Guía Unificada de Laboratorios Código FLA-23 v.

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Departamento de Bacteriología y Lab. Clínico
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1. Título

Guía 8. Actividad enzimática de las bacterias

2. Objetivo

Determinar la habilidad de las bacterias para producir enzimas, muchas de ellas

extracelulares, para permitirle degradar moléculas de alto peso molecular, invadir tejidos,
colonizar o evadir sistemas de defensa de hospederos. La utilización de estas
características a través de pruebas in vitro permiten la identificación bacteriana.

2.1Objetivos Específicos

- Identificar algunas enzimas producidas por bacterias realizando pruebas in vitro.

- Interpretar y reportar las reacciones bioquímicas que ocurren en cada prueba de
forma tal que se articulen a esquemas para identificación bacteriana.

3. Marco Teórico

Moléculas de gran tamaño y alto peso molecular son incapaces de atravesar libremente la
membrana celular bacteriana, así los polisacáridos, lípidos y proteínas presentes en el
medio externo de la bacteria necesitan ser hidrolizados por enzimas específicas hasta
monómeros estos puedan atravesar o ser transportados por diversos mecanismos al
interior celular, utilizándose entonces como fuente energética o como elementos para
biosíntesis de sus constituyentes.

Realmente no siempre los compuestos nutritivos están disponibles en el medio, cuando

un microorganismo coloniza otro organismo, necesita multiplicarse para pasar de una
colonización a desarrollar un proceso infeccioso; si el sistema de defensa del hospedero
no es capaz de eliminarlo, éste hará uso de su maquinaria enzimática para sobrevivir y
para tomar los nutrientes disponibles.

La clasificación de las bacterias está basada principalmente en la producción de las

diferentes enzimas, las cuales son codificadas por el material genético del cromosoma
bacteriano. Estas enzimas giran el metabolismo de las bacterias a lo largo de las diversas
vías que pueden detectarse a través de los medios especiales utilizados en las técnicas
de cultivo in Vitro. Los substratos sobre los cuales estas enzimas pueden actuar se
incorporan al medio de cultivo, junto con un sistema indicador que se pueda detectar por
ejemplo la declinación del sustrato o la presencia de productos metabólicos específicos.

Algunas de estas enzimas producidas por bacterias médicamente importantes son:

catalasa, coagulasa, ureasa, citocromo oxidasa, hemolisinas, amilasa, DNAsa,
gelatinasa, lecitinasa y lipasa.
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PRUEBA DE CATALASA
Fundamento
La catalasa es una enzima que descompone el Peróxido de Hidrógeno (H2O2) en Oxígeno
y agua. El peróxido de Hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
catabolismo aeróbico de los azucares (respiración aeróbica). Si se deja acumular, el
peróxido de Hidrógeno es letal para las células bacterianas. Esta prueba se emplea
principalmente para diferenciar bacterias del género Staphylococcus que son catalasa
positiva del género Streptococcus que no produce esta enzima.

Técnica
Con un palillo estéril, transferir células del centro de una colonia separada a la superficie
de un portaobjeto limpio.
Añadir 1-2 gotas de peróxido de Hidrógeno al 3% (o agua oxigenada de 70 volúmenes) y
mezclar.

Interpretación
La rápida aparición y producción de burbujas de gas o efervescencia por desprendimiento
de oxígeno, indica una prueba positiva.

Causas de error
La prueba no debe hacerse sobre colonias crecidas sobre agar sangre, ya que los
eritrocitos poseen catalasa y podría obtenerse así un resultado falso positivo.
Emplear cultivos de 24 a 48 horas, cultivos de mayor tiempo tienden a disminuir la
actividad enzimática detectada.
No emplear asas para transferir la muestra al portaobjetos, el platino propicia resultados
falsos positivos.

Controles
Control positivo Staphylococcus sp.
Control negativo Streptococcus sp.

PRUEBA DE LA COAGULASA
Fundamento
La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de
transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un
sistema analítico adecuado. Cuando una suspensión de bacterias productoras de
coagulasa se mezcla en partes iguales con una pequeña cantidad de plasma en un tubo
de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los
factores de la coagulación de manera similar a cuando se añade trombina.
El 100% de las cepas de Staphylococcus aureus tienen la propiedad de producir esta
enzima que coagula el plasma humano y el de algunos mamíferos.
Se han descrito dos formas de coagulasa: coagulasa unida a la pared bacteriana y
coagulasa libre.
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Técnica Prueba de Coagulasa libre

Colocar asépticamente 0.5 mL de plasma humano fresco recolectado con anticoagulante
EDTA en un tubo estéril.
Añadir al tubo estéril con el asa previamente esterilizada 2 a 3 colonias de un cultivo
axénico del microorganismo a identificar.
Mezclar por rotación suavemente y colocar el tubo en baño maría o incubadora a 37°C.
Observar cada 30 minutos hasta las 4 horas para observar la formación de coágulo.

Interpretación
La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del
tubo. Las bacterias fuertemente coagulasa positiva puede producir un coágulo en 1 a 4
horas, se recomienda observar cada 30 minutos. Todas las pruebas negativas a las 4
horas deben observarse de nuevo después de 18 –24 horas de incubación.

Técnica Prueba de coagulasa unida a la pared

Colocar una gota de solución salina 0.9% estéril sobre un portaobjetos limpio, con el asa
bacteriológica tomar varias colonias del microorganismo a identificar y emulsionarlas.
Colocar luego una gota de plasma fresco y mezclar completamente.
Rotar el portaobjeto.

Interpretación
La inmediata formación de grumos indica la presencia de la enzima coagulasa.

Causas de error
La prueba debe leerse antes de 24 horas, porque hay algunas cepas de Staphylococcus
aureus que producen fibrinolisinas que pueden destruir el coágulo formado.

Controles
Control positivo Staphylococcus aureus
Control negativo Staphylococcus epidermidis

PRUEBA DE LA UREASA
Fundamento
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos que pueden
hidrolizar la urea produciendo amoníaco, CO2 y agua. El amoníaco reacciona en solución
para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento de pH
del medio.

Técnica
La prueba se puede realizar en agar o caldo Urea. El color inicial del medio: amarillo
anaranjado.
En el medio sólido sembrar por estría el microorganismo en estudio. En el medio líquido
sembrarlo por emulsión. Incubar a 37°C por 24 horas.
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Interpretación
Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones positivas en 1-2
horas dando un color fucsia en el medio por viraje del indicador de pH. Una prueba
negativa presenta un color amarillo-anaranjado en el medio.

Controles
Control positivo Klebsiella pneumoniae, Proteus sp.
Control negativo Escherichia coli

PRUEBA DE CITOCROMO OXIDASA

Fundamento
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón
de la cadena respiratorio aerobia, transfiriendo electrones con formación de agua. El
sistema citocromo se encuentra en los organismos oxigénicos y anoxigénicos facultativos,
de modo que la prueba sirve para identificar a aquellos organismos que carecen de la
enzima o son anoxigénicos obligados.

La prueba citocromo oxidasa utiliza ciertos reactivos colorantes, como el diclorohidrato de

p-fenilendiamina, que actúa como aceptor artificial de electrones, sustituyendo al oxígeno.
La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo
oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

Técnica
La prueba se realiza en tiras o en discos de papel, en los que se añade unas gotas del
reactivo de oxidasa, o en tiras, discos o pastillas comerciales impregnados con reactivos,
en seco. En la zona del papel donde se halla el reactivo se extiende con un palillo estéril
una parte de la colonia a identificar.

Interpretación
Las colonias bacterianas con actividad de citocromo oxidasa desarrollan en segundos un
intenso color azul-violeta en el sitio del extendido.

Causas de error
No se debe utilizar asas metálicas para realizar la prueba de citocromo oxidasa, ya que se
pueden dar una prueba falsa positiva debido al desprendimiento de iones metálicos.
Se recomienda no probar colonias crecidas en medios que contengan glucosa, si es un
microorganismo facultativo podría realizar metabolismo fermentativo y dar falsos
negativos.
Evitar la auto oxidación de los reactivos de oxidasa guardándolos en refrigeración y en
frasco ámbar protegidos de la luz.

Controles
Control Positivo Pseudomonas sp.
Control negativo Escherichia coli
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PRODUCCIÓN DE HEMOLISINAS
Fundamento
La hemólisis es un fenómeno que se observa cuando algunas cepas se siembran en Agar
sangre causado por enzimas llamadas hemolisinas. La hemólisis puede ser alfa o beta o
no presentarse (hemólisis gamma).

Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial; alrededor de la colonia se observa una coloración
de verde a marrón por la salida de los iones potasio de los glóbulos rojos. Ejemplo:
Streptococcus pneumoniae

Hemólisis beta: Es una hemólisis total; se observa una zona clara traslúcida alrededor de
la colonia. Ejemplo: Staphylococcus aureus

PRODUCCIÓN DE AMILASA
Fundamento
Las amilasas son enzimas producidas por algunas bacterias capaces de hidrolizar el
almidón para producir glucosa.

Técnica
Sembrar 2 estrías (según esquema) de una colonia de un cultivo axénico del
microorganismo en estudio en una caja de Agar almidón. Incubar a 37°C por 24 horas. La
prueba se lee adicionando 3 a 5 gotas del reactivo de Lugol de Gram después de las 24
horas de incubación.

Interpretación
Una zona clara adyacente al crecimiento bacteriano indica una prueba positiva. El almidón
no hidrolizado toma un color azul oscuro al formar un complejo con el yodo, indicando una
prueba negativa.

Controles
Control positivo Bacillus cereus.
Control negativo Pseudomonas aeruginosa.
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PRUEBA DE DNasa
Fundamento
Microorganismos productores de desoxirribonucleasa hidrolizarán el ADN presente en el
medio de cultivo, característica que ayuda a la identificación de microorganismos

Técnica
Sembrar a partir de un cultivo joven realizando un cuadrado o una estría de los
organismos a prueba según la gráfica e Incubar por 18 a 24 horas a 37°C:

Interpretación
A las 24 horas adicionar 1 ml de ácido clorhídrico 1 N, en medio ácido el ADN se precipita,
por lo tanto si se presenta hidrólisis del ADN contenido en el medio este se observará
como un halo claro alrededor del crecimiento. Reportar DNasa positivo o negativo según
presente zona clara alrededor del crecimiento.

Controles
Positivo Staphylococcus aureus, Serratia marcescens.
Negativo Escherichia coli.

PRUEBA DE GELATINASA
Fundamento
La capacidad de ciertas bacterias para producir enzimas proteolíticas de tipo gelatinasa
se detecta por la capacidad de digerir o licuar la gelatina presente en el medio de cultivo.
Esta capacidad de catabolizar la gelatina es una característica que ayuda a la
identificación bacteriana.

El catabolismo de la gelatina ocurre en dos etapas:

1.

2.

Técnica
Guardar en el refrigerador hasta el momento de su inoculación los medios de cultivo
preparados. Verifique el medio de gelatina (el cual contiene una concentración de 12% de
gelatina) antes de sembrar, debe encontrarse sólido, sembrar por punción a una
profundidad aproximada de 2 cm.
Incubar a 22-25°C o a 37°C por 24 horas.
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Interpretación
Pasadas las 24 horas pasar los tubos, sin agitarlos, a un refrigerador o un baño de hielo
por 2 horas. Observar si hay crecimiento (turbiedad) y licuefacción. Algunos
microorganismos realizan este proceso en forma lenta, por lo tanto si no observa
licuefacción o digestión, reincubar hasta por 2 semanas y realizar la lectura de la misma
forma. Informar como gelatinasa positiva o negativa según se observe licuefacción o no
de la gelatina.

Controles
Control positivo Staphylococcus aureus, Serratia marcescens,
Pseudomonas aeruginosa.
Control negativo Escherichia coli.

PRUEBA DE CAMP
Fundamento
El factor CAMP es una sustancia extracelular produ cida por Streptococcus Beta
hemolíticos del grupo B-(Streptococcus agalactiae). Esta sustancia tiene la propiedad de
aumentar la hemólisis de los glóbulos rojos en presencia de la beta lisina estafilocóccica.

Técnica
Se realiza una estría sobre un agar sangre de la cepa de Streptococcus a identificar, en
forma perpendicular realiza otra estría de una cepa de Staphylococcus aureus productora
de betalisina. Las dos líneas no deben tocarse (Ver esquema). Incubar a 37°C por 24
horas.

Interpretación
El ensanchamiento de la hemólisis en punta de flecha en la intersección de las dos estrías
indica una prueba de CAMP positiva para el Streptococcus beta hemolítico a identificar, el
cual corresponderá según este resultado a un Streptococcus del grupo B (Streptococcus
agalactiae).

Controles
Control positivo Streptococcus agalactiae
Control negativo Enterococcus sp.
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4. Materiales, equipos e Insumos

Equipos:
 Incubadora
 Centrífuga

Materiales:
 Implementos de bioseguridad: guantes, careta o gafas de protección, bata manga
larga.
 Asas bacteriológicas
 Cinta de enmascarar
 Mechero de bunsen
 Agujas para toma de muestras
 Fósforos
 Láminas portaobjeto
 Lápiz marcador
 Palillos estériles
 Pipetas pasteur estériles
 Torniquete
 Torundas de algodón
 Tubos 13 x 100 con tapón de algodón estériles
 Tubos de ensayo con 100 μl de anticoagulante EDTA.

5. Reactivos y Medios de cultivo

 Ácido clorhídrico 1N
 Alcohol antiséptico
 Lugol de Gram
 Peróxido de Hidrógeno 3%
 Plasma estéril
 Reactivo de Oxidasa ó Tiras de oxidasa
 Solución salina 0.9%
 Medios de Cultivo: Agar sangre, Agar Urea, Agar almidón, Agar DNAsa, Medio gelatina
 Cepas en Agar sangre y Agar nutritivo de: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
saprophyticus, Streptococcus viridans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae, Enterococcus sp., Bacillus cereus, Serratia marcescens, Escherichia coli
Proteus sp..
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6. Procedimiento

Primer día:
1. Prueba de catalasa:
Con un palillo estéril transfiera 1-2 colonias del cultivo axénico de Staphylococcus aureus
en la superficie de una lámina portaobjeto limpio. Añada 2 gotas de peróxido de
Hidrógeno al 3%. Observe la aparición de burbujas.
Realice el mismo procedimiento con el control negativo: Streptococcus sp
Lea, interprete y registre el resultado de las pruebas.

2. Prueba de la coagulasa:
Obtenga plasma humano en condiciones de esterilidad. En un tubo estéril con tapón de
algodón coloque 0.5 mL del plasma recolectado e inocule 2-3 asadas del cultivo axénico
de Staphylococcus aureus. Coloque en baño maría o incubadora a 37°C por 2-4 horas.
Observe la formación de coágulo. Si la prueba es negativa a las 4 horas, reincube 18
horas a temperatura ambiente. Realice el mismo procedimiento con el control negativo:
Staphylococcus epidermidis.

3. Prueba de ureasa:
Realice siembra por estría de una colonia del cultivo axénico de Klebsiella pneumoniae en
un tubo con Agar urea o inocule por asadas si es caldo urea. Incube a 37°C por 24 horas.
Realice el mismo procedimiento con el control negativo:

4. Prueba de oxidasa:
Con un palillo estéril transfiera 1-2 colonias del cultivo axénico de Pseudomonas
aeruginosa a la tira reactiva impregnada del reactivo de oxidasa. Observe la aparición de
un color azul-violeta.
Realice el mismo procedimiento con el control negativo: Escherichia coli.
Lea, interprete y registre el resultado de las pruebas.

5. Producción de hemolisinas:
Realice siembra por agotamiento en Agar sangre de Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, y Streptococcus viridans. Incube a
37°C por 24 horas.

6. Prueba de DNasa:
Realice una siembra en Agar DNAsa de Staphylococcus aureus o Serratia marcescens
según el diagrama e incube a 37°C por 24 horas.
Realice el mismo procedimiento con el control negativo Escherichia coli.

7. Producción de amilasas:
Realice una estría en el centro de la caja de Agar Almidón a partir de un cultivo axénico
de Bacillus cereus. Incube a 37°C por 24 horas.
Realice el mismo procedimiento con el control negativo: Pseudomonas aeruginosa.
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8. Prueba de CAMP
Siembre en una caja de Agar Sangre la cepa de Streptococcus agalactiae practicando
una sola estría, en la mitad de la caja, luego en forma perpendicular siembre una estría de
la cepa de Staphylococcus aureus (productora de betalisina) teniendo la precaución que
las dos estrías no se unan pero que queden lo suficientemente cerca la una de la otra.
Incube a 37°C por 24 horas.
Realice el mismo procedimiento con el control negativo: Enterococcus sp

Segundo día
Lea, interprete y registre el resultado de las pruebas de Ureasa, producción de
hemolisinas, DNAsa, amilasas y prueba de CAMP.
 Ureasa: Observe el cambio de color del medio e interprete la reacción ocurrida.
 Hemolisinas: Observe el crecimiento y tipo de hemólisis que presenta cada uno de
los cultivos. Clasifique la hemólisis producida por cada una de las cepas
bacterianas.
 DNasa: Adicione 1 mL de HCL 1 N y observe si hay o no zonas claras alrededor
del crecimiento.
 Amilasas: Adicione 3-5 gotas del reactivo de Lugol de Gram sobre las estrías y
observe si hay o no zonas decoloradas, las cuales indican hidrólisis del almidón.
 Prueba de CAMP: Observe la hemólisis producida e interprete los resultados.

Informe: Reporte y analice los resultados obtenidos.

Causas de error
Mala interpretación de las reacciones ocurridas en cada prueba.
Se puede presentar contaminación en los medios de cultivo, y en las diversas pruebas por
diversas razones como: no trabajar adecuadamente, no esterilizar las asas
bacteriológicas correctamente, no utilizar tapabocas al realizar las siembras.

7. Nivel de Riesgo

Nivel 2 (Riesgo Medio)

8. Bibliografía

Koneman, E. et al. 2003. “Diagnóstico microbiológico”. Argentina. 5a edición. Editorial

Médica Panamericana
CULTIMED. Manual básico de Microbiología en:
http://www.ictsl.net/downloads/microbiologia.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF
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9. Anexos

CONSULTA
1. Describa composición de cada uno de los medios de cultivo empleados en la
práctica, tenga en cuenta los sustratos e indicadores de pH
2. Cuál es el fundamento, técnica e interpretación de la prueba de producción de
Lecitinasa.
3. Mencione los principales indicadores de pH que contienen los medios de cultivo
bacteriológicos, y describa el color de cada uno de ellos en la escala de pH.