PRACTICA No.

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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS DE ESTERILIDAD
OBJETIVO GENERAL:
Que los estudiantes aprendan a preparar los medios de cultivos adecuados para que los
microorganismos al ser sembrados, se desarrollen y faciliten su aislamiento, identificación y
cuantificación, además de someter los medios preparados a pruebas de esterilidad.

OBJETIVOS PARTICULARES:

1.-
2.-

INTRODUCCION:
Los tipos básicos de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos incluyen a los medios
complejos (no definidos) y sintéticos (químicamente definidos). En un medio complejo, la
composición química no está bien conocida, dado que contienen nutrientes como extractos
animales (p. ej., extracto de levadura) que son ricos en vitaminas, aminoácidos, minerales y otros
constituyentes como las peptonas (digeridos proteicos). Estos medios por lo general se encuentran
comercialmente de forma deshidratada y son reconstituidos con agua destilada para obtener caldos
nutritivos que fomenten el crecimiento microbiano. Los medios sintéticos son generalmente utilizados
para estudiar los requerimientos nutricionales y características de una bacteria, dado que se conoce la
composición química exacta.
Para estudiar debidamente a los microorganismos, se necesita como requisito indispensable el
cultivarlos en condiciones adecuados de laboratorio. Para lograrlo es preciso conocer cuáles son los
nutrientes y las condiciones físicas que se requieren. Mediante investigaciones extensas se
han determinado las necesidades nutricionales de las bacterias, esta investigación ha sido la causa del
desarrollo de numerosos medios de cultivo.
Los medios de cultivo pueden ser sólidos, semisólidos y líquidos, en los primeros crecen y se identifican
fácilmente las colonias.
Se requieren de diferentes sustancias químicamente puras para el cultivo de microorganismos
según sus necesidades nutricionales, para esto se utilizan ciertos materiales crudos como peptonas,
extracto de carne, extracto de levadura y otros: y así el medio de cultivo que se obtiene hace posible
el desarrollo de una gran variedad de bacterias y otros microorganismos. Cuando se desea un medio
solido se toma el agar como agente solidificante.
Ejemplos de medios líquidos, sólidos y semisólidos realmente siempre hacen posible el desarrollo
de muchas bacterias comunes. Aunque la mayoría se desarrollan bien en estos medios y otros
simplemente no se desarrollan debido a que requerimientos nutricionales muy
elaborados para nutrientes específicos, por ejemplo, las vitaminas y sustancias precursoras del
crecimiento, a estos organismos se les llama exigentes.
Estos medios de cultivo se preparan usando los ingredientes individuales necesarios o de manera más
práctica agregando agua a productos deshidratados que contienen todos los ingredientes. En el
comercio podemos encontrar todos los medios de cultivo en forma deshidratada.
En la preparación de los medios de cultivo se debe de tomar en cuenta las siguientes consideraciones:
a) Cada ingrediente o el medio deshidratado completo se deberá disolver en un volumen
adecuado de agua destilada.
 b) Se determinará el Ph del medio y se ajustara si es necesario. El pH se determinará por medio
de indicadores o por el potenciómetro. Los medios comerciales ya lo traen ajustado.
c) El medio se pondrá en recipientes adecuados, como tubos, matraces y cuyas bocas se
taparán con tapones de algodón, plástico o cubiertas metálicas.
d) Los medios se esterilizan generalmente en autoclave, algunos sensibles al calor se filtran y
otros nada más se disuelven.
e) Cuando se requieren se vierten en cajas de Petri en condiciones asépticas.

MATERIAL:

1. Olla de presión
2. Balanza granataria
3. Matraz de 500ml (1 por equipo)
4. Probeta graduada de 50 0 100 ml (1 por equipo)
5. Tubos de ensaye con y sin tapón de rosca (18 por equipo)
6. Mecheros
7. Fab líquido y 1 escobillón para tubos por equipo
8. Cuadros de papel aluminio
9. Agua destilada
10. Pipeta graduada (1 de 5 y 10 ml por equipo)
11. Gradilla metálica (1 por equipo)
12. Espátulas
13. Cajas de Petri desechables
14. Papel estraza

MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS COMERCIALES:

a) C a l d o nutritivo CN)
b) A g a r nutritivo (AN)
c) A g a r papa dextrosa (PDA)
d) A g a r mínimo en sales (AMS)

MATERIAL QUE DEBERÁN TRAER LOS ALUMNOS (equipo):

1. Maskintape
2. Algodón
3. Marcador de aceite de punto fino
4. Una regla con escala milimétrica de 30 cm
5. Una tela sin pelusa
6. Tijeras
7. Cerillos o encendedor
8. Esponja
9. Calculadora
PROCEDIMIENTO:
A. Preparación de medios de cultivo en placas:
1. Revisar que todo el material que se vaya a utilizar este limpio, en buen estado y completo.
2. Lavar su material, el de cristalería se lava utilizando detergente líquido, enjuagar con abundante
agua de la llave y después con agua destilada, secar el material con una tela que no deje
pelusa.
3. Revisar las indicaciones de los instructivos que tienen cada uno de los medios de cultivo
deshidratados y que serán utilizados.
4. Hacer cálculos para la preparación de los medios de cultivo y del volumen de agua destilada
que se vaya a utilizar, esto es mediante una regla de tres.
5. Se mide la cantidad de agua destilada con una probeta graduada y colocar una porción del
volumen calculado en el matraz que se vaya a utilizar.
6. Con una espátula tomar el medio de cultivo deshidratado de acuerdo a los cálculos realizados
y al peso obtenido, colocar este en un cuadro de papel aluminio y pesarlo cuidadosamente con
la ayuda de una balanza granataria.
7. Colocar el medio de cultivo pesado en el matraz que contiene agua destilada, agregar el resto
de agua contenida en la probeta y en seguida colocar un tapón de algodón ajustado a la boca
del matraz.
8. Mover el medio de cultivo cuidadosamente hasta que se disuelva en su totalidad, en seguida
calentarlo y esperar que se disuelva e hierva durante un minuto a través de la llama del
mechero, tener cuidado de que no se tire, posteriormente colocarle un gorrito de papel, etiquetar
y esterilizar por calor húmedo en la olla de presión, (tome en cuenta a que temperatura y
tiempo según especificaciones del fabricante).
9. Al terminar el proceso de esterilización enfriar el medio aproximadamente hasta 45 oC.
Generalmente se llega a esta temperatura cuando se puede tolerar el calor del matraz al
ponerse en contacto con la superficie interna del antebrazo o el dorso de la mano.
10. Realizar el vaciado en las placas.

B. Vaciado en placas:
1. Desinfectar el área de trabajo (de acuerdo al desinfectante que se esté utilizando).
2. Colocar un cuadro de papel de estraza (de preferencia un pliego completo y fijarlo con cinta
maskintape por la esquina a la mesa de trabajo).
3. Prender los mecheros (de preferencia dos) y esperar entre 3 a 5 minutos con la finalidad de
trabajar en condiciones de esterilidad, es importante trabajar dentro del área de seguridad que
proporciona la flama del mechero (aproximadamente 30 cm de diámetro por mechero).
4. Agitar el contenido del matraz y quitar el tapón de algodón, flamear el borde de la boca del
matraz con agar y levantar la cubierta de la caja de Petri con la mano izquierda si es diestro
o derecha si es zurdo, de manera que la base de la caja de Petri repose sobre la palma de la
mano y la tapa pueda manipularla hacia arriba y hacia abajo con el pulgar y dedo medio.
5. Verter aproximadamente de 15 a 18 cm de medio de cultivo y hacer girar la caja de petri
suavemente para distribuir uniformemente el agar. Si el medio presenta burbujas de aire hay
que eliminarlas mediante un pase rápido con la flama del mechero, dejar solidificar en un tiempo
de más o menos 15 a 20 minutos.
6. Una vez que se han enfriado y solidificado, etiquetar y colocar las cajas con la tapa hacia
abajo y en seguida guardarlas en el refrigerador hasta la siguiente sesión de laboratorio.
NOTA: Antes de guardar las cajas de Petri en el refrigerador deberán someterse a pruebas de
esterilidad colocándolas en la estufa bacteriológica durante 24 horas a 37 0 C, y después de este
tiempo se guardan en el refrigerador.

C. Preparación de medios de cultivo en tubo (caldo y agar nutritivo)

1. Repetir los pasos del 1 al 8 del inciso A. Los medios de cultivo en caldo y en agar, no es
necesario fundirlos a la flama del mechero.
2. Colocar a cada tubo de ensaye de 13 x 100 mm de 2.5 a 3 ml aproximadamente del medio de
cultivo indicado.
3. Colocar a cada tubo de ensaye tapón de algodón, colocarlos en un bote de lámina, cubrir el
bote con un gorro de papel estraza, etiquetar y esterilizador por calor húmedo.
4. Al término de la esterilización, dejar enfriar. Los tubos con agar nutritivo se dejan inclinados
hasta solidificarse totalmente.
5. Después de que el medio de cultivo se ha enfriado y solidificado (más o menos 15 minutos)
colocarlos en refrigeración hasta la siguiente sesión de laboratorio donde se van a utilizar.
NOTA: Prepara solamente la cantidad que se necesite de los medios de cultivo mencionados
anteriormente, siguiendo cada una de las instrucciones (consultar el manual de medios de
cultivo o el instructivo anexo en cada uno de los frascos comerciales). Considerando que cada
placa requiere de 15 a 18 ml de medio de cultivo, los tubos de 13 x 100 ml de 2.5 a 3 ml y los
tubos de 16 x 150 mm de 9 a 10 ml.
6. Preparar 20 ml de caldo nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Vaciar 3 ml. en
cada tubo, preparar ocho tubos con tapón de algodón y de rosca que deberán cerrar sin llegar
al tope.
7. Prepara 250 ml. de agar nutritivo (AN), calentar la mezcla con la ayuda de un mechero
Fisher o bunsen con agitación constante hasta llegar a ebullición, durante un minuto (cuidar
que no se proyecte hacia afuera del matraz) y vaciar en seguida 3 ml. de medio en ocho
tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique en
ella el agar. El resto del medio se esteriliza en la autoclave u olla de presión.
8. Preparar 250 ml. de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer
de 250 o 500 ml.
9. Calentar la mezcla con la ayuda de un mechero Fisher o bunsen con agitación constante
hasta llegar a ebullición, durante un minuto (cuidar que no se proyecte o se derrame hac ia
afuera del matraz). Vaciar en seguida 3 ml. del medio en ocho tubos con tapón de algodón y de
rosca. El resto del medio se esteriliza en la autoclave.
10. Prepara 200 ml. de medio de cultivo mínimo de sales (MM), en un matraz Erlenmeyer de 500
ml (seguir el mismo procedimiento de preparación de los medios anteriores) y esterilizar en
autoclave.
Esterilización de medios de cultivo:
1. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones:
2. Colocar la autoclave sobre el tripie.
3. Encender los mecheros para empezar a calentar la autoclave la cual debe contener agua
en su interior.
4. Revisar que el nivel del agua sea el adecuado, no debe tocar la parrilla que se encuentra
en el interior.
5. Colocar tu matraz en el interior de la autoclave.
 6. Ciérrala siguiendo las indicaciones del profesor.
7. Una vez que empiece a salir vapor, coloca la válvula, para que la presión comience a subir.
8. Tiene que llegar hasta 15 libras de presión o 121 0C., según las indicaciones de cada uno de
los medios a esterilizar.
9. A partir de este momento, deberás tomar el tiempo de 15 minutos o el que se indique para
cada medio de cultivo o material.
10. Deberás tener cuidado de que la presión de la autoclave, nunca rebase los 15 libras, ni que
esté por debajo de las 15 libras. Esto se puede controlar regulando la flama de los mecheros
según te indique el profesor.
11. Transcurridos los 15 minutos, apaga los mecheros, y dejar que se enfrié a temperatura
ambiente hasta llegar a cero libras de presión, quitar la válvula de seguridad y la autoclave
puede abrirse ¡Antes no ya que podría ocurrir un accidente!
12. La autoclave se abre desde atrás, procurando que nadie quede de frente hacia donde se abre
la tapa, ya que saldrá mucho vapor caliente que causa quemaduras. Una vez que se abrió con
cuidado, con ayuda de un trapo o de un guante de asbesto, sacar el matraz y dejar que baje su
temperatura hasta que este tibio y pueda vaciarse en las cajas de Petri.
13. Si ya no se va a utilizar la autoclave nuevamente, vaciar el agua c o n cuidado de no
quemarse, lavarla, secarla y guardarla.

Preparación de las cajas de Petri y tubos con medio de cultivo:

1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada
de tal forma que el medio solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm., de la boca del
tubo.
2. Dejar que los medios de cultivo que están en matraces y que se han sacado de la autoclave
se enfríen a una temperatura aproximada de 40 -50 0C que coincide con la posibilidad de
sostener el matraz en el dorso de la mano sin sentir un calor excesivo.
3. Cerca del mechero, etiquetar 8 cajas con AN, 8 cajas con PDA y 8 cajas con MM. Los medios
de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente 15 – 18 ml) en una zona
aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos), posteriormente envolver las cajas
cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsas de plástico
limpias (de preferencia nuevas).
5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

NOTA: Antes de guardar las cajas en refrigeración deben someterse a pruebas de esterilidad, durante
24 horas a 37 0C,

Pruebas de esterilidad de materiales:

1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa
de incubación ajustada a 37 0C durante 24-48 horas.
2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición
de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido;
así como la formación de colonias microbianas en la superficie de los medios sólidos.
3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio
durante 1 minuto en el laboratorio o en zonas accesorias al mismo y se etiquetaran como “al
aire”.
 4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero
5. y se etiquetara “en área aséptica”
6. La tercera caja se conservará sin abrir y se etiquetará como “control”.
7. Incubar todas las cajas y tubos durante 24 horas y anotar los resultados.
8. Para los resultados hacer la descripción crecimiento obtenido en las cajas con diferentes
medios de cultivo (AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control.
9. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++)
crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
10. Discuta los resultados y determine si la esterilización en la autoclave fue la adecuada, así
como el manejo de los materiales y medios de cultivo en su elaboración.
11. Reporte sus resultados en una tabla como la que se presenta a continuación:

TABLA 1

Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo:

MEDIO DE CULTIVO Abierta al aire Abierta en área Control

aséptica

AGAR NUTRITIVO

PAPA DEXTROSA AGAR

MINIMO EN SALES

NOTA: El tamaño de la tabla de resultados queda a su consideración, Para reportar los resultados de
los tubos puede hacerlo en una tabla similar o como usted lo considere correcto.
RUTA DE TRABAJO: Colocar el o los procedimientos con imágenes o dibujos de forma
secuenciada.

RESULTADOS: Reportar los cálculos obtenidos en la elaboración de los medios de cultivo, la tabla
de resultados incluyendo fotografías del crecimiento en cada caja y tubos si es que los observo.

DISCUSIÓN: Colocar el análisis de los resultados obtenidos.

CONCLUSIÓN: Cabe recordar que la conclusión está basada en los objetivos y en los resultados de
la práctica.
Colocar una lista enumerando las conclusiones pertinentes del proceso experimental o bien una sola.
Estas conclusiones deben ser afirmaciones simples y breves basadas en sus resultados y objetivos
planteados

BIBLIOGRAFÍA: libros, artículos y páginas electrónicas consultados para obtener la información para
la introducción de su práctica. (deberán incluir por lo menos 2 páginas electrónicas, 2 libros de texto o
2 artículos científicos indicando las páginas consultadas).

CUESTIONARIOS: se asignarán 10 preguntas sobre la práctica correspondiente por parte del

docente.