Practica 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FARMACIA
ACADEMIA DE BIOFARMACIA
PRÁCTICA 1
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV PARA PRUEBAS

DE DISOLUCIÓN Y PERFILES DE DISOLUCIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO TABLETAS DE
500 mg
NOMBRE DEL ALUMNO: Rendón Núñez Bruno Didier
EQUIPO: 6
LISTA DE COTEJO
Rubro % cumple
1.- Registro de datos completos 10
2.-Tablas llenas 30
3.- Gráficas 15
4.- Cálculos matemáticos 15
5.- Criterios 10
6.- conclusión 10
7.- Cuestionario 10
Calificación
Diagrama de flujo
3+3+3+3+3 15
Diagrama causa - efecto
3+3+3+3+3+3+3+3+3+3 30
Profesor
PRÁCTICA 1
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV PARA PRUEBAS

DE DISOLUCIÓN Y PERFILES DE DISOLUCIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO TABLETAS DE
500 mg
I. INTRODUCCIÓN
Debido a los cambios en la regulación sanitaria en nuestro país respecto al registro de

medicamentos, el cual se tiene que renovar cada 5 años, así como la aparición de medicamentos
genéricos en el mercado, es necesario realizar estudios de liberación y de biodisponibilidad. La parte
esencial de estos estudios es la cuantificación del principio activo en diferentes condiciones, por lo
que la caracterización fisicoquímica del fármaco y la validación de métodos analíticos es
indispensable.
La validación de un método analítico es la evidencia experimental documentada de que un

procedimiento cumple con el propósito para el que fue diseñado (NOM-177-SSA1-2013).
Un método analítico debe validarse cuando sea necesario verificar que sus parámetros de
desempeño son adecuados para el uso en un problema analítico específico. Por ejemplo:
● Un nuevo método desarrollado para un problema específico.

● Un método ya establecido revisado para incorporar mejoras o extenderlo a un nuevo problema.
● Cuando el control de calidad indica que un método ya establecido está cambiando con el
tiempo.
● Un método establecido usado en un laboratorio diferente o con diferentes analistas o con
diferente instrumentación.
● Para demostrar la equivalencia entre dos métodos, por ejemplo, entre un método nuevo y uno
de referencia.
En el caso de la prueba de perfiles de disolución, la validación del método analítico debe realizarse
con el medicamento de referencia y con el medicamento de prueba, utilizar la misma técnica de
validación para ambos medicamentos, ya sea la técnica de porcentaje de recuperación o la técnica
de estándar adicionado. Cabe destacar que la validación debe realizarse con una muestra
pulverizada homogénea y representativa de los medicamentos, la cual debe utilizarse durante todo el
proceso de validación del método.
II. OBJETIVO
Validar un método espectrofotométrico para poder cuantificar ácido acetilsalicílico (AAS) liberado en
los perfiles de disolución de tabletas que contienen 500 mg.
III. MATERIAL
Parámetro Material Capacidad (mL) Cantidad

- Mortero con pistilo - 1
- Papel filtro whatman 40- - 30
42
100 3
Matraces volumétricos
10 18
● Linealidad del sistema 1 1
(fármaco) Pipetas graduadas
5 1
● Linealidad del método 1 2
(medicamento de referencia y 2 3
medicamento de prueba) Pipetas volumétricas 3 3
4 3
(Por equipo) 5 3
100 1
Vaso de precipitados
500 1
50 1
100 9
Embudos de filtración - 9
Pipetas graduadas 10 1
● Influencia del filtro
2 6
Pipetas volumétricas
5 6
100 1
500 1
50 1
100 9
Matraces erlenmeyer 50 18
2 6
● Estabilidad Pipetas volumétricas
5 6
Pipetas graduadas 10 1
100 1
500 1
● Selectividad 100 4
10 12
1 2
Pipetas volumétricas
2 12
50 2
100 2
1. Reactivos
● Agua destilada
● Acetato de sodio trihidratado
● Ácido acético glacial
● Solución buffer ph 4.5 ± 0,05 de acetatos (preparación ver anexo 1).
2. Equipo
● Balanza analítica
● Espectrofotómetro UV/VI
Cronograma de actividades
Prueba Actividades
Linealidad del sistema Equipo 1 y 3
Influencia del filtro Equipo 1
Selectividad Equipo 3
Linealidad medicamento referencia Equipo 2 y 5
Linealidad medicamento prueba Equipo 4 y 6
Estabilidad Equipo 1
Descripción de los medicamentos
Característica Medicamento de referencia Medicamento de prueba

Denominación
Ácido 2-(acetiloxi)-benzoico
Internacional
Denominación Genérica Ácido acetilsalicílico
Denominación Distintiva
Aspirina Ácido acetilsalicílico
(marca)
Forma Farmacéutica Tableta
Contenido 500mg
Número de Lote X24GGB 1807355
Fecha de Caducidad OCT 2023 SEP 2021
Fabricante Bayer Alpharma
Cantidad 4 cajas con 20 tabletas de 500 mg
Tableta blanca con letras de la
empresa fabricante impresas.
Descripción Medicamento utilizado como un Tabletas blancas
antiinflamatorio y para el dolor y la
fiebre.
Descripción del estándar secundario
Nombre Ácido Acetilsalicílico

Tipo Estándar secundario
Lote MKBR3446V
Pureza 99.00%
Proveedor Sigma Aldrich
IV. DIAGRAMA DE FLUJO

V. DESARROLLO
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN CON EL FÁRMACO
Linealidad del sistema

Procedimiento
1. Pesar el equivalente a 40 mg del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS) (considerar

la pureza del estándar) y colocarlo en un matraz aforado de 100 mL. Al matraz adicionar 5.0 mL
de etanol (agitar hasta disolver completamente), aforar con solución buffer pH 4,5 y mezclar.
(Solución Stock o Solución madre).
2. De la solución anterior tomar por duplicado alícuotas de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 mL transferir las

alícuotas a matraces aforados de 10 mL, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5 y mezclar.
(La curva estándar preparada tiene las siguientes concentraciones: 40, 80, 120, 160, 200, 240
µg/mL).
3. Leer todas las soluciones anteriores en un espectrofotómetro UV/Vis a una longitud de onda de
265 nm.
4. Usar la solución buffer pH 4,5 como blanco de ajuste.
5. Anotar los resultados obtenidos en la tabla 1.
6. Análisis de resultados
a. Realizar una gráfica con los datos de absorbancia vs concentración y aplicar análisis
de regresión lineal (gráfica 1)
b. Calcular el error relativo debido a la regresión, con la siguiente fórmula:
Σ Y 2− AΣY −BΣXY
CV Y =
X
√ N −2
Y
X 100
A= Ordenada al origen
B= Pendiente
CVy/x= Coeficiente de variación o error relativo de la regresión lineal
c. Aplicar un análisis de regresión lineal, reportar la ecuación y el coeficiente de regresión

o correlación lineal ®.
d. Consultar los criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si estos cumplen.
Precisión
1. Con los datos anteriores calcula el factor de respuesta (Absorbancia/concentración).

2. Anotar los resultados en la tabla 2.
DE
3. Calcular el coeficiente de variación de la media. CV = ( )
X
100
4. Consultar criterio de aceptación según la NOM-177 e indicar si este cumple.
Tabla 1. Linealidad sistema

Sesión 1, Fecha: Sesión 2, Fecha:

Concentración Absorbancia Concentración Absorbancia
nominal nominal
(µg/ml) (µg/ml)
1 2 1 2
40 0.126 0.124 40 0.122 0.123
80 0.244 0.245 80 0.244 0.245
120 0.372 0.37 120 0.373 0.371
160 0.498 0.492 160 0.488 0.490
200 0.623 0.625 200 0.619 0.622
240 0.769 0.77 240 0.766 0.768
Ecuación y = 0.0032x – 0.0103 Ecuación y = 0.0032x – 0.0108
r 0.9994 r 0.9993
CVy/x 1.7365 CVy/x 20.9594
0.9
0.8
0.7 f(x) = 0 x − 0.01
R² = 1
0.6
Absorbancia
0.5 Absorbancia Día 1

0.4 Linear (Absorbancia Día 1)
Linear (Absorbancia Día 1)
0.3 Absorbancia Día 7
0.2 Linear (Absorbancia Día 7)
0.1
0
0 50 100 150 200 250 300
Concentració n (ug/mL)
Gráfica 1. Linealidad del sistema (absorbancia vs concentración nominal)
Resultado Criterio NOM-177

Ecuación y = 0.0032x – 0.0103 ---
r 0.9994 r igual o mayor que 0.99
CVy/x 1.7365 No mayor que el 2%
Conclusión: Cumple con el criterio de la NOM-177 al ser mayor al 2%
Tabla 2. Precisión
Concentración nominal Absorbancia Factor de respuesta
(μg/mL) 1 2 1 2
40 0.126 0.124 0.0032 0.0031
80 0.244 0.245 0.0031 0.0031
120 0.372 0.37 0.0031 0.0031
160 0.498 0.492 0.0031 0.0031
200 0.623 0.625 0.0031 0.0031
240 0.769 0.77 0.0032 0.0032
Media 0.003115486
Desviación estándar 0.0001
Coeficiente de variación (%) 1.6201
Criterio NOM-177: Menor o igual al 2%
Conclusión: No cumple con el criterio de la NOM-177 al ser mayor al 2%
Influencia del filtro
1. Pesar el equivalente a 150 mg del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS),

(considerar la pureza del estándar) transferirlo a un matraz aforado de 50 mL, adicionar 5 mL de
etanol (agitar hasta disolver completamente), aforar con solución reguladora de acetatos pH 4,5
y mezclar..
2. Realizar por triplicado las siguientes diluciones. De la solución anterior tomar alícuotas de 2, 5 y
7 mL, transferir cada una de las alícuotas a matraces aforados de 100 mL, aforar cada matraz
con solución reguladora de acetatos pH 4,5. Agitar para homogeneizar cada una de las
soluciones.
3. Leer cada una de las soluciones al espectrofotómetro UV/Vis a una longitud de onda de 265 nm.
Usar la solución buffer como blanco de ajuste. Registrar las lecturas en la tabla 3 (muestra sin
filtrar).
4. A continuación, filtrar cada una de las soluciones obtenidas en el punto 2 desechando los
primeros 2 mL.
5. Leer cada una de las soluciones filtradas al espectrofotómetro a una longitud de onda = 265 nm.
6. Anotar los resultados obtenidos en la tabla 3 (muestra filtrada)
7. Análisis de resultados (tabla 3).
a. Obtener las concentraciones interpolando en la curva de calibración (linealidad del sistema).

b. Calcular el porcentaje cuantificado.
c. Obtener el promedio del porcentaje para cada nivel de concentración.
d. Calcular la diferencia absoluta de acuerdo a la siguiente fórmula:
di=| y i− y 0|
En donde:
di=diferencia absoluta
y i=Porcentaje cuantificado de la solución filtrada , y 0=Porcentaje cuantificado de la solución no filtrada
e. Consultar los criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si éstos cumplen.
Tabla 3. Influencia del filtro

Concentración Concentració
Condición a Porcentaje Diferencia
nominal Absorbancia n cuantificada Promedio
estudiar cuantificado absoluta |di|
(μg/mL) (μg/mL)
0.209 68.5313 114.2188
Muestra sin
60 0.205 67.2813 112.1354 113.3507
filtrar
0.208 68.2188 113.6979
7.2917
0.22 71.9688 119.9479
Muestra filtrada 60 0.223 72.9063 121.5104 120.6424
0.221 72.2813 120.4688
0.48 153.2188 102.1458
Muestra sin
150 0.481 153.5313 102.3542 102.0764
filtrar
0.478 152.5938 101.7292
1.3889
0.485 154.7813 103.1875
0.488 155.7188 103.8125
0.658 208.8438 99.4494
Muestra sin
210 0.651 206.6563 98.4077 98.9534
filtrar
0.655 207.9063 99.0030
1.2897
0.667 211.6563 100.7887
0.66 209.4688 99.7470
Conclusión: Como la primer di, es mayor que el 2%, no se cumple el criterio de la NOM – 177.
Estabilidad
1. Pesar el equivalente a 150 mg del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS),

(considerar la pureza del estándar) transferirlo a un matraz aforado de 50 mL, adicionar 5 mL
de etanol (agitar hasta disolver completamente) aforar con solución reguladora de acetatos
pH 4,5 y mezclar.
2. Realizar por triplicado las siguientes diluciones. De la solución anterior tomar alícuotas de 2,
5 y 7 mL, transferir a matraces aforados de 100 mL, aforar con solución reguladora de
acetatos pH 4,5. Agitar para homogenizar la solución.
3. Leer cada una de las soluciones al espectrofotómetro UV/Vis a una longitud de onda de 265
nm, registrar la lectura en la tabla 4 (t 0). Usar la solución buffer como blanco de ajuste.
4. Una vez registrado el tiempo cero, dividir las soluciones preparadas en el punto 2 en dos
fracciones:
a. La fracción 1 se lee después de 2 horas de haberlo preparado, registrar la lectura en

la tabla 4 (t1).
b. La fracción 2 se guarda en un tubo de plástico, y se almacena en refrigeración para
obtener la lectura de la muestra en la próxima sesión (t 2).
5. Análisis de resultados (tabla 4).
a. Obtener la concentración interpolando en la curva de calibración (linealidad del sistema).

b. Calcular el porcentaje cuantificado
c. Obtener el promedio de los porcentajes cuantificados para cada concentración.
d. Obtener la diferencia absoluta para cada concentración de acuerdo a la siguiente fórmula:
di=|t i −t 0|
En donde:
di=diferencia absoluta
t i=Porcentaje cuantificado de la solución a x tiempo
t 0=Porcentaje cuantificado de la solución a tiempo cero
e. Consultar criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si estos cumplen.
Tabla 4. Estabilidad
Concentración Concentración Porcentaje
Condición Absorba Promedi Diferencia
nominal cuantificada cuantificad
a estudiar ncia o absoluta |di|
(μg/mL) (μg/mL) o
0.179 59.1563 98.5938
t0 60 0.177 58.5313 97.5521 98.4201
0.18 59.4688 99.1146
1.3889
0.183 60.4063 100.6771
t1 60 0.181 59.7813 99.6354 99.8090
0.18 59.4688 99.1146
0.17 56.3438 93.9063
t2 60 0.172 56.9688 94.9479 94.4271 3.9931
0.171 56.6563 94.4271
0.465 148.5313 99.0208
t0 150 0.463 147.9063 98.6042 98.6042
0.461 147.2813 98.1875
0.0000
0.465 148.5313 99.0208
t1 150 0.463 147.9063 98.6042 98.6042
0.461 147.2813 98.1875
0.379 121.6563 81.1042
t2 150 0.385 123.5313 82.3542 80.5486 18.0556
0.365 117.2813 78.1875
0.653 207.2813 98.7054
t0 210 0.65 206.3438 98.2589 98.5565
0.653 207.2813 98.7054
0.0496
0.65 206.3438 98.2589
t1 210 0.655 207.9063 99.0030 98.6062
0.652 206.9688 98.5565
0.628 199.4688 94.9851
t2 210 0.626 198.8438 94.6875 94.5883 3.9683
0.622 197.5938 94.0923
Conclusión: No cumple con el criterio de la NOM-177 al ser mayor al 3%.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN CON EL MEDICAMENTO DE REFERENCIA (Aspirina/Bayer)
Linealidad del método medicamento de referencia
Preparación de la solución del estándar secundario:
Pesar el equivalente a 2 g del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS) (considerar la

pureza del estándar), transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL, adicionar 50 mL de
etanol y agitar hasta disolución, aforar con solución buffer pH 4.5 y mezclar.
Preparación de la muestra:
a) Pesar 10 tabletas del medicamento de referencia (Aspirina/Bayer) y calcular el peso promedio.

Colocar las tabletas pesadas en un mortero y triturarlas hasta obtener un polvo fino.
b) Del polvo anterior, pesar por sextuplicado la cantidad equivalente a 50 mg de AAS (considerar el
peso promedio de las tabletas) y transferir cuantitativamente cada una de las muestras pesadas
a un matraz aforado de 100 mL para la preparación de las siguientes soluciones:
Solución 1. Adicionar al primer matraz una alícuota de 1 mL de la solución del estándar

secundario más 10 mL de etanol, agitar muy bien durante 10 min y aforar con solución buffer
de acetatos pH 4,5; mezclar la solución y filtrar. Del filtrado, transferir por triplicado alícuotas de
2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH
4,5 y mezclar.
Solución 2. Adicionar al segundo matraz una alícuota de 2 mL de la solución del estándar

4,5 y mezclar.
Solución 3. Adicionar al tercer matraz una alícuota de 3 mL de la solución del estándar

4,5 y mezclar.
Solución 4- Adicionar al cuarto matraz una alícuota de 4 mL de la solución del estándar

de acetatos pH 4, 5, mezclar la solución y filtrar. Del filtrado, transferir por triplicado alícuotas
de 2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos
pH 4,5 y mezclar.
Solución 5. Adicionar al quinto matraz una alícuota de 5 mL de la solución del estándar

secundario más 10 mL de etanol, agitar muy bien durante 10 min, aforar con solución buffer de
acetatos pH 4,5; mezclar la solución y filtrar. Del filtrado, transferir por triplicado alícuotas de 2
mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5
y mezclar.
Solución 6. Adicionar al sexto matraz una alícuota de 6 mL de la solución del estándar

mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5
y mezclar.
c) Leer todas las soluciones anteriores en un espectrofotómetro UV/Vis a una longitud de onda de
265 nm. Usar la solución buffer como blanco de ajuste.
d) Anotar los resultados en la tabla 5.
e) Realizar un análisis de regresión lineal con los datos de la absorbancia contra la concentración
nominal.
f) A cada absorbancia restar la ordenada al origen de la regresión anterior. A esta absorbancia se

le llamará absorbancia corregida (tabla 5).
g) Realizar un segundo análisis de regresión lineal con la absorbancia corregida y la concentración

nominal (datos de la tabla 5).
h) Interpolar las absorbancias en la curva de calibración de linealidad del sistema para obtener la
concentración recuperada en μg/mL (tabla 6) y graficar (gráfica 2).
i) Realizar otra regresión lineal de la concentración recuperada contra la concentración nominal.

Calcular el coeficiente de correlación ® y el de variación de la regresión lineal (CV y/x).
j) Consultar criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si estos cumplen.
Tabla 5. Linealidad del método del medicamento de referencia (absorbancia)

Sesión 1, Fecha:
Concentración Absorbancia Absorbancia corregida
nominal
(μg/mL) 1 2 3 1 2 3
40 0.362 0.353 0.359 0.1096 0.1006 0.1066
80 0.491 0.497 0.502 0.2386 0.2446 0.2496
120 0.621 0.606 0.616 0.3686 0.3536 0.3636
160 0.736 0.765 0.766 0.4836 0.5126 0.5136
200 0.848 0.833 0.866 0.5956 0.5806 0.6136
240 0.953 0.965 0.953 0.7006 0.7126 0.7006
Ecuación: y = 0.003x + 0.2524 Ecuación: y = 0.003x + 4x10-5
Ordenada al origen: 0.2524

Sesión 2, Fecha:
nominal
(μg/mL) 1 2 3 1 2 3
40
80
120
160
200
240
Ecuación: Ecuación:
Ordenada al origen:
Tabla 6. Linealidad del método del medicamento de referencia (concentración recuperada vs

concentración nominal)
Concentración recuperada (µg/mL)

Replica 40 80 120 160 200 240
1 37.4688 77.7813 118.4063 154.3438 189.3438 222.1563
2 34.6563 79.6563 113.7188 163.4063 184.6563 225.9063
3 36.5313 81.2188 116.8438 163.7188 194.9688 222.1563
250.0000
f(x) = 0.94 x + 3.23

200.0000 R² = 0.99
Concentració n recuperada
150.0000
100.0000
50.0000
0.0000
0 50 100 150 200 250 300
Gráfica 2. Linealidad del método del medicamento de referencia (concentración recuperada vs

concentración nominal

Ecuación y = 0.936x + 3.2326 ---
r 0.9941 Mayor o igual que 0.99
CVy/x 3.8989 No mayor que 3%
Conclusión: El criterio del valor de r sí cumple, pero el valor de CV no cumple el criterio de la NOM
– 177.
Exactitud del método del medicamento de referencia
1. Con los datos de concentración recuperada, obtenidos en la linealidad del método calcular el
porcentaje recuperado.
2. Obtener el promedio de los porcentajes cuantificados para cada concentración.
3. Obtener la diferencia absoluta para cada concentración de acuerdo a la siguiente fórmula:
di=|100− promedio del porcentaje recuperado|

4. Consultar criterio de aceptación en la NOM-177 e indicar si este parámetro cumple.
Tabla 7. Exactitud del método del medicamento de referencia
Concentración
Concentración Promedio
nominal % Recuperado Diferencia
recuperada porcentaje
(μg/mL) absoluta |di|
cuantificado
37.46875 93.6719
40 34.65625 86.6406 90.5469 9.4531
36.53125 91.3281
77.78125 97.2266
80 79.65625 99.5703 99.4401 0.5599
81.21875 101.5234
118.40625 98.6719
120 113.71875 94.7656 96.9358 3.0642
116.84375 97.3698
154.34375 96.4648
160 163.40625 102.1289 100.3060 0.3060
163.71875 102.3242
189.34375 94.6719
200 184.65625 92.3281 94.8281 5.1719
194.96875 97.4844
222.15625 92.5651
240 225.90625 94.1276 93.0859 6.9141
222.15625 92.5651
Criterio NOM-177: No variar en más de 3% con respeto a la cantidad nominal en cada punto
Conclusión: No cumple el criterio de la NOM – 177
Precisión del método del medicamento de referencia
a) Repetibilidad del método del medicamento de referencia
1. Con los porcentajes recuperados de la linealidad del método calcular el coeficiente de

variación del porcentaje recuperado y el coeficiente de variación de cada concentración y el
global (tabla 8).
2. Consultar NOM-177 e indicar si cumple con los criterios de aceptación.
Tabla 8. Repetibilidad del método del medicamento de referencia

Concentración nominal
% Recuperado Promedio DE CV (%)
(μg/mL)
93.6719
40 86.6406 90.5469 3.5801 3.9539
91.3281
97.2266
80 99.5703 99.4401 2.1514 2.1635
101.5234
98.6719
120 94.7656 96.9358 1.9890 2.0518
97.3698
96.4648
160 102.1289 100.3060 3.3280 3.3178
102.3242
94.6719
200 92.3281 94.8281 2.5817 2.7225
97.4844
92.5651
240 94.1276 93.0859 0.9021 0.9691
92.5651
Promedio 95.8571
DE 4.14519
CV (%) 4.32434
b) Reproducibilidad del método del medicamento de referencia
1. Con los datos de la linealidad del método de dos analistas (2 equipos) evaluarán el efecto en
la precisión del método.
2. Calcular el porcentaje recuperado y determinar el coeficiente de variación global (tabla 9).
Tabla 9. Reproducibilidad del método del medicamento de referencia

Analista
Concentració 1 2 1 2 1 2 1 2
n nominal Absorbanc Absorbanc Absorbanci Absorbanci Concentració Concentració % %
(μg/mL) ia ia a corregida a corregida n recuperada n recuperada Recupera Recupera
(μg/mL) (μg/mL) do do
0.362 0.381 0.1096 0.1286 37.4688 43.4063 93.6719 108.5156

40 0.353 0.376 0.1006 0.1236 34.6563 41.8438 86.6406 104.6094
0.359 0.388 0.1066 0.1356 36.5313 45.5938 91.3281 113.9844
0.491 0.465 0.2386 0.2126 77.7813 69.6563 97.2266 87.0703
80
0.497 0.467 0.2446 0.2146 79.6563 70.2813 99.5703 87.8516
0.502 0.46 0.2496 0.2076 81.2188 68.0938 101.5234 85.1172

0.621 0.762 0.3686 0.5096 118.4063 162.4688 98.6719 135.3906
120 0.606 0.755 0.3536 0.5026 113.7188 160.2813 94.7656 133.5677
0.616 0.753 0.3636 0.5006 116.8438 159.6563 97.3698 133.0469
0.736 0.866 0.4836 0.6136 154.3438 194.9688 96.4648 121.8555
160 0.765 0.86 0.5126 0.6076 163.4063 193.0938 102.1289 120.6836
0.766 0.868 0.5136 0.6156 163.7188 195.5938 102.3242 122.2461
0.848 0.905 0.5956 0.6526 189.3438 207.1563 94.6719 103.5781
200 0.833 0.901 0.5806 0.6486 184.6563 205.9063 92.3281 102.9531
0.866 0.908 0.6136 0.6556 194.9688 208.0938 97.4844 104.0469
0.953 1.052 0.7006 0.7996 222.1563 253.0938 92.5651 105.4557
240 0.965 1.052 0.7126 0.7996 225.9063 253.0938 94.1276 105.4557
0.953 1.052 0.7006 0.7996 222.1563 253.0938 92.5651 105.4557
Ecuación 1ra regresión:
y = 0.0029x + 0.2524 Promedio 102.9531
y = 0.0034x + 0.2591
Ecuación 2da regresión: CV (%) 12.8353
Selectividad del método del medicamento de referencia
1. Solución del Medicamento de Referencia: Pesar una cantidad del polvo equivalente a 50 mg de
ácido acetil salicílico, obtenido de la trituración de las tabletas del producto de referencia
(Aspirina/Bayer) y colocarlo en un matraz de 100 mL, adicionar 10 mL de etanol y agitar muy bien
durante 10 min, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5; mezclar la solución y filtrar. Del
filtrado, transferir por triplicado alícuotas de 2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar
con solución buffer de acetatos pH 4,5 y mezclar.
2. Solución del estándar adicionado: Pesar una cantidad del polvo equivalente a 50 mg de ácido acetil
salicílico, obtenido de la trituración de las tabletas del producto de referencia (Aspirina/Bayer) y
colocarlo en un matraz de 100 mL, adicionar una alícuota de 1 mL de la solución del estándar
secundario (ver la preparación en linealidad del método), adicionar 10 mL de etanol y agitar muy
bien durante 10 min y aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5; mezclar la solución y filtrar. Del
filtrado, transferir por triplicado alícuotas de 2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente,
aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5 y mezclar.
3. Leer todas las soluciones anteriores en un espectrofotómetro UV/Vis a una longitud de onda de 265
nm. Usar la solución buffer como blanco de ajuste.
5. Obtener la diferencia entre la respuesta (absorbancia) del estándar adicionado y el placebo

analítico.
6. Interpolar la absorbancia resultante de la diferencia, en la curva de calibración de linealidad del

sistema, para obtener la concentración cuantificada.
7. Obtener el porcentaje cuantificado, calcular el coeficiente de variación (CV) y la diferencia absoluta

(di), de acuerdo a las siguientes fórmulas:
CV = ( DEX ) 100
di=|100−X del % cuantificado|
DE= desviación estándar

X = promedio
Tabla 10. Selectividad del medicamento de referencia (Aspirina/Bayer)
Respuesta del
Concentraci Respuesta del Concentració
estándar Diferencia Porcentaje
ón nominal Muestra placebo analítico n Cuantificada
adicionado Absorbancia cuantificado
(µg/mL) Absorbancia (µg/mL)
Absorbancia
1 0.395 0.247 0.148 49.4688 123.6719
40 2 0.394 0.242 0.152 50.7188 126.7969
3 0.398 0.244 0.154 51.3438 128.3594
Promedio 126.2760
D.E. 2.3868
C.V. 1.8901
di 26.2760
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN CON EL MEDICAMENTO DE PRUEBA (Medicamento

Genérico)
Linealidad del método del medicamento de prueba
Preparación de la solución del estándar secundario:
Pesar el equivalente a 2 g del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS), (considerar la

pureza del reactivo), transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL, adicionar 50 mL de
etanol y agitar hasta disolución, aforar con solución buffer pH 4.5
Preparación de la muestra:
a) Pesar 10 tabletas del medicamento de prueba (medicamento genérico), determinar el peso

promedio y triturarlas en un mortero hasta obtener un polvo fino.
b) Del polvo anterior, pesar por sextuplicado la cantidad equivalente a 50 mg de AAS
(considerar el peso promedio de las tabletas) y transferir cada muestra a un matraz aforado
de 100 mL para preparar las siguientes soluciones:
Solución 1. Adicionar al primer matraz una alícuota de 1 mL de la solución del estándar

2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5
y mezclar.
Solución 2. Adicionar al segundo matraz una alícuota de 2 mL de la solución del estándar

y mezclar.
Solución 3. Adicionar al tercer matraz una alícuota de 3 mL de la solución del estándar

y mezclar.
Solución 4- Adicionar al cuarto matraz una alícuota de 4 mL de la solución del estándar

de acetatos pH 4, 5,; mezclar la solución y filtrar. Del filtrado, transferir por triplicado alícuotas
de 2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH
4,5 y mezclar.
Solución 5. Adicionar al quinto matraz una alícuota de 5 mL de la solución del estándar

mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5 y
mezclar.
Solución 6. Adicionar al sexto matraz una alícuota de 6 mL de la solución del estándar

mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5 y
mezclar.
c) Anotar los resultados en la tabla 11.

d) Realizar un análisis de regresión lineal con los datos de la absorbancia contra la
concentración nominal.
e) A cada absorbancia restar la ordenada al origen de la regresión anterior. A esta absorbancia

se le llamará absorbancia corregida (tabla 11).
f) Realizar un segundo análisis de regresión lineal con la absorbancia corregida y la

concentración nominal (datos de la tabla 11).
g) Interpolar las absorbancias en la curva de calibración de linealidad del sistema para obtener
la concentración recuperada en μg/mL (tabla 12) y graficar (gráfica 3).
h) Realizar otra regresión lineal de la concentración recuperada contra la concentración

nominal. El coeficiente de correlación o regresión lineal (r) y el de variación de la regresión
lineal (CVy/x).
i) Consultar criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si estos cumplen.
Tabla 11. Linealidad del método del medicamento de prueba (absorbancia)

Sesión 1, Fecha:
nominal
(μg/mL) 1 2 3 1 2 3
40 0.423 0.425 0.391 0.162 0.164 0.13
80 0.556 0.594 0.61 0.295 0.333 0.349
120 0.754 0.728 0.731 0.493 0.467 0.47
160 0.88 0.871 0.872 0.619 0.61 0.611
200 1.013 1.028 1.017 0.752 0.767 0.756
240 1.21 1.236 1.219 0.949 0.975 0.958
Ecuación: y = 0.0039x + 0.261 Ecuación: y = 0.0039x – 2x10-5
Ordenada al origen: 0.261

Sesión 2, Fecha:
nominal
(μg/mL) 1 2 3 1 2 3
40
80
120
160
200
240
Ecuación: Ecuación:
Ordenada al origen:
Tabla 12. Linealidad del método del medicamento de prueba (concentración recuperada vs
Concentración recuperada (µg/mL)

Réplica 40 80 120 160 200 240
1 53.8438 95.4063 157.2813 196.6563 238.2188 299.7813
2 350.0000 54.4688 107.2813 149.1563 193.8438 242.9063 307.9063
3 43.8438 112.2813 150.0938 194.1563 239.4688 302.5938
300.0000
f(x) = 1.22 x + 3.21
Concentració n recuperada
R² = 0.99
250.0000
200.0000
150.0000
100.0000
50.0000
0.0000
0 50 100 150 200 250 300
Gráfica 3. Linealidad del método del medicamento de prueba (concentración recuperada vs


Ecuación y = 1.2228x + 3.2118 ---
r 0.9942 Mayor o igual que 0.99
CVy/x 3.8992 No mayor que 3%
Conclusión: No cumple con el criterio de la NOM – 177.
Exactitud del método del medicamento de prueba (medicamento genérico)
1. Con los datos de concentración recuperada, obtenidos en la linealidad del método calcular el
porcentaje recuperado (tabla 13).
2. Obtener el promedio de los porcentajes cuantificados para cada concentración
3. Obtener la diferencia absoluta para cada concentración de acuerdo a la siguiente fórmula:
di=|100− promedio del porcentaje recuperado|
Tabla 13. Exactitud del método del medicamento de prueba

Concentración Promedio
Concentración Diferencia
nominal % Recuperado porcentaje
recuperada absoluta |di|
(μg/mL) cuantificado
53.84375 134.6094
40 126.7969 26.7969
54.46875 136.1719
43.84375 109.6094
95.40625 119.2578
80 107.28125 134.1016 131.2370 31.2370
112.28125 140.3516
157.28125 131.0677
120 149.15625 124.2969 126.8142 26.8142
150.09375 125.0781
196.65625 122.9102
160 193.84375 121.1523 121.8034 21.8034
194.15625 121.3477
238.21875 119.1094
200 242.90625 121.4531 120.0990 20.0990
239.46875 119.7344
299.78125 124.9089
240 307.90625 128.2943 126.4280 26.4280
302.59375 126.0807
Criterio NOM-177: No variar en más de 3% con respeto a la cantidad nominal en cada punto
Precisión del método del medicamento de prueba (medicamento genérico)
a) Repetibilidad del método del medicamento de prueba
1. Con los porcentajes recuperados de la linealidad calcular el coeficiente de variación del

porcentaje recuperado y el coeficiente de variación de cada concentración y el global (tabla
14).
Tabla 14. Repetibilidad del método del medicamento de prueba
Concentración nominal
% Recuperado Promedio DE CV (%)
(μg/mL)
134.6094
40 136.1719 90.5469 14.9053 16.4614
109.6094
80 119.2578 99.4401 10.8347 10.8957
134.1016
140.3516
131.0677
120 124.2969 96.9358 3.7043 3.8214
125.0781
122.9102
160 121.1523 100.3060 0.9635 0.9605
121.3477
119.1094
200 121.4531 94.8281 1.2137 1.2799
119.7344
124.9089
240 128.2943 93.0859 1.7192 1.8469
126.0807
Promedio 125.5297
DE 7.50418
CV (%) 5.97801
b) Reproducibilidad del método del medicamento de prueba (medicamento genérico)
1. Con los datos de la linealidad del método de dos analistas (2 equipos) evaluarán el efecto en
la precisión del método.
2. Calcular el porcentaje recuperado y determinar el coeficiente de variación global (tabla 15).
Tabla 15. Reproducibilidad del método del medicamento de prueba
Analista
Concentració 1 2 1 2 1 2 1 2
n nominal Absorbanc Absorbanc Absorbanci Absorbanci Concentració Concentració % %
(μg/mL) ia ia a corregida a corregida n recuperada n recuperada Recupera Recupera
(μg/mL) (μg/mL) do do
0.423 0.486 0.162 0.225 53.8438 73.5313 134.6094 183.8281

40 0.425 0.457 0.164 0.196 54.4688 64.4688 136.1719 161.1719
0.391 0.455 0.13 0.194 43.8438 63.8438 109.6094 159.6094
0.556 0.725 0.295 0.464 95.4063 148.2188 119.2578 185.2734

80 0.594 0.733 0.333 0.472 107.2813 150.7188 134.1016 188.3984
0.61 0.73 0.349 0.469 112.2813 149.7813 140.3516 187.2266
0.754 0.85 0.493 0.589 157.2813 187.2813 131.0677 156.0677
120 0.728 0.88 0.467 0.619 149.1563 196.6563 124.2969 163.8802
0.731 0.86 0.47 0.599 150.0938 190.4063 125.0781 158.6719
0.88 1.102 0.619 0.841 196.6563 266.0313 122.9102 166.2695
160 0.871 1.115 0.61 0.854 193.8438 270.0938 121.1523 168.8086
0.872 1.119 0.611 0.858 194.1563 271.3438 121.3477 169.5898
1.013 1.445 0.752 1.184 238.2188 373.2188 119.1094 186.6094
200
1.028 1.432 0.767 1.171 242.9063 369.1563 121.4531 184.5781
1.017 1.41 0.756 1.149 239.4688 362.2813 119.7344 181.1406
1.21 1.56 0.949 1.299 299.7813 409.1563 124.9089 170.4818
240 1.236 1.588 0.975 1.327 307.9063 417.9063 128.2943 174.1276
1.219 1.501 0.958 1.24 302.5938 390.7188 126.0807 162.7995
Ecuación 1ra regresión:
y = 0.0039x + 0.261 Promedio
149.1130
Ecuación 2da regresión: y = 0.0055x + 0.2483
CV (%)
17.2480
Criterio NOM-177: NOM-177: Menor o igual al 3%
Conclusión: No cumple con el criterio de la NOM – 177
Selectividad del método del medicamento de prueba (medicamento genérico)

1. Solución del medicamento de prueba: Pesar una cantidad del polvo equivalente a 50 mg de ácido
acetil salicílico, obtenido de la trituración de las tabletas del producto de prueba (medicamento
genérico) y colocarlo en un matraz de 100 mL, adicionar 10 mL de etanol y agitar muy bien
durante 10 min, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5; mezclar la solución y filtrar. Del
filtrado, transferir por triplicado alícuotas de 2 mL a matraces aforados de 10 mL. Finalmente,
aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5 y mezclar.
2. Solución del estándar adicionado: Pesar una cantidad del polvo equivalente a 50 mg de ácido
acetil salicílico, obtenido de la trituración de las tabletas del producto de prueba y colocarlo en un
matraz de 100 mL, adicionar una alícuota de 1 mL de la solución del estándar secundario ( ver en
la linealidad del método la preparación de la solución del estándar secundario), adicionar 10
mL de etanol y agitar muy bien durante 10 min, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5;
mezclar la solución y filtrar. Del filtrado, transferir por triplicado alícuotas de 2 mL a matraces
aforados de 10 mL. Finalmente, aforar con solución buffer de acetatos pH 4,5 y mezclar.
3. Leer las soluciones anteriores en un espectrofotómetro UV/Vis a una longitud de onda de 265 nm.
Usar la solución buffer como blanco de ajuste.
5. Obtener la diferencia entre la respuesta (absorbancia) del estándar adicionado y el placebo
analítico.
6. Interpolar la absorbancia resultante de la diferencia, en la curva de calibración de linealidad del
sistema y calcular la concentración cuantificada.
7. Obtener el porcentaje cuantificado y calcular el coeficiente de variación (CV) y la diferencia
absoluta (di), de acuerdo a las siguientes fórmulas:
CV = ( DEX ) 100
di=|100−X del % cuantificado|

DE= desviación estándar
X = promedio
Tabla 16. Selectividad del medicamento de prueba
Respuesta del
Concentraci Respuesta del Concentració
estándar Diferencia Porcentaje
ón nominal Muestra placebo analítico n Cuantificada
adicionado absorbancia cuantificado
(µg/mL) (absorbancia) (µg/mL)
(absorbancia)
1 0.399 0.278 0.121 41.0313 102.5781
40 2 0.398 0.279 0.119 40.4063 101.0156
3 0.402 0.281 0.121 41.0313 102.5781
Promedio 102.0573
D.E. 0.9021
C.V. 0.8839
di 2.0573
8. Consultar la NOM-177 e indicar si cumple con los criterios de aceptación.
Criterio NOM-177: NOM-177: Menor o igual al 3%
Conclusión: Sí cumple con el criterio de la NOM - 177
V. CUESTIONARIO
1. Defina los parámetros a evaluar en la validación de un método analítico para realizar un perfil de
disolución como prueba de intercambiabilidad.
2. ¿Los parámetros que se evalúan en la validación de un método analítico para un perfil de

disolución son los mismos que se evalúan para la validación de métodos analíticos para
muestras biológicas de un estudio de bioequivalencia?
3. Mencione los parámetros que los diferencian.
VI. BIBLIOGRAFÍA
NORMA Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-2013, que establece las pruebas y procedimientos para
demostrar que un medicamento es intercambiable. Requisitos a que deben sujetarse los Terceros
Autorizados que realicen las pruebas de intercambiabilidad. Requisitos para realizar los estudios de
biocomparabilidad. Requisitos a que deben sujetarse los Terceros Autorizados, Centros de
Investigación o Instituciones Hospitalarias que realicen las pruebas de biocomparabilidad.
EJEMPLO DE CÁLCULOS MATEMÁTICOS

(No olvidar que deben ser a mano)


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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV PARA PRUEBAS

NOMBRE DEL ALUMNO: Rendón Núñez Bruno Didier

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV PARA PRUEBAS

Debido a los cambios en la regulación sanitaria en nuestro país respecto al registro de

La validación de un método analítico es la evidencia experimental documentada de que un

● Un nuevo método desarrollado para un problema específico.

Parámetro Material Capacidad (mL) Cantidad

Linealidad del sistema Equipo 1 y 3

Influencia del filtro Equipo 1

Linealidad medicamento referencia Equipo 2 y 5

Linealidad medicamento prueba Equipo 4 y 6

Descripción de los medicamentos

Característica Medicamento de referencia Medicamento de prueba

Descripción del estándar secundario

Nombre Ácido Acetilsalicílico

IV. DIAGRAMA DE FLUJO

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN CON EL FÁRMACO

Linealidad del sistema

1. Pesar el equivalente a 40 mg del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS) (considerar

2. De la solución anterior tomar por duplicado alícuotas de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 mL transferir las

4. Usar la solución buffer pH 4,5 como blanco de ajuste.

5. Anotar los resultados obtenidos en la tabla 1.

c. Aplicar un análisis de regresión lineal, reportar la ecuación y el coeficiente de regresión

1. Con los datos anteriores calcula el factor de respuesta (Absorbancia/concentración).

Tabla 1. Linealidad sistema

Sesión 1, Fecha: Sesión 2, Fecha:

0.5 Absorbancia Día 1

Gráfica 1. Linealidad del sistema (absorbancia vs concentración nominal)

Resultado Criterio NOM-177

Conclusión: No cumple con el criterio de la NOM-177 al ser mayor al 2%

Influencia del filtro

1. Pesar el equivalente a 150 mg del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS),

6. Anotar los resultados obtenidos en la tabla 3 (muestra filtrada)

7. Análisis de resultados (tabla 3).

a. Obtener las concentraciones interpolando en la curva de calibración (linealidad del sistema).

e. Consultar los criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si éstos cumplen.

Tabla 3. Influencia del filtro

1. Pesar el equivalente a 150 mg del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS),

a. La fracción 1 se lee después de 2 horas de haberlo preparado, registrar la lectura en

5. Análisis de resultados (tabla 4).

a. Obtener la concentración interpolando en la curva de calibración (linealidad del sistema).

Conclusión: No cumple con el criterio de la NOM-177 al ser mayor al 3%.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN CON EL MEDICAMENTO DE REFERENCIA (Aspirina/Bayer)

Linealidad del método medicamento de referencia

Preparación de la solución del estándar secundario:

Pesar el equivalente a 2 g del estándar secundario de ácido acetilsalicílico (AAS) (considerar la

a) Pesar 10 tabletas del medicamento de referencia (Aspirina/Bayer) y calcular el peso promedio.

Solución 1. Adicionar al primer matraz una alícuota de 1 mL de la solución del estándar

Solución 2. Adicionar al segundo matraz una alícuota de 2 mL de la solución del estándar

Solución 3. Adicionar al tercer matraz una alícuota de 3 mL de la solución del estándar

Solución 4- Adicionar al cuarto matraz una alícuota de 4 mL de la solución del estándar

Solución 5. Adicionar al quinto matraz una alícuota de 5 mL de la solución del estándar

Solución 6. Adicionar al sexto matraz una alícuota de 6 mL de la solución del estándar

d) Anotar los resultados en la tabla 5.

f) A cada absorbancia restar la ordenada al origen de la regresión anterior. A esta absorbancia se

g) Realizar un segundo análisis de regresión lineal con la absorbancia corregida y la concentración

i) Realizar otra regresión lineal de la concentración recuperada contra la concentración nominal.

j) Consultar criterios de aceptación según la NOM-177 e indicar si estos cumplen.

Tabla 5. Linealidad del método del medicamento de referencia (absorbancia)

Ordenada al origen: 0.2524

Tabla 6. Linealidad del método del medicamento de referencia (concentración recuperada vs

Concentración recuperada (µg/mL)