UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA / CUCEI

LICENCIATURA EN INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y

BIOTECNOLOGÍA
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

PRÁCTICA: __1__ FECHA: _ 13/02/2023 _ EQUIPO: __6__

INTEGRANTES:
1. Paloma Estefania Álvarez Manriquez
2. Daniela Berenice Navarro Reglas
3. Elizabeth Natalí Sánchez Ramírez
4. Andrea Alexandra Silva Regalado

________________________________________________________
TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL ANÁLISIS DE ALIMENTOS

Preparación de medios de cultivo

 Objetivos
1. Describir las funciones de la formulación de los medios de cultivo y su preparación.

2. Realizar procesos de esterilización a medios de cultivo y materiales de apoyo para los

ensayos microbiológicos de alimentos.

Introducción
Los requerimientos nutricionales de los microorganismos son amplios y variados, por lo que
es necesario conocer cuál es el medio de cultivo adecuado para su crecimiento. En algunas
ocasiones el microbiólogo pretende aislar y caracterizar el microorganismo de su interés, en
otras ocasiones pretende contar la biota existente en una muestra, o bien ensaya el
metabolismo microbiano de cepas y/o la sensibilidad o resistencia a los antimicrobianos a fin
de proporcionar herramientas útiles a los médicos tratantes de un síndrome clínico. Para
lograr los objetivos tendrán que familiarizarse desde el principio de su formación académica
con la formulación, preparación, esterilización (en caso necesario) y conservación de los
medios de cultivo.

El medio de cultivo es una mezcla de sustancias que proporcionan todos los nutrientes
necesarios para el desarrollo y multiplicación de los microorganismos. Los medios de cultivo
simples se utilizan para aislar, contar y conservar microorganismos de fácil desarrollo. Son
una mezcla balanceada de nutrientes en agua, con salinidad y pH controlados. No contiene
componentes complejos, ni agentes inhibidores. Como ejemplo podemos mencionar el caldo
nutritivo, agar nutritivo y agar cuenta estándar.

En la actualidad existen casas comerciales que proporcionan medios de cultivo en forma

deshidratada. En las etiquetas se encuentran datos importantes de recordar, consérvese en
lugar “seco y fresco”, “fecha de caducidad”. Lo anterior sugiere el uso y/o aplicación. Se
encuentran las proporciones de los diversos ingredientes, la cantidad de agua destilada
requerida para preparar un litro de medio de cultivo hidratado. Incluye las instrucciones para
su preparación.

El procedimiento para hidratar y preparar los medios de cultivo comprende una serie de
actividades comunes: calcular la cantidad de polvo de acuerdo al volumen requerido para el
estudio específico, pesar, hidratar, ajustar pH, clarificar ó calentar (solo en medios
semisólidos y sólidos). Distribuir en tubos de ensayo, frascos, cajas de Petri y finalmente se
aplica la esterilización, cuando el medio de cultivo lo necesita. Es indispensable vigilar
cuidadosamente el aplicar la temperatura de calentamiento durante el tiempo especificado, a
fin de evitar sobrecalentar los medios de cultivo y disminuir su calidad.

Antes de guardar los medios de cultivo preparados para su conservación (en refrigeración
cuando sea necesario), es importante recordar que hay que rotular el nombre del medio, y la
fecha de elaboración.
 Medios de cultivo y diluyentes
● Agar cuenta estándar
● Agar papa dextrosa
● Agar soya tripticasa
● Caldo nutritivo
● Medio SIM
● Agua peptonada
● Solución salina fisiológica
Materiales (por equipo)
● Cajas de petri 15 cm de Ø
● Embudo
● Gradilla
● Matraz Erlenmeyer 250 mL
● Matraz Erlenmeyer 500 mL
● Mecheros Fisher
● Probetas graduadas 100 mL
● Pipetas graduadas 10 mL
● Pipetas graduadas 5 mL
● Tela de asbesto
● Tripies
● Tubo de ensayo 13X100 mm
● Tubo de ensayo 16X150 mm

Equipos e instrumentos
● Balanza granataria
● Autoclave
● Horno de esterilización
● Termómetro de 0 a 200° C

Otros: Agua destilada, algodón, cinta testigo y papel de estraza.

Procedimiento
1. Pesar y calcular la cantidad necesaria para el volumen requerido de medio de cultivo a
preparar (Nota: verificar la calibración de la balanza granataria). Utilizar una espátula limpia y
seca para retirar el “liofilizado” el frasco de medio de cultivo, tapar herméticamente el frasco
de forma inmediata a fin de evitar que se hidrate.
2. Hidratar pero para esto se mide el volumen necesario de agua destilada, colocar la mitad en
el matraz, agregar la pesada de medio de cultivo agitando constantemente para
homogeneizar incorporando el agua restante, tratando de incorporar el medio que quedó en
las paredes del matraz. Si el medio tiene agar, hervir durante el tiempo necesario hasta su
clarificación completa (tiempo promedio 3 min) Cuida de no sobrecalentar el medio y evitar
quemarlo.
 Nota: recordar que hay que utilizar un matraz del doble del volumen de la cantidad de medio que se
va a preparar.

3. Distribuir:
● En tubo: Medir y colocar el volumen de medio de cultivo en cada tubo, rotular y esterilizar.
● En caja: Esterilizar en el matraz en que se disolvió el medio de cultivo, enfriar a 50° C, y
después hacer el vaciado en caja y área estéril.
4. Esterilización de los medios:

● Material a esterilizar: Cajas protegidas con papel Kraft (estraza).

● Tubos con tapón de algodón o baquelita colocados en una canastilla y/ó recipiente
metálico y cubiertos con papel Kraft.

● Matraces Erlenmeyer que contenga el medio de cultivo. (Recordar que el volumen del
recipiente debe ser al menos el doble de la cantidad de medio que se va a esterilizar). Cubrir
la boca del matraz con algodón y papel de estraza. Rotular.

● Colocar agua de la llave (red municipal), en la olla de presión (esterilizador de presión o

autoclave), necesaria para formar vapor (hasta la mitad de la parrilla donde se acomoda el
material).

● Acomodar el material a esterilizar en el interior del esterilizador de vapor (olla de presión o

autoclave). El material no debe sobrepasar las dos terceras partes del esterilizador.

● Generar vapor con la válvula abierta. Dejar que el vapor en forma continua se elimine
durante 30 seg. a 1 min. del esterilizador. A fin de que el vapor circule en forma homogénea.

● Cerrar la válvula.

● Esterilizar el medio de cultivo de acuerdo a las especificaciones de la casa comercial

(Relación tiempo/ temperatura, — tiempo/presión vapor). Vigilar el manómetro para que no
exista un sobrecalentamiento del medio por esterilizar.

● Al término del tiempo requerido para esterilizar el medio de cultivo, dejar enfriar hasta que
el manómetro indique “0” de presión, quitar la válvula y con precaución, abrir la tapa en
posición inversa a nuestra cara para evitar quemaduras por el vapor.

● Los tubos que contienen el medio de cultivo estéril, que requieren ser inclinada la
superficie del medio (para formar el bisel), colocarlos en el ángulo necesario antes de que se
enfríen.

● El medio de cultivo (15 a 18 ml) que se distribuye en las cajas de petri, se vaciará en área
estéril, abriendo solamente lo necesario para agregar el volumen del medio, a fin de evitar la
contaminación, El medio no deberá estar muy caliente porque se formaría una condensación
excesiva en la tapa. Las cajas deberán dejarse enfriar en superficies niveladas, con el fin de
que el medio NO quede inclinado.

● En caso de que los medios no se utilicen el mismo día se guardan en refrigeración,

protegidas de la humedad cubriendo los tubos y cajas con papel Kraft. Recordar que las
cajas con medio de cultivo se estiban con la tapa hacia abajo.

Anotar los ingredientes de los medios de cultivo preparados especificando la función

que tienen para el desarrollo microbiano.
Nombre Composición Función de Clasificación de pH Uso
del ingrediente acuerdo al
medio estado físico

Extracto de Extracto de carne: Sólido 6.0 El Agar Nutritivo es un

AN carne. proporciona fuente de +/- medio de propósitos
carbohidratos de 0.2 generales, usado en
Agar. nitrógeno y vitaminas. exámenes de agua y
otros productos, así
Digerido Agar: agente gelificante. como para el cultivo de
enzimático de una amplia variedad
gelatina. Digestivo enzimático de microorganismos
de gelatina: fuente de fastidiosos.
péptidos y aminoácidos.

Peptona. Peptona: fuente de Líquido 6.9 Medio de propósitos

CN péptidos y aminoácidos. +/- generales para cultivo
Extracto de 0.2 de una amplia
carne. Extracto de carne: variedad de
proporciona fuente de microorganismos sin
requerimientos
carbohidratos de nutricionales
nitrógeno y vitaminas. específicos.

Peptona de Peptona de caseína y Semisólido 7.3 Es un medio

SIM caseína. peptona de carne: +/- semisólido usado
fuentes de péptidos y 0.1 rutinariamente en la
Peptona de aminoácidos. diferenciación e
carne. identificación de
Amonio y Hierro (III) cultivos puros de
Amonio, Hierro citrato: fuente de iones enterobacterias y que
(III) citrato. Fe3. detecta la producción
de sulfuros, indol y
Sodio tiosulfato. Sodio tiosulfato: movilidad de las
sustrato necesario para mismas.
Agar producir ácido
sulfhídrico.

Agar: agente gelificante.

 Triptosa. Triptosa: fuente de Líquido. 6.8 Utilizado para
CL nitrógeno, vitaminas, +/- detección y recuento
Lactosa. minerales y 0.2 de coliformes en
aminoácidos. aguas, aguas
Cloruro de sodio. residuales y alimentos.
Lactosa: hidrato de
Fosfato carbono fermentable.
dipotásico.
Sales de fosfato:
Fosfato sistema buffer.
monopotásico.
Cloruro de sodio:
Lauril sulfato de balance osmótico.
sodio
Lauril sulfato de sodio:
inhibe el desarrollo de
flora acompañante.
Cuestionario

1. Registra las características fisicoquímicas del agar.

Es un hidrocoloide obtenido a partir de algas marinas de la clase Rhodophyceae a través de
un proceso de extracción que deriva en un polvo homogéneo y seco. Purificado para uso
microbiológico y caracterizado por la ausencia de agentes inhibidores, este polisacárido
estable e inerte es utilizado como agente solidificante para elaborar medios de cultivo para
microbiología.
● Tamaño de partícula: 98% pasa por un poro de 250 µm
● Humedad < 10 %.
● Cenizas < 5 %.
● pH (solución 1.5%) 0.3 máx.
● Punto de ebullición (solución 1.5%) 80-90 ºC
● Punto de gelificación 32-38 ºC.
● Fuerza del Gel> 750 g/cm2 .
● Color (420 nm) < 0.300

2. Explica el fundamento fisicoquímico del por qué la temperatura se incrementa

proporcionalmente a la presión de vapor.
La energía cinética de las moléculas que tienen bastante energía para escaparse del líquido
aumenta con la temperatura de éste. Consecuentemente, la presión del vapor de un líquido
también aumenta con la temperatura. Es decir, las partículas al estar en un constante
movimiento por el incremento de la temperatura tienen más facilidad de escaparse de la
superficie del líquido para formar un gas. La tasa a la cual el líquido se evapora para formar
un gas llega a ser eventualmente igual a la tasa a la cual el gas se condensa para formar
líquido. En este punto, el sistema se dice está en equilibrio, es decir, aumenta la presión de
vapor.

3. Expone ¿por qué es importante ajustar el pH de los medios de cultivo conforme a

las especificaciones de la casa comercial y la metodología durante la preparación?
La acidez del suelo determinará las reacciones químicas y solubilidad de los nutrientes,
consiguiendo que estos puedan ser absorbidos sin problemas por las raíces. Un rango de
pH inadecuado afecta directamente a la capacidad del sistema radicular, pues si los valores
del pH son extremos, puede derivar en una precipitación de ciertos nutrientes haciendo que
dejen de estar disponibles.

4. Anota las equivalencias en grados centígrados (ºC) de 15 lb/pulg2 de presión.

121°C a 15 lb/pulg2
5. Define que es peptona y enlista los tipos de peptona en los medios de cultivo.
Las peptonas son polipéptidos que se obtienen a partir de digestiones ácidas o enzimáticas
de las proteínas de origen animal y/o vegetal. Constituyen la principal fuente de nitrógeno en
los medios de cultivo microbiano.
● Peptona
● Triptona
● Extracto de levadura
 Desarrollo
Agua peptonada
1. Una vez que se pesaron los 2.2 gramos de peptona, se colocaron en 110 ml de agua destilada.
2. Se mezcló bien con un agitador de vidrio hasta incorporar la peptona en su totalidad.
3. Posteriormente a esto, se rotularon tubos de ensayo con las iniciales AP, para poder identificar
después estos medios de cultivo.
4. Enseguida se trasladaron a estos tubos de ensayo, 9 ml del agua peptonada con ayuda de una pipeta
de 10 ml.
5. Se llevaron a esterilización en el autoclave durante 15 minutos a 121 °C para evitar su contaminación.

Solución salina fisiológica 0.85%

1. Previamente pesados los 1.02 gramos de cloruro de sodio, se agregaron en 120 ml de agua destilada
y se mezcló con ayuda de un agitador de vidrio hasta incorporarlos.
2. Se rotularon tubos de ensayo con las iniciales S.S.F. para posteriormente colocar 9 ml de la solución
salina en cada uno.
3. Se llevaron a esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a 121 °C para evitar su contaminación.

Imágenes
 Resultados
Diagramas de flujo
Cálculos

Normatividad
● NORMA Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias
de los medios de cultivo. Generalidades.
● NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba
microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de
microorganismos patógenos.
 Conclusiones
Mediante la realización de esta práctica aprendimos a diferenciar los medios de cultivo, así como
prepararlos de manera adecuada y esterilizarlos. Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes
que son necesarios para el desarrollo y crecimiento de microorganismos. Éstos medios de cultivo se
pueden clasificar de diferentes maneras, según su uso, según su estado físico y según su uso, sin
embargo, en esta práctica solo se hizo uso de caldos (medios líquido) y agares (medios sólidos). Es
importante saber que cada medio de cultivo contiene nutrientes diferentes y en ciertas cantidades ya
que los microorganismos los utilizarán para desarrollarse y multiplicarse en el medio, de esta manera
obtendremos colonias de microorganismos.
En esta práctica se utilizaron los medios agar nutritivo, caldo nutritivo, medio SIM, y caldo lauril, así
como agua peptonada y solución salina fisiológica las cuales nuestro equipo se encargó de elaborar.
Cabe mencionar que para la preparación de los agares es necesario clarificar, es decir, llevar a
calentarlo en una placa de calentamiento. Para hacer estos medios fué necesario hacer grandes
cantidades, las suficientes para que todos los equipos tuvieran todos los medios de cultivo.

Bibliografía consultada
● López, M. (2020). La importancia del pH en los medios de cultivo. En nutricontrol. Consultado el 11
de febrero de 2023. Disponible en
https://nutricontrol.com/es/la-importancia-del-control-de-ph-en-los-cultivos/

● Águila, T. (2012). Presión de vapor. En unam. Consultado el 11 de febrero del 2023. Disponible en
https://www.ier.unam.mx/~ojs/pub/Liquid3/node6.html

● Laboratorios Britania. (2017). Agar bacteriológico. En Britania. Consultado el 11 de febrero de 2022.

Disponible en
https://www.britanialab.com/productos/producto/1/ingredientes_para_medios_de_cultivo/-/-/24/agar_b
acteriol_gico
● Lab Associates B.V. (2020, February 27). Peptonas para lab. CTV y sem. Lab Associates.
https://labassociates.com/es/productos/bioquimicos-medios-de-cultivo-y-agentes-gelificantes/peptona
s
● Certo Clave. (2020, August 19). ¿Cómo funciona un autoclave de vapor?

https://certoclav.com/es/como-funciona-un-autoclave-de-vapor/