Espectrofotometría ultravioleta

visible
de absorción molecular
Generalidades de métodos espectrométricos y expectroscopía de
absorción molecular UV-Vis
 REM en el rango UV-Vis e infrarrojo cercano

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf

 Transmisión y color

Transmisión y color
Similar al detector espectrofotométrico, el ojo humano ve la luz transmitida
que viaja a través de o es reflejada de una superficie. El humano percibe esto
como el color de un objeto
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
Absorción y colores complementarios
Longitud de onda
Color absorbido Color complementario
(nm)

La longitud de onda de la luz asociada con diferentes colores (izq) y el color de luz absorbido y los
colores complementarios asociados que son los observados por el ojo humano (der).
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
Contenido
•Generalidades de métodos instrumentales
•Espectroscopía UV-Vis de absorción
molecular
• Instrumentación Estado
electrónico

• Beer-Lambert
excitado

Estado
electrónico
basal

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf

 Instrumentación para el análisis

determinación del analito o su

derivado
Mayor desarrollo de la
instrumentación
expresión y verificación de
resultados

1. Sistema generador de señales

2. Sistema detector y convertidor

4 componentes básicos
3. Sistema procesador

4. Sistema indicador
Instrumentación para el análisis: componentes de un instrumento típico

1. 2. 3. 4. Sistema
indicador
 SISTEMAS DE DETECCIÓN Y CONVERSIÓN
Cantidad física medida Detector / Convertidor Salida eléctrica
Concentración de especies electroactivas Celda polarográfica Corriente
Actividad iónica en solución Electrodo selectivo de iones Voltaje
Fototubo
Intensidad luminosa Corriente
Fotodiodo
Termistor Resistencia
Temperatura
Termopar Voltaje
(Willard et al., 1991)
 SISTEMAS DE DETECCIÓN Y CONVERSIÓN
Cantidad física medida Detector / Convertidor Salida eléctrica
Concentración de especies electroactivas Celda polarográfica Corriente
Actividad iónica en solución Electrodo selectivo de iones Voltaje
Fototubo
Intensidad luminosa Corriente
Fotodiodo
Termistor Resistencia
Temperatura
Termopar Voltaje
(Willard et al., 1991)
 SISTEMAS PROCESADORES
Amplificación Conteo
Conversión digital-analógica Adición
Conversión analógica-digital Conversión corriente-voltaje
Filtrado Conversión voltaje-corriente
Atenuación Diferenciación (derivación)
Integración Conversión voltaje-frecuencia
Comparación Conversión logarítmica-aritmética
Rectificación Conversión antilogarítmica-aritmética
(Willard et al., 1991)

SISTEMAS INDICADORES
Impresoras alfanuméricas Osciloscopios
Medidores analógicos Registradores de tira continua (y-t)
Medidores digitales Registradores x-y
Discos duros (discos) Casetes de cinta
Discos flexibles (disquetes) Monitores de videovisualizadores de pantalla catódica
(Willard et al., 1991)
Considerar
• pH
• Temperatura
• Solvente
• Concentración
• Sustancias interferentes
• Propiedad a detectar: seleccionar óptimo
 Espectrofotometría óptica de absorción

Luz incidente I0 pasando a través de una muestra que transmite luz menor intensidad I
Modificado de:
https://jascoinc.com/learning-center/theory/spectroscopy/uv-vis-spectroscopy/#:~:text=green)%20reflectance%20components.-,UV%2DVisible%20Spectroscopy%20Instrumentation,element%2C%20sample%2C%20and%20detector.&text=The%20monochromator%20itself%20houses%20the%20mirrors%2C%20slits%2C%20and%20grating
Espectros de absorción
molecular en UV-Vis

Fig. 16.5. Espectro visible típico.

1, Muestra; 2, Blanco

©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley)

¿Qué información nos puede brindar un espectro?
1.Identificar moléculas en una muestra líquida o sólida
2.Determinar la concentración de un compuesto en
particular en la solución
3.Caracterizar la absorbancia o la transmitancia de luz
al pasar por un líquido o sólido en un rango de
longitudes de onda
4.Caracterizar las propiedades de reflectancia de una
superficie
5.Medir el color de un material
6.Estudiar las reacciones químicas
7.Estudiar procesos biológicos
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
¿Qué tipo de compuestos puedo detectar con
absorción en UV-vis?
• Deben contener grupos funcionales o partes en la molécula que
absorben REM
• Por ejemplo: compuestos conjugados (se indica la longitud de onda a
la que absorbe el compuesto, transición electrónica):

https://instruct.uwo.ca/chemistry/2223/downloads/chromphores.pdf
Cromóforos
Ejemplo: Conjugación (cromóforo) y grupos polares
(auxocromos, acentúa la absorción de REM)

Índigo (azul de los pantalones de lona)

https://instruct.uwo.ca/chemistry/2223/downloads/chromphores.pdf
Complejos organometálicos (transferencia de carga)
Hemoglobina

https://instruct.uwo.ca/chemistry/2223/downloads/chromphores.pdf
Ejemplos de grupos cromofóricos y longitudes de
onda de absorbancia máxima
Ejemplos de compuestos organometálicos
¿Y si no absorbe en UV-Vis?

• Entonces puede derivatizarlo para agregarle o

convertirle en un cromóforo
• Ejemplos:
Aplicaciones cuantitativas de la espectrometría de
absorción UV-Vis
Instrumentación
Se debe conocer la energía e intensidad del haz de
luz incidente y la intensidad del haz de luz saliente
https://www.youtube.com/watch?v=wS0va4G2UMA
Monocromador

Fuente de Luz Detector

Ranura de Elemento Ranura Muestra

Medición de
entrada dispersivo de salida en celda
luz
absorbida,
transmitida
Modificado de:
o reflectada
https://jascoinc.com/learning-center/theory/spectroscopy/uv-vis-spectroscopy/#:~:text=green)%20reflectance%20components.-,UV%2DVisible%20Spectroscopy%20Instrumentation,element%2C%20sample%2C%20and%20detector.&text=The%20monochromator%20itself%20houses%20the%20mirrors%2C%20slits%2C%20and%20grating
 Instrumentación para el análisis: componentes de un instrumento típico

1. 2. 3. 4. Sistema
indicador

Modificado de:
https://jascoinc.com/learning-center/theory/spectroscopy/uv-vis-spectroscopy/#:~:text=green)%20reflectance%20components.-,UV%2DVisible%20Spectroscopy%20Instrumentation,element%2C%20sample%2C%20and%20detector.&text=The%20monochromator%20itself%20houses%20the%20mirrors%2C%20slits%2C%20and%20grating
Fuente de luz

• Para iluminar una muestra con luz en el rango UV-vis

• La Fuente de luz produce un amplio rango de REM
• Lámpara de D2 y de X-W requieren calentamiento
previo
• Lámpara de Xenon no require calentamiento, amplio
espectro, más cara y delicada
 Lámpara de deuterio Fuente de luz
(UV principalmente)
Espectro de intensidad de la
lámpara de arco de deuterio

Lámpara de halógeno-
tungsteno (visible)
Espectro de intensidad de la
lámpara de halógeno-tungsteno

Lámpara de Xenon
(UV + vis)
Espectro de intensidad de la
lámpara de xenón
Monocromador
(contiene elemento dispersivo)
• Separa la luz “blanca” en longitudes de onda.
• El amplio espectro es reducido a determinadas bandas o regiones
seleccionadas.
• Partes:
1. Ranura de entrada
2. Elemento dispersivo (para distribuir la luz en diferentes l, y permitiendo
selección de determinadas bandas a l, gradilla holográfica )
3. Ranura de salida, donde la luz a determinadas bandas de l pasa a través de
la ranura y es dirigida a la muestra.

Gradilla holográfica: vidrio con ranuras del tamaño de las li y un

recubrimiento de aluminio para reflector la luz.
Gradilla holográfica
dispersando luz blanca en
luz de diferentes l

Gradilla holográfica: vidrio con ranuras del tamaño de las li y un recubrimiento de

aluminio para reflector la luz. Puede haber más de una.
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
Espectrofotómetro de un haz de luz

• Es el espectrofotómetro UV-vis más simple • Requiere lectura de blanco separada (línea

• La luz del monocromador pasa a través de base)
la muestra y luego al detector • Reducida exactitud por variaciones en la
• Contiene menos componentes ópticos intensidad de luz
• Permite un equipo de tamaño reducido • Entre la medición del blanco y de la
• Menor costo muestra.
Efecto en análisis en el que requieren lecturas largas el blanco
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf varía con el tiempo
Diagrama óptico de espectrofotómetro de dos haces
de luz y dos detectores

• La luz emitida del monocromador es dividida en dos haces:

un haz de referencia y un haz de muestra.
• La luz es dividida por el divisor de luz (beam splitter): una
rueda giratoria con un segment de espejo.
• La transmitancia de la muestra y del blanco pueden ser
medidas al mismo tiempo.
Correcciones por fluctuaciones en tiempo real
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
Incrementa la exactitud de la medición.
Área de muestra o compartimiento de muestra
• El haz de luz que sale del monocromador pasa a través de la muestra
ubicada en una “caja negra” para reducir interferencias por luz ajena.
• La muestra es usualmente contenida en celdas o cubetas de
dimensiones conocidas y fijas. E.g. 10 mm
• Volumen: variable.
• Pueden ser de
• Cuarzo: excelente transmitancia de luz UV y Vis.
• Vidrio, plástico u otro material: aceptable transmitancia en rango visible.

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf

¿Cómo sé que una celda sirve para un rango de luz determinado?
Transparencia de materiales comúnmente Ventanas de transparencia de varios
utilizados para celdas ópticas. materiales comúnmente utilizados
para celdas ópticas
suprasil

plástico vidrio
óptico

Longitud de onda, l (nm)

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
 Celdas especiales

0.5 mL celda semi-micro

0.5 uL celda ultra-micro
Cuvetas enmascaradas para asegurar que el haz de luz pase a Celdas de flujo
través de la muestra.
La altura z de la cuveta es compatible con el espectrofotómetro
es crítico

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf

Algunas recomendaciones en el manejo de
celdas ópticas
• Los aceites de las huellas digitales absorben en UV-vis…
• Limpieza con papel especial, sin sustancias extra
• No usar HF en celdas de cuarzo porque las disuelve
• Soluciones a pH mayores de 9 reducen el tiempo de vida de
la celda
• Remover muestra de la celda lo antes possible par evitar que
se evapore dentro de la celda. Enjuáguela profusamente.
• Tape la muestra una vez esté en la celda
• Lave las celdas cada vez que termine de utilizarlas
• Guárdelas cuidadosamente
Uno o más detectores

• Para medir la intensidad de la radiación transmitida

• El detector convierte la luz que ha atravesado la
muestra en una señal eléctrica.
• Debe dar una respuesta lineal a lo largo de un amplio
espectro de REM, con bajo ruido y alta sensibilidad.
• Ejemplos:
• Tubo fotomultiplicador
• Detector de fotodiodo*
*=se tiene en el lab =)
Tubo fotomultiplicador
e- secundario
Fotones e-
e- primario
Señal de
salida
Ánodo
Fotocátodo Dínodo

• El tubo fotomultiplicador combina la conversion de la señal

con varias fases de amplificación dentro del cuerpo del tubo.
• La naturaleza del material del cátodo determina la sensibilidad
spectral.
• Buena sensibilidad en el rango UV-Vis 200-900 nm
Modificado de:
https://jascoinc.com/learning-center/theory/spectroscopy/uv-vis-spectroscopy/#:~:text=green)%20reflectance%20components.-,UV%2DVisible%20Spectroscopy%20Instrumentation,element%2C%20sample%2C%20and%20detector.&text=The%20monochromator%20itself%20houses%20the%20mirrors%2C%20slits%2C%20and%20grating
Detectores de fotodiodo de silicón

• Usados extensivamente
• Tienen un rango dinámico más amplio y robusto que
los tubos fotomultiplicadores.
• Rango 170-1100 nm
• Principio: la luz incidente induce un flujo de electrones en un
semiconductor. La migración de tales electrones reduce la carga en
un capacitor conectado al material. La cantidad de carga necesaria
para recargar el capacitor es proporcional a la intensidad de la luz que
incidió.

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf

Otros componentes ópticos
• Lentes, espejos, fibra óptica

Espectrofotómetro Genesys 10
Otros componentes ópticos

https://www.researchgate.net/figure/Schematic-of-Single-and-double-beam-spectrophotometer_fig1_328353870
Otros componentes ópticos

Agilent Cary 5000 UV-Vis-NIR spectrophotometer

https://www.agilent.com/en/support/molecular-spectroscopy/uv-vis-uv-vis-nir-spectroscopy/uv-vis-spectroscopy-spectrophotometer-basics
Disolventes útiles en la region UV-vis
Espectros de absorción
molecular en UV-Vis

Fig. 16.7. Espectro UV del

Benceno

©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley)

 Acetona

Benceno

Transparencia
de solventes Cloroformo

comúnmente
utilizados en la
region UV.
Ciclohexano
Metanol
Etanol
Metilciclohexano
Alcohol isopropílico
Agua
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
Efecto de luz ajena al sistema óptico en el
desempeño del equipo

El pico del máximo de absorbancia será Desviación de la Ley de Beer-Lambert

menor y la curva se aplanará conforme la luz
ajena dentro del instrumento incrementa.
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf
 El ruido se
El rango lineal de la respuesta del equipo se incrementa.
reduce conforme menos luz llega al detector. Las concentraciones
dependen del analito.
Unidades de Absorbancia

Longitud de onda, l (nm)

Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf

Relación entre el %T y la Absorbancia.

Una muestra que mide 7 unidades de absorbancia implica que solamente el 0.00001% pasa a través de la muestra
Tomado de: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-uv-vis-basics-5980-1397en-agilent.pdf