Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

BIOQUÍMICA LABORATORIO

Práctica 4. Separación e Identificación de proteínas

lácteas por Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

Equipo 7

Arellano Garza Eunice Valeria

Bautista Cordero Jesús Gabriel
Martínez Chaverria Ian Manuel
Mariscal Arriaga Melissa Maureen
Miguel Cruz Ian Uxue

CARRERA: MEDICINA VETERINARIA Y

ZOOTECNIA

Profesores a cargo:
MVZ Francisco Javier Cervantes Aguilar
Dra. Ana Elvia Sánchez Mendoza
 ÍNDICE
RESUMEN..................3

INTRODUCCIÓN...........4

MARCO TEÓRICO................5

OBJETIVOS..............6

MATERIAL Y METODOLOGÍA.......7

RESULTADOS OBTENIDOS..............8

DISCUSIÓN........................9

CONCLUSIONES....................10

BIBLIOGRAFIA..................11
 RESUMEN
Se llevó a cabo la separación e Identificación de proteínas lácteas, con el objetivo de
comprender los principios de la separación de proteínas, conocer la importancia de los
marcadores de peso molecular e identificar las proteínas separadas y determinar su
peso molecular. Para lograr esto se utilizó la técnica de Electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS. En esta técnica se mezclan las proteínas con el detergente SDS
para formar complejos desnaturalizados, formando a lo largo de la práctica dos geles
de distinta porosidad y pH, que primero compactan las muestras (en el gel
compactador) y luego las separan ( en el gel separardor).

Para esta práctica la muestra biológica que se utilizará será la leche, cuya proteína
representativa es la caseína.

durante la práctica se pasan por varios pasos, para esto será importante el uso de
guantes en todo momento, ya que la acrilamida es neurotoxica, así como limpiar las
placas de vidrio y cualquier superficie que aya tenido acrilamida, colocar las placas de
vidrio de tal forma que no aya fuga y poder agregar las soluciones, primeramente para
preparar el gel compactado, utilizando para esto 5 diferentes reactivos y soluciones
que son: Agua destilada, Acrilamida 30% / Bis- acrilamida 0.8%, Tris-CI 4X/SDS pH
8.8, Persulfato de amonio (APS) 10% y TEMED 8.4%, todos esto colocándolo en las
placas de vidrio. Para preparar el gel separador se utiliza: Agua destilada, Acrilamida
30% / Bis-acrilamida 0.8%, Tris-CI 4X/SDS pH 6.8, Persulfato de amonio (APS) 10% y
TEMED 8.4%. Una vez agregando el TEMED en ambos casos la polimerización iniciará.

Finalmente se registran los resultados obtenidos, calculan los valores de peso

molecular de las proteínas obtenidas, con ayuda del marcador de peso molecular
(Albúmina de suero bovino), determinar cuantas proteínas contiene la muestra que
recibió e identificar cuál es la proteína más abundante.
 INTRODUCCIÓN
¿Qué es la electroforesis en gel? Es una técnica de laboratorio que se empeñó en separar
moléculas en función de su peso y su carga.
¿Cómo funciona? Esta técnica se basa en el diferente movimiento de las moléculas cargadas
eléctricamente a través de la superficie hidratada de un medio sólido. Al hacer pasar una
corriente sobre este medio, las moléculas con una carga negativa, se mueven hacia el polo
positivo, mientras que las moléculas con carga positiva, se ven atraídas hacia el polo
negativo.

Imagen tomada de:https://genotipia.com/electroforesis/

En este caso utilizamos la electroforesis en gel, debido a que se tiene que separar por
su peso, entre mayor peso tenga una molécula menor será su corrimiento y entre
menor sea su peso mayor será su corrimiento.
¿Qué es el SDS? Es un detergente que se utiliza en el ámbito de limpieza gracias a su
poder tenso activo, se utiliza en pasta dental, jabones, etc.
Al usarlo de sebe de tener suma precaución debido a que puede causar daño en la piel,
en algunas personas más que en otras. En el experimento se utilizará este SDS como
fase móvil en esta electroforesis
 ¿Qué es TEMED? Es un ácido que se utiliza como un agente oxidante muy fuerte, se utiliza
como un blanqueador, se puede utilizar como polimerización de los plásticos, textil y
mecánica, tiene un olor desagradable y es estable si se almacena de una forma correcta.
¿Proteínas de la leche?
Beta-lactoglobulina
Es una proteína propia de la vaca. Cuando se hierve la leche, esta proteína forma parte de la
capa de nata que aparece en la superficie.
Alfa-lactoalbúmina
Es una proteína que favorece la unión de la glucosa con la galactosa para la síntesis la
lactosa.
Caseína
Existen varios tipos de caseínas que son la alfa-caseína, la beta-caseína, la kappa-caseína y
la gamma-caseína. En la vaca comprende hasta un 80% de esta proteína.

Imagen tomada de: https://realidadfitness.com/suplementos/caseina/attachment/proteina-de-

leche/
 MARCO TEÓRICO
Electroforesis en gel de acrilamida: La electroforesis en gel de acrilamida es el
proceso de separar proteínas, a través de un gel de acrilamida. Para preparar este
gel, se combinan acrilamida y bisacrilamida con un TEMED.
Tris SDS Buffer (pH 6.8), se utiliza para que las proteínas se puedan mover por la
placa, cuando se le aplica electricidad.
Tris SDS Buffer (pH 8.8), se utiliza para mejorar la visualización, esto debido a que
concentra las proteínas.
¿Qué son las proteínas?
Son cadenas formadas por muchos aminoácidos, los cuales les dan función y
estructura a esa proteína. Cada proteína tiene una función específica, además de
existir 20 aminoácidos específicos en estas proteínas.

Tabla tomada
de:https://medlineplus.gov/spanish/genetica/entender/comofuncionangenes/
proteina/
¿Qué es el azul de coomassie? En química se utiliza para teñir algunos reactivos,
al estar en contacto con las proteínas este se estabiliza y por ende tiñe, el color
del tinte puede variar dependiendo la solución a la que se aplique, por ejemplo,
en este experimento se tiñe color azul, pero puede tomar un color rojo/verde
Cámara de electroforesis:

La cámara de electroforesis es un dispositivo utilizado en biología molecular y

genética para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su
tamaño y carga eléctrica. Se utiliza en técnicas como la electroforesis en gel y la
electroforesis en papel.

como funciona:

Preparación del gel: Se crea un gel de agarosa o poliacrilamida, que actúa como
una matriz en la que se producirá la separación de las moléculas. La
concentración del gel se elige en función del tamaño de las moléculas que se
desean separar. Un gel de mayor concentración se utiliza para separar
moléculas más pequeñas.

Carga de las muestras: Las muestras de ADN, ARN o proteínas se mezclan con
un tampón de carga que proporciona una carga negativa uniforme a las
moléculas. Luego, se aplican en los pocillos en un extremo del gel.

Aplicación de un campo eléctrico: Se aplica un voltaje a través del gel, creando

un campo eléctrico. Como las moléculas cargadas son atraídas hacia el polo
opuesto al de su carga (ADN y ARN generalmente tienen carga negativa debido
a sus grupos fosfato), comienzan a moverse a través del gel.

Separación por tamaño: Las moléculas se mueven a través del gel a diferentes
velocidades según su tamaño. Las moléculas más pequeñas se desplazan más
rápido y avanzan más lejos en el gel, mientras que las más grandes se mueven
más lentamente y quedan más cerca del punto de inicio.

Visualización de los resultados: Una vez que la electroforesis ha tenido lugar

durante un período de tiempo adecuado, el gel se retira de la cámara y se tiñe
con un colorante que se une a las moléculas de ADN, ARN o proteínas. Esto
permite visualizar las bandas en el gel, que representan las moléculas separadas
según su tamaño.

https://pagina.fciencias.unam.mx/vida-en-ciencias/instalaciones/instalaciones-academicas/laboratorios/bioq-
inmuno-biomol
 ¿Que son los aminoácidos?

Los aminoácidos son los componentes básicos de las proteínas, que son
macromoléculas esenciales para la vida. Son moléculas orgánicas que contienen un
grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos a un átomo de carbono
central, llamado carbono alfa (α), y un grupo lateral variable denominado "cadena
lateral" o "R". Hay 20 aminoácidos comunes que se utilizan para construir una amplia
variedad de proteínas en los seres vivos. La secuencia específica de aminoácidos en una
proteína determina su estructura y función.

¿Para que sirven los aminoácidos?

Los aminoácidos tienen múltiples funciones esenciales en el cuerpo humano y en

otros organismos. Algunos de sus principales roles son:
Construcción de proteínas: Los aminoácidos son los bloques de construcción de las
proteínas. Se unen mediante enlaces peptídicos para formar cadenas polipeptídicas,
que luego se pliegan en estructuras tridimensionales para llevar a cabo diversas
funciones en el organismo.
Crecimiento y reparación: Los aminoácidos son fundamentales para el crecimiento,
desarrollo y reparación de tejidos en el cuerpo, como músculos, piel, cabello y
órganos.
Enzimas y metabolismo: Algunos aminoácidos son precursores de enzimas y
coenzimas, que desempeñan un papel clave en las reacciones químicas del
metabolismo.
Transporte de nutrientes: Algunos aminoácidos, como la glutamina, están
involucrados en el transporte de nutrientes esenciales a través del torrente
sanguíneo.
Sistema inmunológico: Los aminoácidos son importantes para el funcionamiento
adecuado del sistema inmunológico, ya que ayudan a producir anticuerpos y células
del sistema inmunológico.
Neurotransmisores: Los aminoácidos también son precursores de
neurotransmisores, como la serotonina y la dopamina, que desempeñan un papel
crucial en la función cerebral y el equilibrio emocional.
Energía: En situaciones de necesidad energética, algunos aminoácidos pueden ser
descompuestos y utilizados como fuente de energía.

(Zagoya, s. f.)
 OBJETIVOS
Comprender los principios de la separación de proteínas por medio de
la técnica de electroforesis.
Conocer la importancia de los marcadores de peso molecular para la
identificación de las proteínas separadas.
Identificar las proteínas separadas y determinar su peso molecular

MATERIALES
Cámara de electroforesis (una por cada 2 equipos)
2 placas de vidrio (por equipo)
1 fuente de poder (por c/dos equipos)
Micropipeta de 2-20µl (por c/dos equipos)
Micropipeta de 20-200µl (por c/dos equipos)
Micropipeta de 200-1000µl (por c/dos equipos)
Puntas para micropipetas
3 pipetas de 5mL
propipeta

MATERIAL QUE DEBERÁ TRAER CADA EQUIPO

1 par de guantes de látex y cubrebocas (por integrante)
Charola de plástico con tapa de 12x12 cm
Plumón de tinta indeleble
REACTIVOS Y SOLUCIONES
Acrilamia 30%/Bisacrilamida 0.8%
Tris-C1 4X/SDS pH 8.8
Tris-C14X/SDS pH 6.8
TEMED 8.4%
Persulfato de amonio 10%
Buffer de corrimiento pH 8.6
β-mercaptoetanol
Buffer regulador
Solución de Azul de coomassie
Solución desteñidora
Solución de albúmina de suero bovino

MUESTRA BIOLÓGICA
Leche de cualquier especie animal preparada previamente con
buffer regulador de muestra pH 8.6 y β-mercaptoetanol.
 METODOLOGÍA
1- Usaremos guantes de látex y cubre bocas durante todo el experimento
2- A cada equipo se le proporcionará un par de placas de vidrio que
limpiarán con SDS al 0.2% y toallas absorbetes.

Preparación del
Gel

-Los cristales para electroforesis limpios con SDS 0.2, se colocarán en los
soportes de armado y estos a su vez en la base respectiva. Para descartar
alguna fuga de líquido, llenaremos el espacio entre ambos cristales con
agua destilada.
- Después sin desarmar el dispositivo, desecharemos el agua y se secarán
los cristales introduciendo entre las placas papel filtro
- Prepararemos 2 geles, un gel separador que como su nombre lo indica
sirve para separar las proteínas de la muestra y otro llamado
concentrador , que va encima del anterior y sirve para concentrar las
proteínas de la muestra, de tal modo que su recorrido por el gel separador
sea uniforme.
La preparación de estos geles es la siguiente:

Gel separador

Reactivos o soluciones Volumen

Agua destilada 3000µl

Acrilamida 30%/Bis-acrilamida 0.8% 3000µl

Tris-CL4X/SDS pH 8.8 1900µl

Persulfato de amonio (APS) 10% 75µl

TEMED 8.4%* 10µl

 Gel concentrador

Reactivos o soluciones Volumen

Agua destilada 1300µl

Acrilamida 30%/Bis-acrilamida 0.8% 900µl

Tris-CL 4X/SDS pH 6.8 1250µl

Persulfato de amonio (APS) 10% 75µl

TEMED 8.4%* 10µl

*Una vez que se agregue este reactivo, la polimerización iniciará

-Primero prepararemos el gel separador, vaciamos esta mezcla entre

los cristales con una micropipeta dejando espacio para el gel
concentrador, de aproximadamente 1.5 cm. Debemos tener cuidado
de no dejar burbujas dentro de la mezcla, para evitar distorsiones
durante el corrimiento electroforético de la muestra.
-Agregamos cuidadosamente 200µL de agua, sin mezclar con el gel
separador, para que cuando éste gelifique, se diferencie el gel del
agua.
-Una vez gelificado, retiramos el agua y secamos la superficie del gel
cuidadosamente con papel filtro.
-Agregamos posteriormente el gel concentrador y antes de que
gelifique, introducimos el peine para formar los pozos donde serán
agregadas las muestras.
-Una vez gelificado, retiramos el peine.
-Sin separar las placas de vidrio, colocamos el gel en la cámara de
electroforesis y procederemos a llenar esta cámara con el
amortiguador de corrimiento.
 PREPARACIÓN DEL CORRIMIENTO
1. Colocamos en el segundo pozo 20µL de marcador de peso molecular
que consistirá en una solución de albumina de suero bovino y 20µLde
muestra en el resto de los pozos.

2. La cámara de electroforesis, ya con el gel cargado con las muestras

correspondientes será cerrada y conectada a la fuente de poder,. Esta la
encenderemos y programaremos para efectuar la electroforesis, por 2
horas aproximadamente a 120v.
3. El término del corrimiento de la electroforesis, será cuando el
colorante azul de bromofenol que contiene el buffer regulador de
muestra, llegue al final del gel.
4. La fuente de poder se apagará y entonces desconectaremos la cámara
de electroforesis
5. Desmontamos cuidadosamente las placas de vidrio y con una espátula
hacer palanca entre las dos placas y separar el gel.
6. El buffer de corrimiento puede conservarse para otro corrimiento

TINCIÓN
1. Colocaremos el gel en un recipiente con solución acuosa de azul de
coomassie para su tinción.
2. Colocamos el recipiente en un agitador orbital con movimiento
moderado, las bandas de proteínas teñidas pueden verse en menos de
una hora si el colorante esta recién preparado o al día siguiente si ya
ha sido usado
3. Posteriormente se destiñe con solución desteñidora, se vuelve a poner
con esta solución en el agitador
4. Finalmente observamos las bandas de proteínas al día siguiente.
 RESULTADOS
PROTEINAS ENCONTRADAS EN LA MUESTRA DE LECHE

CM QUE AVANZÓ
PROTEINAS PESO MOLECULAR

54358.49057
k-caseínas 4.3 cm
Daltons

Β-caseínas 3.8 cm 48037.73585 Daltons

Albúmina 5.3 cm 67000 Daltons

α-lactoalbúmina 2.9 cm 36660.37736 Daltons

Β-lactoglobulina 2.5 cm 31603.77358 Daltons

Para calcular el peso molecular de las 4 proteínas que salieron en el

experimento, hicimos una regla de 3, la cual es los cm que avanzó en el gel
por 67000 (el pesomolecular de la Albúmina) entre 5.3 qué es lo que
avanzó la albúmina.

En la muestra se encuentra la κ-caseínas (proteína principal de la leche),

β-caseínas, α-lactoalbúmina, β-lactoglobulina. La κ-caseínas es la más
abundante ya que se puede ver que es la que está más arriba y está cerca
de la albúmina.
 Discusión
La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar y analizar
moléculas cargadas, como ADN, ARN, proteínas y otros macromoléculas, en
función de su movilidad en un gel o medio líquido cuando se aplica un campo
eléctrico. Esta técnica se basa en la diferencia en la velocidad de migración de
las moléculas cargadas en respuesta a la fuerza eléctrica aplicada.El proceso
general de la electroforesis implica lo siguiente:

Preparación del gel o medio: Se crea un gel (como un gel de agarosa o un gel de
poliacrilamida) o se utiliza un medio líquido en una bandeja. Este gel o medio
actúa como una matriz a través de la cual las moléculas se moverán durante la
electroforesis.

Carga de las muestras: Las muestras que se desean analizar se cargan en

pozos o ranuras en el gel. Estas muestras generalmente se mezclan con un
tampón de carga que puede contener colorante para ayudar a visualizar la
migración.

Aplicación de un campo eléctrico: Se aplica una corriente eléctrica al gel,

creando un campo eléctrico a través del gel. Como resultado, las moléculas
cargadas dentro del gel se ven impulsadas hacia el electrodo opuesto.

Separación y detección: Las moléculas migran a través del gel de acuerdo con
su tamaño y carga. Las moléculas más pequeñas y menos cargadas tienden a
moverse más rápido que las más grandes o más cargadas. Después de un
período de tiempo, se detiene la electroforesis y se pueden visualizar las
moléculas separadas utilizando técnicas de tinción o detección específicas,
según el tipo de moléculas que se estén analizando.
 Discusión
Las K- caseinas avanzaron 4.3 cm, y esto sucede porque la K caseína avanza en la
electroforesis debido a su carga eléctrica negativa y su movilidad en respuesta al campo
eléctrico aplicado, lo que permite su separación y análisis en función de sus propiedades
eléctricas y físicas. (Urban et al., 1998)

En las B- caseinas el recorrido fue de 3.8 cm, en este caso las B-caseínas suelen tener una
carga neta negativa, en la electroforesis, las moléculas con carga neta negativa tienden a
migrar hacia el electrodo positivo, mientras que las cargadas positivamente migran hacia el
electrodo negativo. Acompañando el tema de las cargas se puede decir que recorrió una
distancia menor por qué sus moléculas son más grandes a las de las K- caseinas. (Doval &
Arteaga, 2021).

La albumina recorrió 5.3 cm porque tiene una carga eléctrica neta negativa debido a la
presencia de grupos funcionales con cargas negativas en su estructura, aparte de que es
una molécula relativamente grande y globular en comparación con otras proteínas en el
suero sanguíneo. Su tamaño y forma pueden influir en la velocidad de migración en el gel
de electroforesis.(Electroforesis de proteínas séricas | Cigna, s. f.).

A- lactoalbumina se desplazó 2.9 cm porque cuando se somete a la electroforesis, un

proceso utilizado para separar proteínas según su carga eléctrica y tamaño molecular, la A-
lactoalbúmina se desplaza debido a su carga eléctrica.En la electroforesis, las proteínas se
mueven a través de un gel o un medio en respuesta a un campo eléctrico aplicado. La
velocidad y la dirección del movimiento de una proteína dependen de su carga eléctrica. La
A-lactoalbúmina, al igual que otras proteínas, tiene carga eléctrica debido a los grupos
funcionales de sus aminoácidos. Estos grupos pueden estar cargados positiva o
negativamente, lo que determina la dirección en la que se moverá la proteína en el gel
durante la electroforesis.(Gale - Enter Product Login -, s. f.)

En el caso de la b- lactoalbumina se desplaza 2.5 cm porque en la electroforesis, las

proteínas se separan en función de su carga eléctrica y tamaño molecular. La β-
lactoalbúmina, al igual que la α-lactoalbúmina, tiene grupos funcionales de aminoácidos
que pueden estar cargados positiva o negativamente. Estas cargas eléctricas interactúan
con el campo eléctrico aplicado durante la electroforesis, lo que hace que la proteína se
desplace a través del gel en una dirección específica.(Gale - Enter Product Login -, s. f.)
 Conclusiones
Para concluir podemos decir que esta práctica nos fue de bastante ayuda para
comprender los principios de la separación de proteínas, en este caso de la
leche, que es un producto de nuestro día a día, todo esto favoreciendo el
cumplimiento de los objetivos planteados al inicio de la práctica, entre ellos
el comprender los principios de la separación de proteínas por medio de la
técnica de electroforesis y conocer la importancia de los marcadores de peso
molecular para la identificación de las proteínas separadas.

Esta práctica a sido un gran complemento para el tema de proteínas

abordadlo durante la clase de teoría, favoreciendo el aprendizaje y
entendimiento de conceptos posiblemente no entendidos durante clase.

Finalmente podemos decir que comprendimos la relevancia que tiene este

tema pra nuestra formación como Médicos Veterinarios y posteriormente
para nuestra vida profesional, ya que al determinar el peso molecular de una
proteína nos permitirá saber si se encuentra en un rango normal o de lo
contrario hacer las modificaciones y procedimientos necesarios para corregir
esto.
 BIBLIOGRAFÍAS
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