Molecular Biology at the Cutting Edge: A Review on CRISPR/CAS9 Gene Editing for

Undergraduates

Moreno Zavala Salvador

Uno de estos mecanismos de defensa es un sistema inmunológico adaptativo.

sistema que se encuentra en muchas bacterias y la mayoría de los arquea llamado
C luscados R egulatory I nterspaced S hort P alindromic R epeats o CRISPR, junto
con C RISPR- como proteínas asociadas o Cas proteínas. Integrando secuencias de
ADN que son idénticas a invasores pasados ​en su genoma, bacterias y archea
gener- comió una memoria celular de invasores pasados. Estos adquiridos

Las secuencias permiten que las bacterias o arqueas reconozcan virus o invasores
de plásmidos como no propios, lo que resulta en la degradación de la secuencia
invasora y funcionando como un adaptativo sistema inmunológico para procariotas.

La inmunidad CRISPR se caracteriza por distintas fases.

Primero, durante la fase de adaptación, las bacterias o arqueas ganan una memoria
celular del virus o plásmido invasor. Pequeño Se integran las secuencias de los
genomas virales o plasmídicos. en el locus CRISPR del genoma bacteriano o
arqueal. Estos loci CRISPR fueron identificados por primera vez por científicos
trabajando en la industria de la fermentación, donde los procariotas son esencial
para la producción de productos fermentados. Mediante análisis genómico
comparativo de diferentes S. thermophilus cepas (un microbio utilizado en la
producción de yogur), los científicos identificados un locus muy variable en el
genoma de estas bacterias. Esta región altamente variable tenía dos características
distintas: muchas repeticiones no contiguas que están separadas por variable
secuencias, denominadas espaciadores. Tras una inspección más cercana, la
investigación- Los investigadores encontraron que las secuencias espaciadoras
coincidían con las encontradas en genomas de fagos (virus que infectan bacterias).
Interesar Curiosamente, cuando los investigadores compararon los fagos resistentes
y S. thermophilus sensible a los fagos, la bacteria resistente a los fagos tenía
secuencias espaciadoras que coincidían con las regiones de ese fago genoma. Por
lo tanto, el contenido del espaciador se correlacionó con el fago. resistencia que
lleva al modelo de que regiones cortas del El genoma del invasor está integrado en
los loci CRISPR como un espaciador, separado por secuencias repetidas, lo que da
como resultado un memoria de infecciones previas.

Después de la adquisición de espaciadores, ARN, denominado CRISPR ARN

(crRNA), se genera a partir de espaciadores en el locus CRISPR y cargado en una
proteína Cas. crRNA dirige la proteína Cas para reconocer secuencias invasoras y
escindir las entrantes ADN de fago o plásmido. Tres tipos diferentes de Se han
identificado sistemas CRISPR – Cas en bacterias y archea: Tipo I, Tipo II y Tipo III.
Cada sistema utiliza un Diferente mecanismo para generar crRNA y proteínas Cas
que catalizar la escisión del ácido nucleico. Aquí nos centraremos en el sistema
CRISPR Tipo II, que ha sido más comúnmente adaptado para la edición del genoma
debido a su simplicidad que requiere solo una proteína Cas, Cas9 y dos
componentes de ARN. Para generar el crRNA, el locus CRISPR se transcribe,
generando una larga Molécula de ARN con secuencias homólogas a invasores
pasados.Esta molécula de ARN se denomina pre-crRNA. Un segundond ARN de un
locus genómico aguas arriba del locus CRISPR también se transcribe. Este ARN se
llama trans-activador

ARN CRISPR (ARNtracr). El tracrRNA tiene un región que es complementaria a la

región de repetición del Locus CRISPR y se une al pre-crRNA recién transcrito
creando un ARN de doble hebra que se escinde por RNa-seIII (una enzima que
reconoce y corta la doble cadena ARN) resultando en un complejo crRNA: tracrRNA
que contiene solo una secuencia espaciadora. Este complejo de ARN luego se
asocia se une con una sola proteína Cas9, creando un ribonucleo activo complejo
de proteína (RNP). Una vez que el crRNA: tracrRNA se une a Cas9, Cas9 se activa
puede escindir secuencias invasoras de ácidos nucleicos

Después de la caracterización inicial del microbiano CRISPR / Cas9 sistema

inmunológico, los biólogos moleculares reconocieron cómo podía explotarse para la
edición precisa del genoma en eucariotas. En respuesta a las roturas de doble
cadena inducidas por Cas9, las células emplean una de las dos vías de reparación
del ADN para reparar el daño: ya sea a través de unión de extremos no homólogos
(NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR) NHEJ puede ocurrir a través de
NHEJ canónico (C-NHEJ), que liga o esentialmente "pega" los extremos rotos de
nuevo juntos. Adicionalmente, hay una vía de unión de extremos alternativa
(alt-NHEJ), en cuál hebra del ADN a cada lado de la ruptura es resecado para
reparar la lesión. Ambos métodos de reparación

Los ods son propensos a errores, lo que significa que la lesión se repara
imperfectamente, dando lugar a inserciones o deleciones

Alternativamente, si hay una molécula de ADN cercana conomología con la región

alrededor de la ruptura de la doble hebra, entonces el ADN homólogo se puede
utilizar como plantilla para reparar la ruptura a través de la reparación dirigida por
homología (HDR) vía. Normalmente, este mecanismo de reparación ocurre después
de la replicación del ADN, pero antes de la división celular, por lo que la ruptura se
puede reparar a partir de la cromátida hermana recién replicada sin mutaciones. Sin
embargo, esta forma de reparación puede ser explotado para introducir ediciones
precisas o grandes inserciones o eliminaciones mediante la introducción de una
plantilla donante para su reparación. Por lo tanto, al hacer un corte en un lugar
específico y tomar ventaja de las vías de reparación del ADN celular, existe la
potencial para generar mutaciones dirigidas e insertar secuencias ces de interés.
Sin embargo, la creación de roturas de doble hebra en ubicaciones genómicas
precisas ha sido un desafío debido a la dificultad para dirigir ADN nucleasas a
secuencias específicas. Cas9 puede ser fácilmente dirigido por un crRNA único para
cortar en cualquier sitio deseado. Dado que se requiere un sitio PAM para el enlace
Cas9, el objetivo debe estar aguas arriba de un sitio 5 0 -NGG-3 0 (en el caso de
SpCas9). Por lo tanto, siempre que la secuencia de su se conoce el gen diana,
Cas9 puede dirigirse a casi cualquier sitio dada la presencia de un PAM cercano (5
0 -NGG-3 0 ). Para adaptar CRISPR para la edición del genoma en eucariotas, Los
primeros investigadores caracterizaron Cas9 y el papel de la crRNA: complejo
tracrRNA. A través de estudios in vitro utilizando Cas9 purificado para cortar una
plantilla de ADN y agregar u omitiendo el tracrRNA, los investigadores encontraron
que el tracrRNA es necesario para la escisión por Cas9. Adición- investigadores
aliados encontraron que el crRNA y el tracrRNA podrían combinarse en una s ingle
g uía ARN o sgRNA, limitando el número de componentes necesarios para
introducir en la celda. A continuación, tres estudios diferentes mostró que la
expresión de SpCas9 con un sgRNA precisamente apunta a Cas9 resultando en un
corte en un investigador especificado ubicación en el genoma humano o del ratón,
demostrando estableciendo la viabilidad de CRISPR / Cas9 como eucariota
herramienta de edición del genoma.

Para expresarse a partir de ADN, se introducen dos plásmidos: uno que codifica el
sgRNA y uno que codifica la proteína Cas9

El sgRNA (tracrRNA: crRNA híbrido), es utilizado para simplificar de modo que dos
plásmidos (tracrRNA: crRNA híbrido + Cas9), en lugar de tres (tracrRNA + crRNA +
Cas9), son obligatorios. Los plásmidos Cas9 y sgRNA deben diseñado para
garantizar la expresión adecuada en el objetivo célula eucariota. Primero, la
secuencia de codificación de Cas9 es el codón optimizado para una expresión
eficiente en diferentes organismos. Por lo tanto, al cambiar la secuencia nativa de
Cas9 para uno que usa codones más comúnmente usados ​en ese organismo
siendo editado, la traducción se puede mejorar enormemente. Adición- aliado,
apropiarse 5 0 y 3 0 regiones no traducidas mosto (UTR) ser incluido para la
traducción eficiente de Cas9 mRNA para producir tein. Por último, al generar la
construcción de ADN, un promoter, que es una secuencia directamente aguas arriba
de la trans-sitio de inicio de la inscripción del gen y recluta ARN.

Por último, un investigador debe identificar una edición genómica exitosa. La edición
del genoma, incluido CRISPR / Cas9, no está ni cerca 100% eficiente creando una
"aguja en el pajar" potencial problema. ¿Cómo identifica un investigador al individuo
o célula que alberga una edición exitosa de los muchos descendientes del animal
inyectado o de las muchas células electroporadas? Se pueden utilizar dos
estrategias genéticas diferentes para identificar

mutantes deseados: pantallas y selecciones. Pantallas de manera efectiva hacer

que la "aguja" sea más fácil de identificar en el pajar y Las selecciones reducen el
tamaño del pajar para hacer una "aguja" identificación más fácil. Ambos métodos
alivian la carga del éxito identificación completa de la edición del genoma, un cuello
de botella significativo en el flujo de trabajo CRISPR.

Un cribado genético examina a muchas personas para identificar una edición

exitosa. Si hay un fenotipo conocido asociado con la mutación deseada realizada, la
progenie o las células pueden ser examinado directamente para el fenotipo
asociado. Para ejemplo, cuando se inserta GFP utilizando HDR para etiquetar un
pro-tein de interés, los organismos o las células se pueden cribar directamente para
la expresión fluorescente [34]. Alternativamente, en lugar de cribado de un fenotipo
deseado, uno puede cribar para el lesión molecular generada por la edición del
genoma. Estas Los métodos son especialmente útiles cuando NHEJ da como
resultado un pequeño inserción o eliminación. Uno de esos ensayos moleculares
para detectar lesiones moleculares es un fragmento de restricción de longitud
poli-análisis de morfismos (RFLP), que aprovecha las diferencias diferencias en
presencia de sitios de restricción entre los ADN de tipo salvaje y la mutación
generada a través de Edición CRISPR / Cas9 [35]. La región de interés que fue
objetivo de una mutación se amplifica por PCR y luego se digiere con una enzima
llamada endonucleasa de restricción, que cortes en una secuencia de ADN
específica. Si la enzima puede corte, entonces no se generó ninguna mutación y el
tipo salvaje La secuencia todavía está presente, que se puede visualizar mediante
gel. electroforesis. Sin embargo, si el producto de PCR no se corta,

luego se generó una edición exitosa. Este ensayo también funciona en la dirección
opuesta: mutaciones generadas por CRISPR puede crear un sitio de restricción.
Alternativamente, diferentes ensayos basados ​en endonucleasas como CEL1 [36] y
bacterianos La endonucleasa T7 [37] reconoce y escinde mis- coincidencias,
inserciones o eliminaciones. Estas endonucleasas son similar al análisis RFLP, pero
tienen la ventaja de queno confíe en la creación o destrucción de una restricción
sitio.