Cultivo Continuo

El cultivo continuo es una forma de cultivar células en un sistema abierto, donde la población
microbiana se mantiene en un estado continuo de crecimiento balanceado, al eliminar de
manera continua algo del cultivo y reemplazarlo con medio nuevo a la misma rapidez.

Hay dos tipos de sistemas de cultivo continuo: 1) el Quimiostato, que es operado mediante
el suministro de un nutriente esencial, limitante del crecimiento, a una rapidez constante,
con el resultado de que la densidad y rapidez de crecimiento del cultivo se ajustan por sí
mismas al crecimiento; y 2) el cultivo de flujo tapón, el cultivo viaja sin mezclarse a través
de un tubo o canal.

Un quimiostato consiste en un tanque agitado con una suspensión de biomasa

perfectamente mezclada y homogénea, a la que se alimenta con medio fresco a una rapidez
constante; el caldo de fermentación es extraído con la misma rapidez de modo que el
volumen permanece constante.

El sistema de flujo tapón simula un cultivo por lote y no ofrece ventajas de control ambiental
diferentes a las aplicadas a este tipo de cultivo. La teoría del cultivo continuo indica que es
posible fijar la rapidez específica de crecimiento entre cero y un valor máximo. Con esto se
supera la condición que prevalece en los cultivos por lote de que la única rapidez específica
de crecimiento que puede mantenerse constante es la rapidez máxima.

Las velocidades específicas dependen de la concentración del sustrato según la relación

de Monod.

Además de controlar el flujo del medio que sale y entra al reactor, también se controlan
otros parámetros importantes del medio, como son la temperatura, el pH y la tensión de
oxígeno disuelto.

1.4.1. Teoría del quimiostato INDICE

El quimiostato es un cultivo en el que se introduce

continuamente medio fresco a una rapidez contante; el
volumen del cultivo se mantiene constante por extracción,
también uniforme de este cultivo y a la misma rapidez a la que
se introduce.
Idealmente, el mezclado es perfecto, es decir, que cuando una gota del medio entre al
reactor, instantáneamente queda uniformemente distribuida en el cultivo. Esto significa en
la práctica que el tiempo requerido para mezclar un pequeño volumen del medio con el
cultivo será también pequeño comparado con el tiempo de residencia, tr, dado por V/F,
donde V es el volumen y F la rapidez de flujo volumétrico del medio.

En un quimiostato, la rapidez de crecimiento se determina por la rapidez de suministro de

un nutrimento esencial que puede ser carbono, nitrógeno, fósforo o un elemento traza o
vitamina, la cual se le denomina sustrato limitante Los demás nutrientes esenciales están
presentes en exceso. La capacidad para modificar la rapidez de crecimiento al cambiar la
rapidez de suministro de nutriente nuevo, es la ventaja principal del cultivo continuo sobre
el cultivo intermitente y explica la propiedad autorregulatoria del quimiostato. Al mantener
constante la rapidez de suministro de nutrientes, el cultivo se puede mantener en un estado
estacionario de crecimiento indefinidamente.

Considere un cultivo en el cual el crecimiento de biomasa está limitado por la concentración

de un solo sustrato (el sustrato limitante), mientras que todos los demás están en exceso.
Si se deja que el cultivo prosiga en operación por lote sin adición de medio fresco, y después
iniciamos el flujo de medio (entrada y salida) y empezamos a medir la concentración de
biomasa a la salida, vemos que pasado un tiempo (usualmente tres tiempos de residencia),
la concentración celular y la del sustrato limitante se hacen constantes. Este estado
estacionario es autorregulable: un incremento en el flujo nutrientes hacia el fermentador,
ocasiona un incremento de sustrato y por lo tanto un incremento en la rapidez de
crecimiento y aumento en la concentración de biomasa en el medio; esto a su vez genera
una disminución en la concentración sustrato, con la consecuente disminución de la rapidez
de crecimiento y por ende reducción de la concentración de biomasa, por lo que se da un
aumento en la concentración de sustrato, lo que a su vez causa un incremento en la rapidez
específica de crecimiento y así hasta que se alcanza un nuevo estado estable(17).

Relación entre la rapidez de dilución y la concentración celular

La capacidad autorregulatoria de un quimiostato y el crecimiento en estado estacionario se
puede expresar mediante una serie de ecuaciones que relacionan las concentraciones del
nutriente limitante y de células con la variable primaria independiente de operación, la
rapidez de suministro del medio. Esto se hace al elaborar balances de materia para las
células y el sustrato limitante en el biorreactor.

Así para las células:

dX FX 0 FX
= − + X − X (33)
dt V V

en donde

F = rapidez de flujo de suministro del medio (L/h);

V = volumen de trabajo constante del reactor (L);
X0= concentración de células en el medio de suministrado (g/l);
X = concentración de células en el reactor (g/l);
 = rapidez específica de crecimiento (h-1);
 = rapidez específica de mortandad (h-1).

Con un quimiostato simple, el suministro de medio, por lo general, es estéril y la rapidez de

muerte puede considerarse despreciable (17). En consecuencia, la ecuación anterior se
puede simplificar a:
 dX FX
=− + X (34)
dt V

El término F/V se denomina rapidez de dilución, D, que es el número de volúmenes de

medio que pasan a través del reactor por unidad de tiempo.

Por lo tanto, la ecuación se puede escribir como:

dX
= − DX + X = (  − D) X (35)
dt

Durante el crecimiento en régimen permanente o estado estacionario, dX/dt = 0.

( − D) X = 0

Por lo tanto

=D

Si el microorganismo en crecimiento en el quimiostato responde a una cinética de Monod,

𝑆
𝜇 = 𝜇𝑘
𝑆 + 𝑆𝑚𝑎𝑥

es decir,
𝑆
𝐷 = 𝐷𝑚𝑎𝑥 𝑘
𝑆 + 𝑆

de donde, la concentración sustrato residual en la corriente de salida del fermentador,

será

𝐷(𝑘𝑆 +  𝑆) = 𝐷max 𝑆 S (Dmax − D ) = Dk S

Dk S
S=
Dmax − D

para encontrar la concentración de biomasa en el fermentador, sólo hay que despejarla de

la definición de rendimiento de biomasa:

X − Xo
YX / S =
So − S

de donde

𝑋 = 𝑋𝑜 + 𝑌𝑋/𝑆 (𝑆𝑜 − 𝑆)
o bien

 DkS 
X = X o + YX / S  So − 
 Dmax − D 

La expresión anterior muestra que al variar la rapidez de suministro del medio se puede
modificar la rapidez de crecimiento. Cuando D alcanza un valor mayor a max, (D>max), la
expresión ( - D) se vuelve negativa. El resultado es una disminución de la concentración
de células y, finalmente, el agotamiento del cultivo. A este efecto se le denomina lavado
del tanque o wash out.

La rapidez de dilución crítica, Dc, se define como la rapidez de dilución más pequeña a la
cual ocurre el fenómeno de lavado del tanque. En la práctica, Dc es aproximadamente igual
a max.

A tasas de dilución próximas a Dc, el quimiostato se vuelve menos estable, ya que ligeras
fluctuaciones en la rapidez de flujo debidas a errores de bombeo, etc., provocan grandes
cambios en X. Bajo estas condiciones existen regímenes permanentes "metaestables" que
podrían conducir rápidamente al lavado del tanque. Por lo tanto, la desventaja principal del
quimiostato es que trabaja mejor a tasas bajas de dilución, ya que las fluctuaciones en la
rapidez de flujo tienen poco efecto sobre el régimen permanente y los cambios en X y S
son pequeños.

El turbidostato, por otra parte, mantiene una densidad celular constante al controlar la
rapidez de flujo del medio nuevo. En consecuencia, es muy sensible a cambios pequeños
en X y S funciona mejor a tasas de dilución altas.

1.4.2. Clasificación de los sistemas de cultivo continuo

Los sistemas de cultivo continuo pueden clasificarse desde varios puntos de vista.
Siguiendo los criterios de recirculación de células, tipo de mezclado y número de tanques,
es posible clasificar los sistemas de cultivo continuo como se muestra en la Tabla 5.

De acuerdo con estos criterios un quimiostato es un sistema abierto, homogéneo y de una

sola etapa.

Para mantener en operación un sistema continuo es necesario alcanzar y mantener un flujo

permanente y constante. Durante la operación de estado estable no deben ocurrir cambios
en la concentración de sustrato, en la concentración de biomasa y en la concentración
intracelular de metabolitos. Como resultado de las condiciones ambientales constantes
(aereación, nutrición, pH, temperatura, etc.), las propiedades regulatorias de la célula
alcanzan estabilidad por largos periodos.
 Tabla 5. Clasificación de sistemas de cultivo continuo.
CRITERIO TIPO DE SISTEMA

Sin recirculación
Recirculación de Células
Con recirculación
Homogéneo
Mezclado
Heterogéneo
Una sola etapa
Número de Etapas
Multietapas

Los requisitos mínimos para una unidad de laboratorio son (18): un tanque esterilizable;
conexiones de líneas de alimentación asépticas; filtros y accesorios de muestras;
agitadores y aireadores; control de pH, temperatura y espuma y volumen de trabajo
verdadero; Dispositivos para transferencia de medios, ácidos y álcalis (se usan bombas
peristálticas de flujo variable).

1.4.3. Ventajas del cultivo continuo sobre el cultivo por lotes

Las ventajas principales son (17):

• La rapidez de crecimiento se puede controlar y mantener indefinidamente (dentro de los

límites del organismo).
• Se puede examinar el efecto de cambios en los parámetros físicos o químicos sobre el
crecimiento y la formación del producto a una tasa de crecimiento constante.
• La concentración de biomasa se puede mantener constante variando la tasa de dilución.
• Se puede mantener el crecimiento limitado por un sustrato y estudiar los cambios en la
composición y actividad metabólica celular modificando el nutriente limitante del
crecimiento.
• Con la técnica de pulso y cambio se puede optimizar la composición del medio para la
formación de biomasa y producto. En esta técnica se tiene que inyectar nutrientes
directamente en el quimiostato y observar los cambios en X y S. Si X aumenta, el
nutriente se añade al depósito de suministro y se establece un nuevo régimen
permanente. Luego se repite el procedimiento.
• A menudo, se puede mantener la producción de metabolitos secundarios en forma
simultánea con el crecimiento.
• Permite la determinación exacta de las constantes cinéticas, coeficiente de
mantenimiento y coeficientes de crecimiento reales.
• Los resultados obtenidos en el cultivo continuo con frecuencia son más confiables y
reproducibles.
• Mayores productividades por unidad de volumen y menor pérdida de tiempo en tiempo
improductivo que incluye limpieza, preparación, esterilización del medio, etc.
• A menudo el cultivo continuo es más económico debido a los factores anteriores ya que
es menos laborioso y requiere menor capital de operación.
• Los quimiostatos se pueden utilizar para mantener selección de precisión para los
termófilos, cepas osmotolerantes o mutantes con altas tasas de crecimiento y
rendimiento.
• El control de esta operación es más sencillo ya que se trabaja en estado estable.
• Es posible obtener volúmenes de producción elevados o tener equipos de fermentación
de menor tamaño para producciones similares con equipos por lotes de mayor tamaño,
debido a la operación continua.

1.4.4. Desventajas del cultivo continuo comparado con el

cultivo en lote
Las desventajas principales son (17):

o No siempre se puede lograr la producción de algunos productos no

asociados al crecimiento, los cuales a menudo requieren de técnicas de
cultivo por lote alimentado.

o El crecimiento continuo por largos periodos puede ocasionar la pérdida de la

cepa original, debido a que puede ser reemplazada por una cepa
contaminante que crece más rápido.

o A menudo, el crecimiento de organismos filamentosos es difícil debido a la

viscosidad y naturaleza heterogénea del cultivo que evita el crecimiento en
régimen permanente.

o El crecimiento por periodos largos puede ocasionar problemas de

contaminación.

o Para periodos de crecimiento extensos, la planta y el equipo auxiliar deben

ser confiables, y de la mejor calidad para evitar la interrupción mecánica, etc.

o Solamente es adecuado cuando se requieren volúmenes de producción

pequeños.