MICROORGANISMOS Y SU PRODUCCIÓN INDUSTRIAL

TEMA 3.- CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS.

❖ Cultivo discontinuo. Fases de crecimiento.

❖ Cultivo continuo. Cinética en quimiostato.
❖ Medidas de poblaciones.

1.- CULTIVOS DISCONTINUOS:

→ Fase lag de retraso o latencia:

En esta fase, el microorganismo se adapta a las condiciones del medio y sintetiza las enzimas
y coenzimas necesarias para su desarrollo. Si las condiciones son las mismas que las del
medio del que proviene el inóculo, esta fase no se da. El microorganismo tiene que adaptar su
metabolismo para crecer al máximo. En la industria no es interesante que se produzca. Para
ello, debemos seguir la siguiente estrategia: el inóculo debe venir ya adaptado, debe haber
crecido en el mismo medio en el que lo vamos a inocular. Es necesario recogerlo en un
momento concreto: cuando esté en fase exponencial; es entonces cuando tiene su maquinaria
metabólica preparada. → Para eliminar la fase lag el medio de cultivo ha de ser el mismo,
porque ya estarán adaptadas, además, el inóculo debe estar en fase exponencial y
posteriormente, se pone en el mismo medio, es decir, se tienen que dar ambas.

→ Fase exponencial:

Dura hasta que se agota algún nutriente o la concentración de un producto tóxico se vuelve
demasiado alta (u otras complicaciones como falta de espacio, de oxígeno, etc.), entonces
pasan a la fase estacionaria. Durante la fase exponencial, se da un crecimiento equilibrado, es
decir, todos los componentes celulares aumentan a la misma velocidad (proteínas, azúcares,
DNA); la composición química celular es constante.

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En el ejemplo, partimos de un cultivo con una sola célula (lo cual es bastante difícil de
conseguir). Este microorganismo tiene un tiempo de generación de 30 minutos.
Si quisiéramos calcular la velocidad de crecimiento de este cultivo, es decir, el número de
células que se producen por unidad de tiempo, tendríamos un problema: cada vez se produce
un número distinto de células porque el crecimiento es exponencial, por lo que depende del
número de células que hay en cada momento (cuántas más hay, más se producen). Esto
significa que la velocidad de crecimiento no es constante y no se puede calcular. Por ello
calculamos otro parámetro: μ, se le llama constante de proporcionalidad o constante específica
de velocidad de crecimiento y conceptualmente es la velocidad de crecimiento por unidad de
biomasa. μ tiene unidades de t-1. Hay que destacar que en la gráfica aparece representado N
frente a tiempo. Si tuviéramos logaritmo neperiano de N frente a tiempo, la representación sería
una recta, cuya pendiente es μ.

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 ¿CÓMO ESTIMAR µ?

EJEMPLO → Partiendo de estos datos queremos conocer μ y g.

Lo primero es identificar cuándo empieza y acaba la fase exponencial. Para ello hay que buscar
el intervalo de tiempo en el cual las variaciones sean iguales. En el ejemplo empezaría a las 5
horas y duraría hasta las 10. Esto nos sirve de manera teórica, pero en la realidad no vamos a
tener datos tan claros. Así que para evitar estos problemas debemos hacer una gráfica de Ln N
o Log N frente a tiempo. La clave está en usar logaritmos ya que, si usamos números absolutos
de N, no saldrá una recta, que es lo que buscamos.

Una vez seleccionados los datos de la fase exponencial, se hace una recta de regresión lineal.
Una regresión es encontrar una ecuación matemática que refleje la relación entre dos
variables. Una vez obtenida dicha ecuación, sabemos que μ es el valor que acompaña a la X
(la pendiente).
Velocidad de crecimiento= mu * N

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En una gráfica, la fase exponencial es más corta cuanto menor sea la concentración de
sustrato limitante. Además, μ es más baja cuanto menor concentración de sustrato (menor
pendiente). Además, cuanto mayor sea la concentración de sustrato, mayor será la cosecha
máxima.
Sin embargo, no se puede añadir sustrato eternamente esperando que el cultivo siga creciendo
cada vez más rápido; en realidad, concentraciones excesivamente altas de sustrato inhiben el
crecimiento. Si ponemos una concentración bastante alta sin llegar a inhibirlo, lo que pasará es
que llegará un momento en el que el cultivo no puede crecer más rápido.

Se ha alcanzado la μmax de ese microorganismo (en esas condiciones particulares). A partir de

entonces, μ es constante a pesar de incrementar la concentración, aunque la cosecha sí que
sigue aumentando (en la imagen, a partir de C4 la pendiente (μ) se hace constante).

CURVAS DE CRECIMIENTO CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA LIMITANTE

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Por todo esto, es muy interesante conocer la relación entre μ y la concentración de sustrato
limitante. Para ello, empleamos la ecuación de Monod (1942)

Esta gráfica a veces tiene su importancia, ya que nos permite ver conceptualmente a partir de
qué concentración de sustrato se alcanza más o menos μmax. Sin embargo, si lo que
queremos es calcular μmax y Ks, lo que hay que hacer es una doble recíproca. En la doble
recíproca, obtenemos una recta en la cual la pendiente es Ks/μmax, y la ordenada en el origen
es 1/μmax. Por ello, haciendo una regresión lineal que nos dé la ecuación de la recta, se
podrán calcular fácilmente esos dos parámetros.

Hay dos posibilidades:

- Hacer una regresión no lineal con la ecuación → SPSS
- Transformación de los dobles recíprocos en ecuación lineal

Las unidades de mu t^-1 y la Ks con unidades de concentración.

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 FASE ESTACIONARIA:

Durante esta fase no hay aumento del número de células, aunque estas siguen estando activas
y producen metabolitos secundarios. Tienen una morfología y una composición química distinta
de la que tenían en la fase exponencial y es variable a lo largo de la fase estacionaria.

Hay diversas razones por las que las células pueden entrar en fase estacionaria:
● Agotamiento de nutrientes
● Acumulación de tóxicos
● Envejecimiento celular
● Falta de espacio
● Falta de oxígeno

Unidades: células (gramos de células → biomasa), aunque es más común dar un valor
relacionado por unidad de volumen

Además, podemos calcular el rendimiento (Y), es decir, la biomasa producida por unidad de
sustrato consumido.

Las unidades de M y S varían

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Dónde S0 es la concentración de sustrato inicial y St la concentración al comienzo de la fase
estacionaria. Tiene unidades de gramos de células producidas por gramo de sustrato. E. coli
tiene rendimientos sobre hexosas, pentosas, polialcoholes y disacáridos de 0.21-0.28. No tiene
unidades porque son gramos de biomasa por gramo de sustrato → g cel g S-1.

Aumenta, por tanto de forma lineal en proporción de sustrato

CULTIVOS CONTINUOS:

Los cultivos continuos son aquellos que se mantienen en fase exponencial de forma indefinida,
para lo que se utiliza un quimiostato.

Este sistema nos permite elegir la μ a la que crecerán los microorganismos y la densidad de
microorganismos dentro del reactor (concentración de células en el quimiostato), lo cual se
consigue con una válvula que permite controlar el flujo.

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Al principio, Monod en 1950 lo llamó Bactogen y Noc y Szilar en 1950, posteriormente, lo
llamaron quimiostato.

Es importante tener claros una serie de aspectos sobre el quimiostato:

- Si entran 50L/h de medio de cultivo fresco, los mismos deben salir por el rebosadero.
- Se puede utilizar para obtener un cultivo de células durante un largo periodo de tiempo,
es decir, un suministro constante de células.
- Otra posible aplicación es utilizarlo para el seguimiento de la evolución dirigida viendo
los mutantes que aparecen o para seleccionar resistencia a tóxicos.
- Tiene que haber un sustrato limitante, que va a ser el primero en agotarse y limitar el
crecimiento, del resto tendremos exceso. Por lo tanto, es necesario conocer la μmax del
microorganismo con este sustrato.

CULTIVOS CONTÍNUOS:

PARÁMETROS DEL QUIMIOSTATO A CONOCER

*D= flujo normalizado por volumen

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Dentro del quimiostato, lo que podemos conocer es la concentración de células o biomasa
(Xeq, en el equilibrio), la concentración de sustrato (Seq) y la velocidad de crecimiento (μeq).
Pongamos un ejemplo: dado un quimiostato de volumen 1000mL sometido a un flujo de 500
mL/h; ¿Cuáles serán la velocidad de dilución y el tiempo medio de residencia?

El el cultivo contínuo hay variación de biomasa en el quimiostato, la cual tiene dos fuentes:
1. El crecimiento de los microorganismos; lo que hace que aparezcan nuevas células. Para
cuantificarlo utilizamos la siguiente fórmula: 𝝁𝑿 (biomasa que se produce por unidad de
volumen y tiempo)
2. La salida por el rebosadero que hace que el número de células disminuya. Se calcula
con la siguiente fórmula: 𝑫𝑿 (biomasa que sale por unidad de volumen y tiempo)
Siendo X es el número de células por unidad de volumen.

Por lo tanto:

De modo que se nos plantean tres posibles situaciones:

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• Si μ=D, no hay variación en el número de células. Es una situación estable y en la que se va a
encontrar el quimiostato cuando está en equilibrio.
• Si μ>D, es una situación de tránsito en la que va a haber un incremento de células durante un
tiempo. Esta tendencia va disminuyendo porque, a medida que hay cada vez más células en el
quimiostato, va habiendo menos sustrato, con lo que μ va gradualmente disminuyendo hasta
ser igual a D, llegando al equilibrio. La situación μ>D es aquella que se da cuando inoculamos
el quimiostato.
• Si μ<D, ocurre cuando el número de células que entran no supera el de las que salen y el
quimiosato se va vaciando. Es algo indeseado y que ocurre cuando se abre demasiado la
válvula. Se dice que en esta situación se produce un lavado del quimiostato.

Llegados a este punto, se nos puede plantear otra pregunta: ¿Cualquier valor de D llevará al
equilibrio?

Podemos calcular Dc con la siguiente fórmula:

Ks es más pequeño respecto a Sr, por lo que Dc es prácticamente igual a μmax.

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Una vez vistas las características y los parámetros de un quimiostato, podemos estudiar su
evolución tras ser inoculado. En un primer momento D, es constante y baja (si no queremos
que haya lavado). En el momento del inóculo, tenemos una densidad de células muy baja (X),
mientras que la concentración de sustrato es alta (S). Por tanto, estas células van a crecer a
μmax → Conclusión: nos encontramos en una situación de μ>D; se produce un aumento de
células.

Baja x=baja densidad

Alta S= alta concentración del sustrato, es un medio fresco y sin usar.

A medida que pasa el tiempo, μ va bajando porque X aumenta y esto hace que el sustrato
disminuya (recordemos que μ depende de la cantidad de S). Entonces llega un punto en el que
μ=D y se alcanza el equilibrio. Una vez alcanzado el equilibrio, podemos hacer variar μ al variar
D (disminuyendo D, porque si lo aumentamos, se entra en lavado y se van las células al
garete), porque cuando variemos D, μ evolucionará hasta ser igual a D. No hay variación de
biomasa y la cantidad que sale es la misma que la original

ESTIMACIÓN DE LOS PARÁMETROS QUE DEFINEN LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN QUIMIOSTATO

Parámetros del quimiostato: µeq, Xeq, Seq

1.-Estimación de Seq: Es la fórmula de Monod pero sustituyendo μ por D. Seq solo depende
del microorganismo y de D. Si variamos Sr vemos que influye en la velocidad de dilución crítica.

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Cuanto mayor sea Sr mayor es la velocidad de dilución crítica y viceversa (como queda claro
echando un vistazo a la fórmula de D

La Seq depende por tanto de la cepa que elijamos y de la D

*El lavado ya no es equilibrio.

2.- Estimación de Xeq

*Haciendo que el flujo sea mayor (pero, aun así, algo menor que μ; estamos hablando de una
situación en la que D ya era mayor que μ, es decir, antes de haber llegado al equilibrio), salen
más células, y momentáneamente el aumento de células dentro del quimiostato disminuye.
Lógico, ¿verdad? Si vamos a las fórmulas, esto es porque 𝐹=𝐷·𝑉. Si aumenta F, aumenta D.
Además, 𝑑𝑋𝑑𝑡=𝑋 (μ−𝐷), por eso, si aumenta D disminuye 𝑑𝑋𝑑𝑡, es decir, el aumento de biomasa
dentro del quimiostato disminuye.

*Además, si aumentamos el flujo, habrá menor densidad de células en el quimiostato en el

equilibrio (Xeq) porque, al haber mucho flujo, salen muchas células. En fórmulas, esto es

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porque si f aumenta, D aumenta. Si D aumenta, Seq aumenta y si Seq aumenta, Xeq
disminuye.

A pesar de todo lo mencionado, existen ciertas situaciones en las que no se cumple esta teoría:
• Cuando Y es variable con D: si el metabolismo no cambia, el rendimiento es constante. Si
varía con diferentes concentraciones de sustrato no vamos a poder tener un sistema estable.
• Con la presencia de nutrientes antagónicos o tóxicos.
• Cuando no hay mezcla homogénea, hay una agitación defectuosa o adherencia a las
paredes. El número de Reynolds es importante: para que el régimen sea turbulento y que haya
movimiento de células, Re tiene que ser grande. Entonces tendremos una buena mezcla

RESUMEN

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL CULTIVO CONTÍNUO.

1.-VENTAJAS:
- Se autorregula y es de fácil control: llega al equilibrio él solo y, como tiene parámetros
constantes, no tenemos que ejercer ningún control sobre él.
- Mayor productividad: es continuo y no es necesario pararlo. Puede producir lo mismo
que un cultivo discontinuo, pero a volúmenes mucho mayores.
- Permite un menor volumen de recipiente por lo que el coste también es menor.

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2.- INCONVENIENTES:
- Inconvenientes
- Coste de las instalaciones
- Mayor susceptibilidad a la contaminación

MEDIDAS DE CRECIMIENTO DE POBLACIONES:

Tenemos distintos métodos:

o Recuento de células: microscopio, UFC viables o contadores electrónicos.

o Medida de biomasa por peso seco. Cuando se dispone de un gran volumen, se suele hacer
en biorreactores.
o Medida de la turbidez: absorbancia. Se emplea cuando tienes que hacer muchas medidas en
muy poco tiempo.
Recuento de células

Las unidades son células/volumen. Se emplea un microscopio, bien con cámaras de recuento
(con rejillas en las que cabe un volumen muy concreto y muy pequeño), o bien sobre filtros. No
es válido si el número de células es muy pequeño. En este caso, se suele centrifugar la
muestra, tras lo cual se resuspende la pastilla en un volumen más pequeño para concentrarla.
Pero esto no es lo ideal porque suele conducir a errores, por lo que si tenemos pocas células
deberíamos seguir otro método.
DAPI: incide luz UV y emite luz azul. Las células aparecen teñidas de un azul intenso.
Naranja de acridina: incide luz azul y emite luz verde. Las células aparecen teñidas en verde y
rojo/naranja.

Ventajas:
✓ Fáciles
✓ Ampliamente utilizados
✓ Rápidos

Desventajas:
No permiten distinguir células vivas de muertas.
Se requieren altas densidades.
Hablemos en primer lugar del recuento de células con cámaras de recuento. En ellas tenemos
un portaobjetos con una rejilla o cámara en la que se carga una gota de suspensión en el borde
y entra por capilaridad. Después se cuentan al microscopio las células presentes en la
cuadrícula y se calcula el número de células por mL de muestra, teniendo en cuenta el volumen
de las cuadrículas contadas. En prácticas utilizamos la cámara de búnker: contamos los
cuadraditos y sabemos el volumen que entra en cada cuadradito; contamos y hacemos la
media. Tenemos que tener en cuenta si hemos hecho una dilución, en cuyo caso multiplicamos

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por el factor de dilución. Para que un recuento sea fiable sólo podemos tener entre 10 y 20
células en cada cuadrado.

Sin embargo, existe otro método: el recuento directo por microscopía de epifluorescencia.
Consta de los pasos siguientes: en primer lugar, teñimos la muestra con colorantes
fluorescentes como naranja de acridina, DAPI (diamidino fenil indol), SYTO o SYBR GREEN;
después, pasamos la muestra por un filtro negro con un poro de 0.2 micrómetros y lo llevamos
a un microscopio de epifluorescencia. Entonces contamos el número de microorganismos por
campo (que es lo que veo por el microscopio). Se suelen contar unos 20 campos y se hace la
media y como conocemos la superficie del campo y la del filtro podemos calcular el factor (color
azul en la fórmula) y con él calcular X siguiendo la fórmula.

El tercer tipo de procedimiento que podemos utilizar es un recuento de las UFC viables.

Ventajas:
✔ Fácil

Desventajas:
Elección del medio de cultivo
Infraestimación por agregados

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Un último método dentro de los de recuento de células es empleando un citómetro de flujo,
que es un contador electrónico. Las células se alinean y pasan por un fino tubo sobre el que
incide un rayo láser. Cada vez que pasa una célula la luz dispersada y transmitida es recogida
por fotodetectores. Este tipo de procedimiento permite contar y separar poblaciones según sus
características. Además pueden llevar acoplado u medidor de fluorescencia, en cuyo caso las
células se teñirán con colorantes fluorescentes si no tienen autofluorescencia. Hay ciertas
tinciones que permiten distinguir entre células muertas y vivas utilizando como criterio de
muerte la membrana dañada.

Medida de biomasa-peso seco

Consiste en pesar la biomasa seca correspondiente a un volumen determinado. Las unidades
son peso/volumen. Primero centrifugamos Y ml de muestra, retiramos el sobrenadante.
Resuspendemos el pellet en un ml de agua. A continuación, cogemos y un cestillo vacío y lo
pesamos (X0). Después, lo llenamos con nuestra muestra, lo secamos a 105ºC durante 24h y
pesamos el cestillo con la biomasa seca (X, en gramos).

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