ÍNDICE

1. IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA……………………………………………….Pág. 3
1.1. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS………………………….Pág. 4
1.2. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS…………………………Pág. 5
1.3. CULTIVO……………………………………………………………………Pág. 6
1.4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS……………………………………………Pág. 6
1.4.1. Pruebas inmediatas…………………………………………….Pág. 7

2. CASOS PRÁCTICOS……………………………………………………………….Pág. 9

3. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..Pág. 13

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 1. IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

La identificación de microorganismos, de forma convencional analiza las cualidades

fenotípicas, que incluyen aspectos relacionados con la morfología y fisiología, así como
aspectos químicos y bioquímicos.

El cultivo sigue siendo el método diagnóstico que prevalece, ya que permite al mismo
tiempo el aislamiento, la identificación y la realización de antibiogramas, y favorece la
aplicación de marcadores epidemiológicos (Fernández et al., 2010). No obstante, es una
limitación para aquellos microorganismos que no son cultivables, por lo que
actualmente, también se desarrollan técnicas de ADN y su posterior estudio molecular
para poder conocer este tipo de microorganismos (Gamboa, 2014).

Para que la identificación fenotípica sea correcta, es imprescindible mantener la pureza

de la cepa objeto de estudio, ya que cualquier contaminación externa o mezcla de
colonias podría suponer resultados erróneos. En este aspecto, hay dos factores muy
importantes:
- Se debe seleccionar el medio o medios de cultivo adecuados en función del
microorganismo que se vaya a sembrar, incluyendo medios selectivos si fueran
útiles para el caso. No hay ningún medio universal que permita el crecimiento de
todos los microorganismos, por lo que una misma cepa se siembra en diferentes
tipos de medio.
- Es preciso controlar los diferentes factores ambientales que influyen en el
cultivo, entre los que se encuentra la temperatura, atmósfera de incubación y
pH.

Tradicionalmente, se establecen tres niveles para la identificación de microorganismos.

En primer lugar, se realizan pruebas primarias, rápidas y sencillas. En segundo lugar, se
identificará el género, teniendo en cuenta las pruebas primarias anteriores y las
características del cultivo. En tercer lugar, se identificará la especie (Fernández et al.,
2010).

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En las pruebas primarias, se utiliza, por ejemplo, la tinción de Gram, la comparación del
crecimiento en los distintos tipos de medios de cultivo, oxidasa y catalasa. De esta
forma, se pueden apreciar las características morfológicas, como el color, la forma, el
tamaño o el olor, así como la observación de las características de las células. Una
interpretación errónea de estas pruebas primarias puede dar lugar a una mala
identificación fenotípica, que conllevará un mal diagnóstico para el paciente.

Para la identificación de la especie y la confirmación de los caracteres fenotípicos es

necesario realizar pruebas fisiológicas y bioquímicas más amplias, incluyendo en
ocasiones métodos moleculares (genotípicos).

1.1. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

Aunque como vimos en temas anteriores existen muchos tipos de tinciones, lo más usual
es realizar una tinción de Gram para poder observarla después con el microscopio
óptico. Con esta tinción podemos apreciar la forma y el tamaño de las bacterias (cocos,
bacilos, espiroquetas, etc.) y su agrupación (en cadena, en pareja, en tétradas, racimos,
etc.). Además, podemos clasificar las bacterias según sean Gram+ o Gram-, lo que nos
permitirá establecer una primera aproximación al tipo de bacteria presente y a su
tratamiento.

Figura 1. Cuadro resumen tinción de Gram (Pírez y Mota, 2006).

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 1.2. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

Dentro de estas características se encuentran la morfología de las colonias y la capacidad

de hemólisis.
- Características morfológicas de la colonia: hace referencia al tamaño, la forma,
la elevación sobre el medio de cultivo o el color, entre otros.

Tabla 1. Características morfológicas de la colonia. Elaboración propia

(Wordpress, 2009).
En medio sólido
Forma Bordes Elevación Superficie
Circular Entero Plana Lisa o rugosa

Puntiforme Ondulado Convexa Cremosa o

membranosa

Irregular Lobulado Elevada Mate o

brillante

Rizoide Crateriforme
Filamentoso
Invasiva o

Fusiforme Acumianda superficial

En medio líquido
Turbidez Película Sedimento

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 - Hemólisis: al utilizar medios de cultivo que contiene sangre, algunas colonias
pueden generar este fenómeno. Se debe a la producción de hemolisinas por las
bacterias, que producen la lisis de los hematíes (Fernández et al., 2010).

Imagen 1. Hemólisis de Streptococcus. Izquierda: alfa hemólisis (parcial) por S. mitis; centro: beta
hemólisis (total) por S. pyogenes; derecha: gamma hemólisis (sin hemólisis) por S. salivarius.

1.3. CULTIVO

Las características del crecimiento de colonias en los diferentes medios y agares, en las
distintas atmósferas de incubación, etc., ayudan a la identificación.

Es posible realizar una identificación preliminar de muchas de las bacterias de relevancia

clínica, a partir de las características macroscópicas de las células dispuestas en colonias
sobre los medios de cultivo en los que crecen y se aíslan después de una incubación de
unas 24-48 horas (López et al., 2006).

1.4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Las pruebas bioquímicas permiten conocer las características metabólicas de las

bacterias. Existen las que ponen de manifiesto la presencia de una enzima preformada
y las que evalúan la capacidad de crecimiento en presencia de ciertos factores o de
metabolizar algunos sustratos presentes en el medio. Se pueden agrupar en cuatro
categorías: pruebas inmediatas, pruebas rápidas (lectura en periodo inferior a 6 horas),
pruebas diferidas (lectura en 18-48 horas) y pruebas de sensibilidad/resistencia.

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 1.4.1. Pruebas inmediatas
- Catalasa
Es una enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen citocromos1.
La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y el oxígeno que libera se puede
observar en forma de burbujas. Esta prueba se utiliza para separar, por ejemplo, los
cocos con catalasa positiva como Staphylococcus spp. de Streptococcus spp. y
Enterococcus spp. que son de catalasa negativa.
Puede llevarse a cabo colocando 2 o 3 gotas de la solución de peróxido de hidrógeno
sobre el cultivo o cogiendo una pequeña muestra del cultivo para depositarla en un
porta con la solución. El resultado es positivo si aparece efervescencia.

Imagen 2. Prueba de la catalasa positiva (arriba) y catalasa negativa (abajo) (Universidad Miguel
Hernández).

- Oxidasa
Es la prueba que se utiliza para detectar la presencia de enzimas oxidasas. En ella se
activa la pxidación del citocromo, que reduce el oxígeno molecular y se produce agua o
peróxido de hidrógeno. Solo se da en las bacterias aerobias y algunas microaerófilas
pero no ocurre en las anaerobias. Por otra parte, las bacterias que producen oxidasa
también producen catalasa para poder degradar el peróxido de hidrogeno. Por ejemplo,
la Pseudomonas aeruginosa seria oxidasa positiva mientras que las enterobacterias
serian oxidasa negativa.
Para la realización de esta prueba se utilizan unas tiras de papel impregnadas con el
reactivo para-amino-N-dimetil-anilina, que se oxida en presencia de la citocromo-

1Citocromo: proteína transferidora de electrones, que contiene hierro e interviene en la respiración

celular (Diccionario médico CUN).

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oxidasa. Se lleva una porción de las bacterias de la colonia a la zona coloreada de la tira
y se espera alrededor de un minuto para observar si la zona impregnada ha cambiado
hacia un color azul-violeta.

Imagen 3. Prueba de la oxidasa positiva (derecha) y oxidasa negativa (izquierda) (Universidad Miguel Hernández).

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 2. CASOS PRÁCTICOS

Las siguientes imágenes han sido tomadas en el laboratorio de microbiología del

Hospital de la Ribera durante la realización de las prácticas en centros de trabajo. Del
mismo modo, la información ha sido recopilada a partir de las explicaciones realizadas
por un médico residente en microbiología, adaptándolo al contenido de nuestro
temario. Además de las tinciones, cultivos y pruebas inmediatas se han realizado otras
pruebas que al no ser objeto del trabajo no se han explicado, hasta llegar al diagnóstico
final.

- Staphylococcus aureus

Cuando llega al laboratorio un exudado de una ulcera se siembra en diferentes medios

de cultivo a la vez que se pone muestra en un portaobjetos para realizarle la tinción de
Gram.
En este caso, al observar la tinción con el objetivo 100x se podían observar estafilococos
dentro de los leucocitos. Al ser cocos Gram positivos tienen forma redonda y se tiñen de
color morado.

Imagen 4. Estafilococos dentro de un leucocito.

En los cultivos, en el agar chocolate crecieron colonias de color blanco con el centro de
color amarillo, lo que indicaba que posiblemente se tratara de Staphylococcus aureus.

Imagen 5. Colonia de Staphylococcus aureus.

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Además, la prueba de catalasa dio positivo, lo que continuaba confirmando la presencia
de este microorganismo.

- Pseudomonas spp.

En este caso, la muestra era un broncoaspirado (BAS). En la tinción se podían observar

bacilos dispuestos en cadenas. Se sospechaba que podían pertenecer al género
Pseudomonas ya que eran bacilos Gram negativos y formaban cadenas de pequeños
eslabones.

Imagen 6. Pseudomonas spp. objetivo 100x.

En los cultivos, el color negro formado por las colonias en la placa de chocolate, su olor
dulce y el color verde azulado formado en el antibiograma en agar Muller-Hinton seguía
enfocando hacia una infección por Pseudomonas spp.

Imagen 7. colonias de Pseudomonas spp. Imagen 8. Antibiograma de Pseudomonas spp.

Al realizar la prueba de la oxidasa salió un resultado positivo, de oxidasa positiva rápida.

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 Imagen 9. Oxidasa de Pseudomonas spp.

- Clostridium perfringens

Se trata de una bacteria muy reconocible a nivel de cultivo, por su anaerobiosis estricta,
por la doble hemolisis que forma en el agar sangre para anaerobios y por ser muy
sensible a la penicilina, como se puede observar en el antibiograma.

Imagen 10. Antibiograma de Clostridium perfringens.

- Haemophilus spp.

En este caso, el hecho de que solo crezca en agar chocolate (se sembró también en
MacConkey) por ser un microorganismo exigente, el color gris de las colonias y su olor
putrefacto por el consumo de nitrógeno en lugar de oxígeno enfocaba a la presencia de
este cocobacilo Gram negativo.

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 Imagen 11. Colonias de Haemophilus spp.

Además, la prueba de oxidasa salió positiva, se trata de oxidasa positiva lenta.

Imagen 12. Oxidasa de Haemophilus spp.

- Streptococcus spp.

Por último, en el siguiente antibiograma se observa un cultivo de estreptococos. A nivel

clínico, cuando llega una muestra respiratoria interesa aislar el Streptococcus
pneumoniae. En este caso se confirma que no es esta especie ya que el estreptococo
presente es resistente a la optoquina (antibiótico de uso diagnóstico), y el Streptococcus
pneumoniae es sensible a este antibiótico.

Imagen 13. Antibiograma con disco de optoquina.

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 3. BIBLIOGRAFÍA

Fernández Olmos, A., García, C., Sáez Nieto, J. A. y Valdezate, S. (2011). Métodos de
identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Enfermedades
infecciosas y microbiología clínica, 29(8), 601-608.

Gamboa F. (2014). Identificación y caracterización microbiológica, fenotípica y

genotípica del Streptococcus mutans: experiencias de investigación. Univ.
Odontol. 33(71): 65-73.

López Hontangas, J. L., Castillo, F. J. y Salavert, M. (2006). Técnicas de identificación.

Microbiología aplicada al paciente crítico. Bogotá: Distribuna, 27-41.

Pírez, M. y Mota, M. (2006). Morfología y estructura bacteriana. Temas de bacteriología

y virología médica, 23-42.

Unidad 6. identificación fenotípica: observación, pruebas bioquímicas y métodos

químicos.

Wordpress (marzo de 2009). Morfología de las colonias bacterianas.

https://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-las-colonias-
bacterianas.pdf

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