pneumoniae se confirma con la prueba de la optoquina, a la que es
sensible.
Para diferenciar S. agalactiae de S.pyogenes realizamos la prueba de la
sensibilidad a la bacitracina, un CAMP o un PYR, obteniendo los siguientes
resultados:, S. agalactiae (resistente a la bacitracina, CAMP +, PYR – ) y
S.pyogenes (sensible a la bacitracina, CAMP – , PYR + ).

• Enterococcus.
Los Enterococos causan importantes infecciones urinarias y abdominales,
bacteriemias, endocarditis, diverticulitis y meningitis.
Este género tiene una especial relevancia clínica, por su resistencia a la
mayoría de los antibióticos. En muchas ocasiones se requiere la combinación
de diferentes antibióticos que se seleccionan por estudios de sinergia.
La especificación de los enterococos se realiza mediante pruebas bioquímicas
de fermentación de azucares (manitol, sorbitol arabinosa) y aminoácidos como
la arginina. Las dos especies responsables de la mayoría de infecciones en
humanos son E. faecalis y E. faecium.

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ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN COCOS GRAM+

CATALASA

+ –
Micrococcus y
Staphylococcus Streptococcus y
Enterococcus

OXIDASA
BILIS ESCULINA

–
+ – + Streptococcus

Micrococcus Enterococcus Hemolisis

Staphylococcus
Sorbitol,Manitol
y Arginina  
S.aureus S.no aureus
S.pneumoniae Grupo
Confirmar: viridans
sensible
+ DNasa – Optoquina

+ Coagulasa –
S. pyogenes
 Hemolisis  Sensible Bacitracina
CAMP –, PYR +
Colon. negras con halo Colon. negras sin halo
Baird Parker S.agalactiae
Resistente Bacitracina
Crecimiento y
Chapman Crecimiento y manitol – CAMP+, PYR –
manitol +

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B. COCOS GRAM NEGATIVOS

Los cocos Gram negativos de mayor interés son el Genero Neisseria y la
especie Moraxella catarrahalis.
Son bacterias exigentes, de crecimiento lento. Necesitan medios enriquecidos
(agar sangre o chocolate) y tensión de CO2.
Se presentan como cocos aislados o diplococos, Moraxella se considera
pleomórfica.
Son aerobios, inmóviles, oxidasa positivos.
La distinta fermentación de azúcares se usa para diferenciación de patógenos
El género Neisseria lo componen especies comensales de la faringe como N.
sicca o N. flavescens y dos especies patógenas de gran importancia N.
meningitidis (meningococo) y N. gonorrhoeae (gonococo).
El meningococo se disemina con las microgotas de secreciones respiratorias
contaminadas de secreciones respiratorias contaminadas y puede permanecer
asintomático en la faringe o provocar meningitis, neumonía o pericarditis.
El gonococo se transmite por vía sexual y se localiza en las superficies
mucosas en el área de exposición al microorganismo (cuello uterino, región
anorrectal y uretra masculina) Produce gonorrea y oftalmia neonatal.
Las infecciones producidas por M. catarrahalis afectan al aparato respiratorio y
rara vez se diseminan.

CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LOS COCOS GRAM –

Crecimiento en
Especie Glucosa Sacarosa Maltosa DNasa
Agar nutritivo
M. catarrhalis + – – – +
N. meningitidis V + – + –
N. gonorrhoea – + – – –
Otras Neisserias
+ V – V –
comensales

C. BACILOS GRAM POSITIVOS

Existen cuatro géneros de Bacilos Gram positivos con importancia clínica:
Bacillus, Listeria, Corynebacterium y Nocardia.
Todos ellos son aerobios o anaerobios facultativos y catalasa positivos.
Es importante la observación macroscópica de las colonias.

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• Bacillus spp.
Son bacilos grandes formadoras esporas, móviles. El patógeno más destacado
es B. anthracis (inmóvil).
Las infecciones se producen por la inhalación de esporas, provoca el ántrax.
Las colonias son grandes y rugosas.
• Listeria spp.
El patógeno más importante es Listeria monocytogenes agente etiológico de la
listeriosis. En inmunodeprimidos puede causar sepsis y meningitis.
Suele presentarse aislada o en agrupaciones atípicas. Es inmóvil a 37ºC y
móvil a 22ºC. Produce  hemolisis, fermenta la glucosa y es VP y Bilis
esculina +
• Corynebacterium spp.
Es un genero bacteriano que incluye varias especies comensales de la piel y
mucosas, responsables de infecciones oportunistas en catéteres y prótesis.
La especie más importante es C. diphtheriae causante de la difteria.
Son aerobios o anaerobios facultativos, inmóviles, catalasa positivos.
• Nocardia spp.
Son bacilos filamentosos, aerobios estrictos, catalasa positivos e inmóviles.
Producen colonias pigmentadas, irregulares, aspecto micelial, de tiza o céreo.

CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE LOS BACILOS GRAM +

Especie Esporas Movilidad Oxidasa B- esculina -hemolisis

Bacillus + + No se usa No se usa V
Listeria - + - + +
Corynebacterium - - V - V
Nocardia - - - No se usa No se usa

D. BACILOS GRAM NEGATIVOS

Los bacilos Gram negativos engloban varias familias y géneros de interés
clínico.
1. Enterobacterias.

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogéneo de

bacterias gramnegativas. Reciben su nombre por la localización habitual como
saprofitos en el tubo digestivo, aunque se trata de gérmenes ubicuos,
encontrándose de forma universal en el suelo, el agua y la vegetación, así

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como formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales además

del hombre.
• Características típicas y distintivas de las enterobacterias
Son anaerobios facultativos no formadores de esporas
Producen catalasa
Son oxidasa-negativos
Fermentan la glucosa, a excepción de Plesiomonas
La mayoría son móviles (con flagelos perítricos).
El procesamiento básico incluye la realización de las pruebas IMViC, aunque en
la actualidad existen sistemas multipruebas específicos que nos permiten
identificar género y especie.

• Enterobacterias importantes desde el punto de vista clínico

KEECS PYSS
Klebsiella spp Proteus spp
Escherichia coli Yersinia spp
Enterobacter spp Shigella spp
Citrobacter spp Salmonella spp
Serratia spp

• Localizaciones de infección más frecuentes

Sistema nervioso central Escherichia
Tracto respiratorio inferior Klebsiella, Enterobacter, Escherichia
Torrente sanguíneo Escherichia, Klebsiella, Enterobacter
Tracto digestivo Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia
Tracto urinario Escherichia, Proteus, Klebsiella

• Escherichia coli
E.coli es una bacteria que forma parte de nuestra microbiota intestinal.
Es móvil, la mayoría de las cepas fermentan la lactosa y producen indol a
partir de triptófano.
Existen diferentes cepas, con distinto grado de patogenicidad, pero en el
ámbito de laboratorio es muy difícil diferenciar las variantes de Escherichia coli,
con excepción de la mayoría de cepas de E. coli enterohemorrágica O157:H7.
En la mayoría de los casos el diagnóstico a nivel de cepa no suele confirmarse
ya que requiere técnicas muy específicas (PCR, sondas de ADN, detección de
toxinas por inmunoensayos, ensayos de adhesión en cultivos celulares…)
o E. coli enterotoxígeno. Origina infecciones entéricas, es una de
las causas más frecuentes de deshidratación por diarrea en niños

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de menos de dos años y es la principal causa de la diarrea del

viajero.
En general, los síntomas tienden a ser leves, con diarrea acuosa,
aunque ocasionalmente puede cursar con fiebre, escalofríos y
vómitos.
o E. coli enteropatógeno. Son capaces de producir cuadros
diarreicos por colonización del intestino delgado, pero no invaden
la mucosa ni producen toxinas, se considera una disbacteriosis. Es
una causa importante de diarrea en neonatos en los países
subdesarrollados, causando enfermedad muy raramente en
adultos.
o E. coli enterohemorrágico. Estas cepas producen toxinas de tipo
Shiga (también denominadas verotoxinas) que consisten en
citotoxinas que inducen la muerte de la célula huésped. Pueden
cursar con diarrea sanguinolenta, colitis hemorrágica, síndrome
hemolítico urémico (SHU) y muerte. Las cepas de ECEH que
pertenecen al serotipo O157:H7, han sido responsables de grandes
brotes de infección con tasas más elevadas de complicaciones. La
ausencia frecuente de fiebre y la aparición de hematoquecia
pueden hacer que se consideren diagnósticos no infecciosos como
la enfermedad inflamatoria intestinal
Para el diagnóstico se utiliza como medio diferencial el MAC-
sorbitol, esta cepa es incapaz de hidrolizar sorbitol y produce
colonias incoloras, sorbitol-negativo y se confirma con la detección
de toxina Shiga o verotoxina sobre muestras de heces mediante
inmunoensayos enzimáticos.
El tratamiento de la infección intestinal se basa en medidas de
soporte. No se deben emplear los antibióticos porque se ha
demostrado que aumentan la producción de la toxina Shiga y, en
algunos estudios en niños se ha visto que aumenta la incidencia de
SHU.
o E. coli enteroinvasivo. Son capaces de invadir las células
especialmente de la mucosa del colon. Clínicamente se manifiestan
como un cuadro similar a la disentería bacteriana, con una
incidencia elevada de fiebre y diarrea sanguinolenta. Estos
pacientes se benefician del tratamiento antibiótico, aunque es muy
importante antes de iniciarlo haber descartado la infección por E.
coli enterohemorrágica.
o E. coli enteroagregativo. Debe su nombre a la capacidad para
agregarse en el cultivo en medio celular. Puede considerarse una

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verdadera infección emergente. Los estudios han relacionado las

cepas de E. coli enteroagregativa (ECEA) con diarrea aguda y
crónica en los países en vías de desarrollo y diarrea aguda en
países desarrollados. La confirmación diagnóstica requiere que se
realicen ensayos de adhesión en cultivos tisulares.
o E. coli patogénica extraintestinal (ECPEx). Pueden causar
infección del tracto urinario (ITU) o en otras localizaciones:
colangitis en pacientes con obstrucción de las vías biliares,
meningitis en neonatos, artritis séptica, endoftalmitis, abscesos
intraabdominales, peritonitis bacteriana espontánea, abscesos
hepáticos,bacteriemia…

• Klebsiella spp
El género Klebsiella agrupa distintas especies, siendo la principal K.
pneumoniae.
Fermentan la lactosa, la mayoría produce colonias sumamente mucoides en
placas, poseen cápsula, son inmóviles y muy resistentes a los antibióticos.
Son indol-negativas y pueden utilizar citrato como única fuente de carbono.
K. pneumoniae forma parte de la flora habitual intestinal y de la cavidad oral.
Es capaz de causar ITU y neumonía en personas por lo demás sanas, aunque
casi todas las infecciones por este microorganismo se adquieren en el hospital
u ocurren en pacientes debilitados por enfermedades subyacentes.
Klebsiella ocupa el segundo lugar en la incidencia, sólo después de E. coli,
como causa de bacteriemia por gramnegativos.

• Salmonella y Shigella spp

Existen más de 2.000 serotipos diferentes de Salmonellas que se agrupan en
seis grupos.
o Grupo A: S. paratyphi
o Grupo B: S. typhimurium y S. bredeney
o Grupo C1: S. choleraesuis, S. montevideo y S. oranienburg
o Grupo C2: S. neuport
o Grupo D: S. typhi, S. enteritidis, S. dublin y S. gallinarum
o Grupo E1: S. butantan, S. anatum y S. give

La salmonelosis puede observarse bajo cinco diferentes síndromes clínicos que

corresponden a los siguientes: portador asintomático, gastroenteritis aguda,
bacteriemia, infecciones focales (meningitis, osteomielitis o abscesos) y fiebre
tifoidea.

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Las Shigellas spp producen la llamada disentería bacilar, que es una enteritis
hemorrágica con fiebre, calambres abdominales, pujo, y gran pérdida de
líquido. La cantidad de microorganismos que se necesita para desarrollar la
enfermedad es muy pequeña (DIM. -100)
Las muestras que se reciben para la detección de éstos patógenos deben
cultivarse en un medio de enriquecimiento (Caldo selenito o caldo Rappaport
Vassiliadis), y se incuban 8 -12 h a 35 - 37ºC.
Posteriormente se pasan a un medio diferencial para Gram – como el agar
MacConkey incubándose 18-24 h a 35-37ºC, y se prosigue la investigación si
encontramos colonias transparentes o de color negro.
Otra posibilidad es sembrar directamente desde el caldo de enriquecimiento a
un medio de cultivo diferencial mediana o altamente selectivo como SS,
Hektoen, o XLD.
Las placas se siembran con técnicas de aislamiento y se incuban a 35°C por
18-24 h.
Las colonias sospechosas se inoculan por picadura y/o rayado en TSI o Kligler
y urea, considerándose salmonellas las que son: lactosa negativa con o sin
H2S, y urea negativa. Posteriormente se procede a la identificación bioquímica
completa que puede realizarse mediante métodos manuales tradicionales,
métodos miniaturizados (API20E, R/B Enteric, Enterotube-II, Minitek), o
automatizados (Biolog, Vitek, Pasco, Microscan Walkaway).
La identificación de Salmonella y Shigella debe completarse serológicamente
mediante la reacción de suspensiones de colonias sospechosas con antisueros
específicos contra los antígenos somáticos (O). Este último paso en la
identificación se realiza en el Laboratorio Nacional de Referencia. La mayoría
de las serovariedades de Salmonella aisladas en el hombre pertenecen a S.
enterica subespecie entérica.

• Enterobacter y Serratia
Son bacterias móviles que se asocian a infecciones nosocomiales. El
tratamiento antibiótico de las infecciones causadas por estas bacterias es
complicado por la frecuencia elevada de resistencia a múltiples fármacos. Han
sido asociadas con infecciones de quemaduras, de heridas, de las vías
respiratorias y del tracto urinario.

• Citrobacter
Los miembros del género Citrobacter se denominan así por su capacidad para
usar citrato como su única fuente de carbono. Se diferencian por su capacidad
para convertir el triptófano en indol, fermentar la lactosa y utilizar malonato.

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La especie más importante es C. freundii produce H2S de ahí que pueda

confundirse con Salmonella.
Producen ITU a menudo asociadas a un catéter insertado. Además, pueden
estar implicadas en infecciones intraabdominales, infecciones de tejidos
blandos y osteomielitis.

• Yersinia spp
Para el hombre los microorganismos patógenos de este género son Yersinia
pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis. Se trata de
zoonosis que habitualmente afectan a roedores, cerdos y aves, siendo el ser
humano un huésped accidental de la infección.
Y. pestis se desarrolla de forma aerobia en la mayoría de los medios de cultivo
y no fermenta la lactosa. Es el agente etiológico de la peste, enfermedad que
se considera erradicada en España.
Y. enterocolitica produce cuadros diarreicos mucupurulentos a veces con
sangre, fiebre y dolor abdominal, la mortalidad es elevada a pesar del
tratamiento antibiótico (50%).
Y. pseudotuberculosis produce adenitis mesentérica, enfermedad rara.
También se han descrito casos de eritema nodoso, que en ocasiones se han
presentado de forma epidémica25. Los pacientes con septicemia por Y.
enterocolitica deben recibir antibioterapia
Son bacilos Gram-negativos, oxidasa negativa, que no fermentan lactosa,
crecen mejor a 25°C y son móviles a esta misma temperatura y no a 37°C.
El procesamiento incluye los siguientes medios:
• Medio selectivo: agar CIN, en el cual Yersinia produce colonias rojo
oscuro con bordes transparentes.
• Agar HE: produce colonias amarillas pequeñas.

• Proteus
Estos géneros son lactosa negativos y móviles y producen
fenilalanindesaminasa.
Hay varias especies de Proteus, pero P. mirabilis y P. vulgaris representan la
inmensa mayoría de los aislados clínicos. Ambos producen ureasa rápida y
H2S, y el último es indol positivo.
Son causa de ITU, de modo ocasional en huéspedes sanos y con mucha
frecuencia en aquellos con catéteres, anomalías anatómicas o funcionales del
tracto urinario.

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Pico F G SH2 Mov Ur In RM VP Cit

Escherichia A A + - + - + + - -

Citrobacter A A + V + V - + - +

Klebsiella A A + - - V V V V +

Enterobacter A A + - + V - - + +

Serratia V A V - + V - V V V

Proteus Alc A - + + + V + V V

Salmonella Alc A - V + - - + V -

Shigella Alc A - - - - V + - -

Yersinia Alc A - - - + V + - -

2. BGN- No fermentadores
Son bacilos aerobios estrictos, patógenos oportunistas.
Los más importantes son Pseudomonas y Acinetobacter.
• P. aeruginosa
Es un patógeno oportunista muy agresivo, responsable de un alto porcentaje
de las infecciones nosocomiales. Presenta gran resistencia a los antibióticos. Es
catalasa y oxidasa positiva, móvil y el 90% de las cepas produce un pigmento
verdoso, la piocianina que difunde en Müeller Hinton.
Las colonias de Pseudomonas aeruginosa son grandes y grisáceas, con un brillo
metálico y olor agradable
• A. baumannii.
Las bacterias del género Acinetobacter son bacilos o cocobacilos gram
negativos, muchas veces dispuestos en parejas. No fermentan la glucosa y son
aerobios estrictos, inmóviles, catalasa positivos y oxidasa negativos El principal
problema que presentan es su multirresistencia.
Puede ser aislado en material hospitalario, y forma parte de la microbiota de la
piel y puede colonizar la cavidad oral, faringe e intestino, constituyendo éstos
unos reservorios epidemiológicos muy importantes en brotes nosocomiales.
Causa infecciones nosocomiales graves como sepsis, neumonía y meningitis.
Su identificación bioquímica es difícil por lo que suelen utilizarse técnicas de
biología molecular.

3. BGN exigentes
Se llaman así a los bacilos con transcendencia clínica que no son detectados en
los medios y tiempos de incubación habituales.

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Microbiología Clínica

• Haemophilus spp
Son pequeños cocobacilos Gram –, que si están en grupo, se organizan en
forma de empalizada o banda de peces Crece solamente en Agar chocolate o
en Agar sangre con estría de S. aureus, dando lugar a pequeñas colonias
satélites.
La especie más patógena para el hombre es Haemophilus influenzae que puede
dar lugar a cuadros de meningitis, artritis séptica, neumonía o bacteriemia.

• Bordetella
El género Bordetella tiene tres especies patógenas para el ser humano:
B.pertussis, B.parapertusis y B.bronchyseptica que producen afecciones
respiratorias.
Son microorganismos exigentes, por lo que su aislamiento requiere medios de
cultivo enriquecidos con ácidos grasos saturados, nicotinamida, cisteína y
factores X y V (agar de Bordet- Gengou). Actualmente este medio está siendo
sustituido por el medio con carbón de Regan – Lowe, incubando en aerobiosis
a 35ºC y en cámara húmeda.

• Helicobacter
Helicobacter pylori es un bacilo gramnegativo, curvado y microaerofílico que se
encuentra en la mucosa gástrica del estómago humano asociado a diferentes
enfermedades digestivas.
Es la principal causa de úlcera gástrica y duodenal y la infección persistente es
un factor de riesgo de carcinoma y linfoma gástrico. La mayoría de las
personas infectadas no tienen síntomas y solo un pequeño porcentaje llegan a
desarrollar la enfermedad.
Existen diferentes métodos para diagnosticar una infección de H. pylori que
pueden ser invasivos, si requieren endoscopia con toma de biopsia gástrica, o
no invasivos
Las biopsias para cultivo se recogen en un frasco estéril con suero fisiológico o
caldo tioglicolato y deben procesarse inmediatamente, antes de 2 horas,
manteniéndose refrigeradas hasta el momento.
Una vez en el laboratorio se homogeniza por trituración y agitación, y se
realizan varios procedimientos:
• Un examen histopatológico tras tinción Giemsa o con sales de plata. Se
observa un espirilo con una o dos espirales y flagelos lofótricos.
• Prueba de la ureasa con lectura cada hora. (+ ureasa rápida)
• Siembra en agar sangre y agar chocolate, incubando a 37- 42º C, en

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Microbiología Clínica

ambientes con alta humedad, y 10% de CO2. La incubación suele

prolongarse 5 -7 días. Las colonias en a. sangre son grises pequeñas y
-hemolíticas. En agar chocolate son mucosas, grises o verdosas. Son
catalasa y oxidasa +.

• Campylobacter
Produce cuadros de gastroenteritis hemorrágica, con dolor abdominal, de
cabeza y fiebre.
El aislamiento de Campylobacter se basa en la selectividad del medio, el
ambiente microaerofilico húmedo (O2 al 10%) y la temperatura de incubación
a 42°C, estos factores suprimen el crecimiento de la mayoría de bacterias
saprófitas.
En muchos laboratorios se tiene como práctica común examinar la muestra al
fresco o teñida para detectar la presencia de bacilos típicos en alas de gaviota
y los abundantes leucocitos.
La muestra debe cultivarse en alguno de los medios comerciales recomendados
como el Agar Campy o el Agar Skirrow. La adición de los agentes
antimicrobianos que llevan estos medios (anfotericina B, cefalotina, polimixina
B, trimetoprima y vancomicina) suprime el crecimiento de la flora microbiana
normal facilitando el aislamiento del Campylobacter.
Debe hacerse una revisión de las placas a las 24, 48 y hasta 72 horas
buscando las colonias sospechosas. Las colonias son pequeñas, convexas,
translúcidas, grisáceas y asemejan una gota de agua.
La identificación presuntiva de las colonias incluye una tinción de Gram
modificado con fucsina básica al 0.1% y la observación de las formas de “S” o
en alas de gaviota.
La prueba de oxidasa debe ser positiva, no utilizan los hidratos de carbono y se
puede observar al microscopio en una preparación en fresco la movilidad en
dardo.
Las principales pruebas bioquímicas de diferenciación de especies son:
catalasa, hipurato, H2S en TSI y susceptibilidad a antibióticos (ácido nalidíxico
y cefalotina).

• Legionella
De las más de 30 especies de Legionella que se conocen, Legionella
pneumophila serogrupo 1 es responsable de la mayoría de las infecciones en
humanos
La legionelosis puede tener dos presentaciones clínicas diferentes, la
enfermedad del legionario y la Fiebre de Pontiac. En la primera, la enfermedad
se manifiesta como una neumonía, aunque el espectro clínico puede variar

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Microbiología Clínica

desde una enfermedad leve hasta una enfermedad grave con fallo
multiorgánico. La Fiebre de Pontiac da lugar a un cuadro clínico similar al de la
gripe.
El cultivo en placas BCYE se considera la técnica de referencia para el
diagnóstico de las infecciones por Legionella en el laboratorio. Sin embargo, la
legionella es una bacteria de crecimiento fastidioso que requiere medios
selectivos y períodos de incubación prolongados, por lo que muchas veces se
opta para el diagnóstico por la inmunofluorescencia directa y la detección de
antígeno en orina

• Brucella
Produce la brucelosis o Fiebre de Malta que es una zoonosis que se transmite
entre afecta al ganado vacuno (B. abortus), cabras y ovejas (B. melitensis),
perros (B. canis) y cerdos (B. suis)
Se trasmite al ser humano mediante el consumo de productos lácteos no
pasteurizados, contacto directo con órganos de animales infectados y mediante
la inhalación de aerosoles infectados.
La brucelosis se presenta en forma aguda en un 50% de los casos (con
síntomas leves parecidos a los de la gripe y fiebre recurrente) aunque también
puede dar formas crónicas y persistir durante años.
Puede afectar a cualquier órgano o sistema y producir una clínica
enormemente variada.
El diagnóstico se basa tanto en pruebas de laboratorio como en una evaluación
clínica basada en los síntomas del paciente, sin embargo, dada la gran
variedad de manifestaciones clínicas que presenta la enfermedad, su
diagnóstico resulta difícil
El aislamiento de Brucella spp. constituye el método diagnóstico definitivo.
Suele obtenerse por hemocultivo o cultivo de médula ósea y, más raramente,
por cultivo de líquido cefalorraquídeo, líquido articular, exudado purulento, etc.
Su dificultad en el cultivo, su escasa producción de CO2, lento crecimiento y
baja actividad metabólica le han convertido en el microorganismo elegido para
evaluar la sensibilidad de los sistemas automáticos de hemocultivo (VITAL,
BACTEC, BACT/ALERT resultando ser el sistema BACTEC el más eficaz, capaz
de detectar la presencia del microorganismo tras 3 a 5 días de incubación.
Brucella spp presenta unas características tintoriales especiales: aunque no es
una bacteria ácido-alcohol resistente, no sufre decoloración con ácidos débiles.
Así mismo, también la tinción de Gram es peculiar, presenta una decoloración
irregular, pudiendo observarse en la misma muestra la coexistencia de
pequeños cocobacilos gramnegativos y grampositivos

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Microbiología Clínica

Tras la tinción de Gram si se sospecha de brucelosis se realizará la reacción de

la oxidasa (positiva) y aglutinación con suero específico frente a Brucella.

Otros bacilos Gram negativos.

• Vibrio
Los Vibrios son bacterias acuáticas, bacilares, con forma curvada y con un
flagelo polar. Aerobios, Gram negativos, y oxidasa +. Pueden crecer a pH muy
altos (8,5 -9) y no resisen el pH ácido.
Las muestras sospechosas por Vibrio cholerae se cultivan en agar TCBS y agar
sangre, los cuales se incuban a 35°C por 24 horas. Puede realizarse un
enriquecimiento previo en agua de peptona alcalina.
Las colonias sospechosas son aquellas que presentan una coloración amarilla o
verdosa en el agar TCBS y una hemólisis beta en el agar sangre
A las colonias sospechosas se les practica:
o Examen en fresco para observar el movimiento en dardo.
o Tinción de Gram, distinguiendo los bacilos característicos en forma de
coma.
o Prueba de oxidasa que debe ser positiva.
o Prueba de hilo mucoide: Se suspenden colonias en una gota de
solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Si el resultado es
positivo, las células bacterianas se lisan por efecto del desoxicolato, y
el ADN liberado ocasiona que la mezcla se haga viscosa. Al retirar
lentamente el asa de la suspensión, se forma un “hilo” mucoide.
La identificación serológica es uno de los métodos más rápidos y específicos
para la identificación de Vibrio cholera.
Se utiliza también la identificación de toxinas (prueba de Kanagawa)

• Aeromonas y Plesiomonas
Aeromonas spp son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, que
causan una diarrea acuosa que se ha asociado con ingestión de agua no
potable o mariscos crudos.

Las muestras se cultivan en:

• Agar sangre con 10 xg de ampicilina /ml(AS-AMP).
• MAC o EMB
Las placas se incuban a 35°C por 24 horas en aerobiosis. Son oxidasa y
catalasa positiva. En el medio MAC o EMB se obtienen colonias lactosa
negativa.
Fermenta la glucosa sin formación de gas y reduce los nitratos.

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Microbiología Clínica

E. OTRAS BACTERIAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA

• Micobacterias
Las micobacterias, especialmente las especies del complejo tuberculosis, son
responsables de numerosas infecciones en humanos
Para el control de la TB es necesario el diagnóstico precoz de los casos a fin de
interrumpir la cadena de transmisión. Los métodos microbiológicos
tradicionales no son eficientes, dada su lentitud. En los últimos 20 años se han
desarrollado nuevos métodos de aislamiento, identificación, estudios de
sensibilidad y tipificación, tanto para Mycobacterium tuberculosis como para el
resto de las micobacterias. Además, aunque con menor importancia en el
ámbito de la salud pública que M. tuberculosis, la frecuencia de aislamiento de
micobacterias no tuberculosas (MNT) va aumentando y, al mismo tiempo, se
van describiendo nuevas especies susceptibles de producir patología en
humanos.
La manipulación de las muestras se realiza con estrictas medidas de seguridad
para evitar el contagio, en recinto cerrado, con campana de flujo y mascarilla.
El procesamiento debe de ser rápido.
Examen microscópico: Tinción de Ziehl – Neelsen o de auramina
(fluorescencia)
Cultivo: Se procede en primer lugar al proceso denominado
descontaminación para destruir la flora saprofita y concentrar los posibles
bacilos tuberculosos. (método del laurilsulfato y método ácido).
Cultivo en medio Lowenstein – Jensen, siembra por goteo, e incubación a
35ºC sin invertir y con la tapa floja. Son colonias de crecimiento lento (10 -
30 días), de color crema o amarillo, secas y rugosas.
Identificación: Nueva tinción Z-N, CAT – , NIT+ y test de la niacina)
En el caso de que se solicite específicamente o se trate de una muestra con
examen directo positivo, se realizará una prueba de amplificación y detección
de ácidos nucleicos en la muestra clínica

• Rickettssias
El género Rickettsia está constituido por especies de pequeños cocobacilos
Gram negativos pleomórficos, inmóviles y aerobios, que se comportan como
patógenos intracelulares obligados y están relacionados serológicamente. Se
tiñen bien con Giemsa, y débilmente con la tinción de Gram.

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Microbiología Clínica

Las rickettsiosis constituyen un grupo de enfermedades zoonóticas de

distribución geográfica heterogénea cuya severidad varía desde formas
benignas y a infecciones fulminantes de elevada mortalidad. La mayoría de los
casos se adquieren por picadura de garrapatas, piojos o pulgas que están
infectadas por el microorganismo
Entre las enfermedades más importantes producidas por Rickettssias tenemos
las fiebres manchadas (fiebre botonosa, fiebre de las Montañas Rocosas…) y
las fiebres tíficas (tifus exantemático epidémico y tifus murino endémico)
El tipo de procesamiento y los medios utilizados dependen de las
características de cada muestra.
El diagnóstico definitivo de las rickettsiosis requiere el aislamiento e
identificación de la especie a partir del cultivo, lo que supone con frecuencia,
varios días o semanas de espera.
El cultivo de lleva a cabo en células Vero E6 o fibroblastos L92. El efecto
citopático producido no es muy característico ni específico de especie y,
aunque puede aparecer a las 24-48 h post- inoculación, generalmente se
necesitan 5-7 días para su desarrollo.
Después de 5-7 días de incubación se procede a detectar la presencia de la bacteria
mediante tinción de Giménez, IFI con anticuerpos específicos o PCR.

• Clamidias
Constituyen junto con los micoplasmas, las especies bacterianas con los
genomas más pequeños. Son bacterias intracelulares obligadas que carecen de
ciertas rutas metabólicas como la biosíntesis de aminoácidos o la fermentación
anaeróbica
Las especies patógenas para el hombre son Chlamydia trachomatis, Chlamydia
pneumoniae y Chlamydia psittaci.
C. trachomatis se transmite fundamentalmente por contacto sexual o por
fómites y puede originar tres cuadros distintos según el serotipo tracoma
(conjuntivitis crónica que puede derivar en ceguera) linfogranuloma
venéreo-LGV (infección de transmisión sexual que invade los tejidos linfoides
y se caracteriza por uretritis y cervitis) y enfermedad óculo-genital no
invasiva (normalmente asintomática en mujeres pero que en un 20% de los
casos puede evolucionar hacia enfermedad inflamatoria pélvica, embarazos
ectópicos e infertilidad, si el bebé se infecta en el canal del parto, produciría
conjuntivitis como en el primer caso)
C. pneumoniae y C. psittaci se transmiten por aerosoles y se ha asociado con
patologías respiratorias
La detección e identificación precisa de estas bacterias no es fácil de realizar,
debido a la necesidad de disponer de instalaciones de bioseguridad para su

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Microbiología Clínica

aislamiento mediante cultivo celular, a los problemas relacionados con las

reacciones cruzadas de las pruebas serológicas disponibles, y al hecho de ser
muchas veces responsables de patologías de evolución lenta e inespecífica.
La disponibilidad de pruebas de amplificación de ácidos nucleicos altamente
específicas, sensibles y de fácil implantación, ha incrementado sensiblemente
el potencial diagnóstico de estas bacterias en los laboratorios de Microbiología.
Las técnicas de diagnóstico más utilizadas son el aislamiento en cultivos en
líneas celulares (HeLa 229 y McCoy) y las técnicas inmunológicas. Aunque cada
vez adquiere mayor importancia las PAAN por su mayor sensibilidad.

• Micoplasmas
Las bacterias del género Mycoplasma representan un grupo de
microorganismos complejos, que carecen de pared celular y tienen el tamaño
más pequeño conocido en un microorganismo de vida libre.
La carencia de pared celular explica algunas propiedades que les son únicas,
tales como la sensibilidad al choque osmótico y a los detergentes, su
resistencia a los antibióticos β-lactámicos y la gran plasticidad de la célula que
da lugar a la formación de las típicas colonias en forma de “huevo frito” por
penetración del microorganismo dentro de las trabéculas del agar.
Los micoplasmas, presentan morfologías variables: esféricas, filamentosas, en
forma de pera, y algunas especies patógenas poseen una estructura terminal u
“orgánulo para la adherencia”.
Los micoplasmas forman parte de la microbiota del hombre y en prime paso
pueden adherirse a los epitelios de los tractos respiratorio y urogenital.
Además, algunas especies (patógenas) son capaces de penetrar en las células
y producir infecciones. Esta localización intracelular protege a los micoplasmas
frente a los efectos del sistema inmunitario del hospedador y de los
antibióticos, contribuyendo a su difícil erradicación y al establecimiento de
infecciones latentes o crónicas.
Suelen producir infecciones respiratorias y genitourinarias, aunque en
ocasiones pueden darse complicaciones cuando los Mycoplasmas alcanzan el
SNC.

• Bacterias anaerobias

Estos microorganismos no pueden desarrollarse en presencia de oxígeno.

El hábitat de las bacterias anaerobias está limitado a zonas corporales del hombre y
de los animales donde la tensión de oxígeno es baja. Forman parte de la microbiota
normal como comensales, jugando un importante papel en la resistencia inespecífica a
la infección. Son particularmente frecuentes en la boca (especialmente en la placa

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Microbiología Clínica

dental) y en las vías respiratorias altas, vagina e intestino (en especial en colon y
recto) y en las heces, donde superan a los aerobios y a los microorganismos
facultativos. A partir de aquí pueden contaminar de forma pasajera la piel, sobre todo
la del periné. La piel es pobre en anaerobios permanentes, el más significativo es
Propionibacterium acnes que se localiza en las glándulas sebáceas. Cuando son
eliminados al medio ambiente mueren, con la excepción de los clostridios que
sobreviven gracias a la formación de esporas.
Es especialmente importante la correcta toma de muestras, transporte, recepción y
manipulación de las mismas.
En general las muestras de preferencia para anaerobios se obtienen por biopsia de
tejidos o por aspiración con aguja y jeringa. Una vez recogida debe ser transportada
mediante sistemas de transporte para anaerobios.
Al recibir la muestra en el laboratorio debe ser examinada en busca de algunas
características que sugieren la presencia de anaerobios, como: olor fétido (productos
finales del metabolismo de bacterias anaerobias), fluorescencia bajo luz ultravioleta
(producción de protoporfirina por las especies pigmentadas de Prevotella y
Porphyromonas), exudados de color negruzco (presencia de bacilos gramnegativos
pigmentados), existencia de tejidos necróticos, gas en los tejidos, existencia de
gránulos de "azufre" en el exudado (presencia de Actinomyces spp. y
Propionibacterium propionicus), exudados purulentos, etc
El procesamiento inicial de las muestras incluye su preparación, examen directo e
inoculación en los medios de cultivo apropiados.
La muestra se procesa con las máximas precauciones y lo antes posible, siendo
aconsejable que no transcurran más de 15 minutos desde su recepción. Si es posible,
la preparación se deber· hacer en una cámara de anaerobiosis para minimizar su
oxigenación. El material purulento se mezcla bien con la ayuda del agitador Vortex.
Las muestras de tejido o de biopsia se homogeneizan, ya sea con bisturí, o en
mortero estéril añadiendo 1 mililitro de caldo.
Cuando se investiga la presencia de Clostridium se puede realizar un enriquecimiento,
que consiste en eliminar todas las formas vegetativas y conservar las esporas
tratando la muestra con calor o alcohol
Una vez homogeneizada con la ayuda de una pipeta Pasteur se deposita una gota, si
la muestra es purulenta, o 2- 3 gotas, si no lo es, en cada uno de los medios de
cultivo utilizados, una gota en un portaobjetos para la tinción de Gram y el resto en
un medio líquido de enriquecimiento (caldo tioglicolato).
Una característica general de los microorganismos anaerobios es que son Gram
inestables al examen directo. Por ello deben realizarse modificaciones a la técnica de
la tinción de Gram (efectuar la decoloración solamente con alcohol etílico
prescindiendo de la acetona y prolongar el tiempo de contacto con lugol).
La mayoría de las bacterias anaerobias requieren para su crecimiento vitamina
K1 y hemina. Es aconsejable utilizar una combinación de medios enriquecidos
no selectivos, selectivos y diferenciales.

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Microbiología Clínica

Los medios de cultivo primarios para la siembra de una muestra de anaerobios son
varios, pero en general incluyen un medio no selectivo como el agar sangre para
anaerobios (Schaelder) y algún medio selectivo (BBE, PEA, EYA, CCFA…). Además se
inoculan e incuban en aerobiosis otra placa de agar sangre, una de agar chocolate y
una de agar MacConkey, ya que la mayoría de las infecciones por anaerobios son
polimicrobianas e incluyen bacterias aerobias y facultativas.
Las placas inoculadas deben ser inmediatamente incubadas en condiciones anaerobias
a 37 ºC durante 48 horas, al cabo de las cuales si no hay desarrollo deben ser
incubadas al menos 5 días antes de ser descartadas.
Los sistemas de incubación en anaerobiosis más utilizados son las cámaras, jarras o
bolsas de anaerobiosis. Con independencia del sistema utilizado es importante
monitorizar el ambiente anaerobio con una tira indicadora de azul de metileno y la
temperatura de incubación. Existen diferentes modelos de cámaras para anaerobios,
en las que se consigue una atmosfera anaerobia mediante una mezcla de gases que
contiene 5% de H2, 5-10% de CO2 y 85-90% de N2.
Todas los morfotipos coloniales de la placa de agar sangre incubada en anaerobiosis
deben ser examinados con una tinción de Gram y subcultivados para estudios de
aerotolerancia.
La identificación completa de los anaerobios es bastante costosa, frecuentemente
requiere varios test bioquímicos, cromatografía gas-líquido de los productos
metabólicos derivados de la fermentación de la glucosa, y cromatografía de ácidos
grasos de cadena larga. Es por esto que en general la identificación completa o
confirmatoria queda reservada a laboratorios de referencia.

La mayoría de los laboratorios clínicos deben conformarse con una identificación

presuntiva y la prescripción una terapia antimicrobiana adecuada.
Un diagnóstico presuntivo de los anaerobios se obtiene de la combinación de las
siguientes características:
• origen de la muestra
• morfología microscópica
• reacción al Gram
• morfología colonial
• prueba de aerotolerancia.

Ya que algunas especies de anaerobios retienen el colorante con mucha

variabilidad, el resultado de la tinción de Gram puede ser dudoso. En estos
casos, y cuando las características coloniales no ayuden a resolver esta duda,
es recomendable realizar un subcultivo en un medio no selectivo con un disco
de 5µg de vancomicina para diferenciar los grampositivos (sensibles) de los
gramnegativos (resistentes).

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 Microbiología Clínica

Principales bacterias anaerobias de interés clínico

Tipo de Género
Esporas Patología
bacteria Caracteristicas
C.botulinum.- Botulismo
Clostridium C.difficile.- diarreas, colitis
Discriminación por pseudomembranosa, toxiinfecciones
SI ureasa, lipasa, indol y aalimentarias
productos finales del C. perfringes.- gangrena, colitis
metabolismo necrotizante …
C.tetani.- tetanos

Bacilos Actinomyces
Gram + Identificación difícil
Actinomicosis
Capnófilo, granos de
azufre
Propionibacterium
NO Inmóviles, catalasa +
Acné
PFM.-Ac. propiónico

Mobilincus
Vaginosis bacteriana
Gram, Morfología y
(Disbacteriosis)
sensibilidad ab
Peptostreptococcus
Abscesos, infecciones ginecológicas,
Cocos Gram + NO Gram, Morfología y
sinusitis
sensibilidad ab
Bacteroides
Catalasa, Bilis
Peritonitis, infecciones genitales y
NO esculina y
sepsis.
sensibilidad a los ab

Porphyromonas
Bacilos Patógenos importantes en boca,
Pigmentación
Gram – NO cabeza, cuello e infecciones
Hemólisis
pleuropulmonares

Fusobacterium
Angina de Vincent, infeciones
Morfologia
NO orales, pulmonares, líquido
Hemolisis
amniotico

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