CULTIVO BATCH
15-DICIEMBRE-2020
INTRODUCCION
El reactor provee todos los
El reactor es el corazón de servicios que son necesarios
cualquier proceso de para el cultivo: mezclado, Un proceso discontinuo opera
fermentación o conversión termostatización, suministro en un sistema cerrado
enzimática de oxígeno, nutrientes, control
de pH, etc.
Consiste en un recipiente El coste de operación de este
cerrado que no existe aporte biorreactor depende del
El cultivo discontinuo o cultivo
de nutrientes ni egreso de tiempo necesario para alcanzar
batch es el método de cultivo
productos, el sustrato se añade la concentración del producto
más simple
al comienzo del proceso y los o el nivel de concentración del
productos son retirados al final sustrato deseado.
En un cultivo batch el
microorganismos cuando se
siembra en un medio de cultivo
adecuado crece hasta: se agota
un nutriente esencial, o se
acumulan subproductos tóxicos
que inhiben el crecimiento.
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
La evolución del cultivo con el tiempo sigue una curva típica denominada “curva de
crecimiento microbiano”. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden
separarse en cuatro fases: fase lag o fase de latencia, fase de crecimiento
exponencial, fase estacionaria y fase de muerte
. Fase lag o fase de latencia
El crecimiento del microorganismo no comienza
inmediatamente después de la inoculación del medio de
cultivo, necesita un período de adaptación a las condiciones de
cultivo, denominado fase lag o fase de latencia. Durante este
período no hay división celular pero sí aumento de la masa
individual de los microorganismos. La duración de esta etapa
depende de la cantidad inicial de inóculo, edad y estado
fisiológico de las células. La duración de la fase de latencia
depende especialmente del cultivo previo y de la edad del
inóculo
Fase de crecimiento exponencial
(crecimiento balanceado)
Finalizada la fase lag, la concentración de biomasa (x) comienza a
aumentar en forma lenta y luego más rápidamente, hasta llegar a
una etapa en la cual las células crecen a una velocidad específica
máxima y constante (um). Esta etapa se denomina fase logarítmica
o fase exponencial y representa el mayor potencial reproductivo de
la célula. Al final de esta fase se alcanza la máxima concentración
microbiana ( xf = xmax). La fase exponencial o logarítmica de
crecimiento se caracteriza por la constancia de la velocidad de
división que es una medida específica de cada especie.
Fase de desaceleración
Luego de la fase exponencial hay un rápido
período de desaceleración causada por el
agotamiento de algún nutriente (el sustrato
limitante) o por acumulación de inhibidores y por
lo tanto disminuye y tiende a 0. Es una zona muy
corta y abrupta si solo hay glucosa como FCE. Pero
es suave y larga en medios complejos que tienen
peptona, extractos, además de la fuente de
carbono.
Fase estacionaria (crecimiento no
balanceado)
Los componentes de las células no crecen con la
misma velocidad y la composición media se
modifica. El estrés producido por la falta de
nutrientes o por la existencia de subproductos o
toxinas inhibidoras generan un medio hostil e
induce una reestructuración de las células para
adaptarse a las nuevas condiciones.
Las células aún son activas y pueden producir
metabolitos secundarios (ej. antibióticos,
hormonas)
Fase de declinación o muerte
En esta última etapa, la concentración celular disminuye como resultado de
la escasez de reservas de energía o por autolisis. Al igual que el crecimiento,
la muerte de las células es constante y en un gráfico semilogarítmico esta
fase se representa a través de una línea recta.
Balance de materia en un Biorreactor
Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el
siguiente balance de materia en el biorreactor:
Considerando que en un cultivo batch los caudales de entrada (F1) y salida (F2) son nulos
y por lo tanto V se mantiene constante en el tiempo la ecuación se reduce a:
Para un determinado sustrato o producto la velocidad volumétrica de consumo o
formación del producto será:
Si se grafica la disminución de la concentración de un determinado sustrato en función
del tiempo de reacción, la velocidad volumétrica se puede calcular como la pendiente en
cada instante. A partir de la ecuación del cultivo batch se harán balances para biomasa,
sustrato y producto
Balance para la biomasa
Aplicando la ecuación del cultivo batch a la biomasa se obtiene:
Siendo: rx: velocidad de crecimiento microbiano (g/l.h).
En un cultivo batch se puede medir la velocidad de crecimiento a los distintos tiempos,
midiendo en cada punto la pendiente
La ecuación para biomasa se puede escribir de la siguiente manera, recordando que rx = μ. X
Al principio del cultivo batch (fase de crecimiento logarítmico o exponencial), todos los
nutrientes son saturantes, aún el sustrato limitante, (S >> ks) y el microorganismo
crecerá a μm máximo y constante. En este período, la velocidad de crecimiento es
independiente de los nutrientes, el microorganismo crecerá a μm máximo y constante y
resulta en una cinética de primer orden:
Integrando la ecuación y suponiendo que a t = 0, X =X0 se obtiene:
Esta fase se denomina fase crecimiento logarítmico porque si se grafica el logaritmo de la
concentración de células (x) frente al tiempo se obtiene una línea recta cuya pendiente es
µm (la velocidad específica máxima de crecimiento) y ordenada al origen ln Xo. Por lo
tanto durante la fase logarítmica, la velocidad de crecimiento (rx) puede describirse por
una ecuación de primer orden, considerando que en esta fase el sustrato limitante está en
exceso y la velocidad específica de crecimiento es constante y máxima en las condiciones
que se opera se denomina entonces µmax = velocidad específica de crecimiento máxima.
Por ello a esta fase se la denomina fase logarítmica o exponencial. Por lo tanto en esta fase la
concentración de biomasa aumenta exponencialmente y también lo hace rx
Si antes de la fase exponencial se presenta fase lag, se debe corregir lo que consiste en restarle el
tiempo transcurrido hasta que comienza efectivamente el crecimiento (tlag), correspondiente al
período lag
Normalmente esta fase no es deseable ya que significa una pérdida de tiempo, por lo que
usualmente se trata de minimizarla. Una forma de lograrlo consiste en hacer crecer el inóculo en
un medio de cultivo igual al que se va a emplear posteriormente y además transferirlo cuando las
células se encuentren en plena fase exponencial.
A partir de este análisis se puede determinar el tiempo de duplicación (o tiempo de generación),
que es el tiempo necesario para que la biomasa se duplique, considerando para t = td y X= 2 X0 se
obtiene:
A medida que el cultivo transcurre, s disminuye (y por lo tanto rx), se está en la fase de
desaceleración. Esta fase es muy corta y abrupta en medios definidos, si solo hay una FCE,
pero es suave y larga en medio complejos que tienen peptona, extractos, etc., además de
la FCE. Finalmente S = 0 (fase estacionaria) y rx = 0. No se acumulan más células en el
reactor y se está en la fase estacionaria. En este momento se alcanza la máxima
concentración de biomasa y finaliza el batch (fase estacionaria).
La concentración final de biomasa xf, se puede calcular si se conoce el
rendimiento Yx/s
NOTA
Para obtener la máxima concentración de biomasa se debe tratar de a)
minimizar la fase de latencia, utilizando inóculo activo (en la fase
logarítmica) (5 al 10 %), proveniente de un medio de cultivo de composición
similar que el del medio para la fermentación, b) aumentar la velocidad en la
fase logarítmica, utilizando un medio de cultivo y condiciones de cultivo
óptimas para el crecimiento del microorganismo, c) maximizar la extensión
de la fase logarítmica, utilizando una cepa de alta tolerancia hacia los
metabolitos formados y con elevada afinidad hacia el sustrato (bajo valor de
ks).
BALANCE DEL SUSTRATO
Apliquemos la ecuación de balance de masa al sustrato limitante del
crecimiento en un fermentador discontinuo. Considerando que el sustrato en
un cultivo batch no entra ni sale del reactor y no se genera por lo que rf = 0,
la velocidad volumétrica de utilización de sustrato será:
La expresión para rs dependerá tanto de si se forma producto extracelular en
el cultivo como de la relación existente entre la síntesis de producto la
generación de energía en la célula. Si no hay formación de producto o este
está asociado al metabolismo energético el consumo de sustrato viene
expresado por la ecuación de Pirt :
Recordando que rx = μ.x, se obtiene:
Esta ecuación permite calcular la concentración de sustrato residual (S) al tiempo t, siempre
que el proceso esté dentro de la fase logarítmica
A medida que el cultivo transcurre, S disminuye, hasta que llega a la condición en que
S es comparable a ks, entrando en la fase de desaceleración y finalmente S = 0 en la
fase estacionaria. El tiempo de cultivo necesario para alcanzar una determinada
conversión de sustrato se obtiene de la integración de la ecuación
Si se desprecian los requerimientos de mantenimiento celular:
Balance para el producto
Aplicando la ecuación de balance de materia al producto y considerando que en un
cultivo batch el producto no entra ni sale del reactor y no se consume por lo que rc = 0,
se obtiene:
Si qp es constante la ecuación puede integrarse con la condición inicial P = P0 a t = 0, obteniéndose
una expresión que permitiría calcular el tiempo de cultivo en discontinuo en función de la
concentración de producto final:
Tiempo total para un ciclo de reacción en discontinuo:
En la práctica en los procesos discontinuos, además del tiempo del proceso fermentativo (tb), existen largos
períodos improductivos, como: El tiempo necesario para recoger el contenido del reactor (thv). Tiempo
para limpiar, esterilizar y preparar de nuevo el fermentador para la siguiente operación (tp). Para un cultivo
celular se tiene además un tiempo de adaptación o fase lag (tl), tras la inoculación durante el cual no
existe crecimiento ni formación de producto Por lo tanto el tiempo no productivo total (tnpt) será:
tnpt = thv + tp + tl
El tiempo total de que dura el cultivo en un reactor discontinuo tT será:
tT = tnpt + tb
PRODUCTIVIDAD EN UN CULTIVO BATCH
La productividad de biomasa (o producto) de un proceso fermentativo puede
describirse como la cantidad de biomasa (o producto) obtenida por unidad de
tiempo:
P = Concentración producto/tiempo de fermentación (g/l.h)
Para calcular la economía de un proceso se deben considerar varios aspectos:
el tiempo de producción (de fermentación), tiempo de limpieza y
acondicionamiento del fermentador, tiempo de esterilización, etc. Stanbury y
Whitaker (1984) definieron la productividad de un cultivo batch (Pb)
mediante la expresión:
El tiempo del proceso, durante la fase exponencial se obtiene despejando tb de la
ecuación
ecuación que permite determinar la productividad en un cultivo batch:
Desventajas del cultivo Batch
Dificultad de controlar el μ, excepto variando la composición del medio o
las condiciones de proceso.
Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el crecimiento debido
al aumento de la presión osmótica del medio o toxicidad de nutrientes.
Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación debido a una
insuficiente capacidad del reactor para transferir oxígeno.
Tiempos muertos entre procesos que disminuye la productividad.
Ejercicio
Una población de levaduras crece en un medio limitado por glucosa partiendo
de una concentración inicial de este sustrato de 22 g/l. Se logra una
concentración de biomasa de 5,67 g/l quedando remanentes 4,36 g/l de
glucosa. ¿Cuál es el rendimiento alcanzado?. Considere X0 = 0,2 g/l.
