Resumen: clonación de ADN

Puntos más importantes:

 La clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace muchas copias idénticas de un
fragmento de ADN, como un gen.
 En un experimento típico de clonación, se inserta un gen blanco en un fragmento circular de ADN
llamado plásmido.
 El plásmido se introduce en bacterias mediante un proceso llamado transformación y las bacterias
que contengan el plásmido se seleccionan mediante antibióticos.
 Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para hacer más ADN plasmídico o, en algunos
casos, se induce la expresión del gen para hacer proteína.

Introducción

Cuando escuchas la palabra "clonación" tal vez pienses en la clonación de organismos completos,
como Dolly la oveja. Sin embargo, lo único que significa clonar algo es hacer una copia
genéticamente exacta de ese algo. En un laboratorio de biología molecular, lo que se clona con más
frecuencia es un gen u otro fragmento pequeño de ADN.

Si tu amiga la bióloga molecular dice que su "clonación" no está funcionando, es casi seguro que
está hablando de copiar fragmentos de ADN, ¡no de hacer la siguiente Dolly!

Resumen de la clonación de ADN

La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular

de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de
interés (tal vez el gen de una proteína humana médicamente importante) se inserta primero en un
fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y
pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos
provenientes de múltiples fuentes.
 Diagrama que muestra la construcción de una molécula de ADN recombinante. Un fragmento
circular de ADN plasmídico tiene extremos irregulares que coinciden con los de un fragmento del
gen. El plásmido y el fragmento de gen se unen para producir un plásmido que contenga el gen. Este
plásmido que contiene el gen es un ejemplo de ADN recombinante, una molécula de ADN
ensamblada a partir de ADN de múltiples fuentes.

A continuación, se introduce el plásmido recombinante en bacterias. Se seleccionan las bacterias

que contengan el plásmido y se cultivan. Al reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su
descendencia, y de esta forma hacen copias del ADN que contienen.

¿Qué sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un plásmido? En algunos
casos, necesitamos muchas copias de ADN para realizar experimentos o construir nuevos
plásmidos. En otros casos, el fragmento de ADN codifica una proteína útil y las bacterias se utilizan
como "fábricas" para producir la proteína. Por ejemplo, el gen de la insulina humana se expresa en
bacterias E. coli para producir la insulina que usan los diabéticos.

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Como sabrás, si tienes amigos o familiares diabéticos, la hormona insulina juega un papel
importante en la salud humana. En el cuerpo de una persona sana, el páncreas produce insulina.
Esta hormona viaja por el torrente sanguíneo y se une a las células del cuerpo para permitir la
absorción del azúcar glucosa.

En una persona con diabetes tipo I, las células del páncreas que producen insulina están dañadas o
destruidas. Las personas con diabetes tipo I regularmente deben inyectarse con insulina que se
obtuvo de otra fuente para prevenir concentraciones peligrosamente altas de glucemia (y para
permitir que el azúcar entre a las células del cuerpo como combustible).
 Durante muchos años, toda la insulina utilizada por personas con diabetes tipo I se obtenía del
páncreas de cerdos y vacas que habían sido sacrificadas por su carne. La molécula de insulina es
similar entre los seres humanos, cerdos y vacas, por lo que la insulina de cerdo o vaca puede
sustituir la insulina humana en el cuerpo de personas con esta enfermedad.

Sin embargo, a partir de la década de los 80, científicos desarrollaron nuevas técnicas para obtener
insulina humana mediante bacterias Escherichia coli (E. coli). Básicamente, convirtieron las
bacterias en pequeñas fábricas productoras de insulina. Esta insulina recombinante, insulina
obtenida de combinar ADN de múltiples fuentes (seres humanos y bacterias), es ahora el principal
tratamiento utilizado por personas con diabetes tipo I.

Los pasos de la clonación de ADN

La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos cómo la clonación
de ADN se puede utilizar para sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los
pasos básicos son:

1. Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de restricción (que
cortan el ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).
2. Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con antibióticos para identificar las bacterias
que incorporaron el plásmido.
3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas como "fábricas" para producir
la proteína. Recolectar la proteína de las bacterias y purificarla.
Revisemos con más detalle cada paso.

1. Cortar y pegar el ADN

¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? Un método habitual utiliza dos
tipos de enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasa(Se abre en una ventana nueva)(Se abre en
una ventana nueva).

Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta
el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción
producen extremos de cadena sencilla cortos que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos
 sobresalientes que se empatan, pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se
combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasa las une sellando los
espacios en el esqueleto del ADN.

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Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana, por ejemplo) en un
plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:

 El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.

 El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido
recombinante que contenga el gen.
 Diagrama que representa la digestión con enzimas de restricción y la ligación en un esquema
simplificado.

Empezamos con un plásmido bacteriano circular y un gen blanco. En ambos extremos del gen
blanco hay sitios de restricción, secuencias de ADN reconocidas por una enzima de restricción
particular. En el plásmido, también hay un sitio de restricción reconocido por esa misma enzima,
justo después de un promotor que dirigirá su expresión en bacterias.

El plásmido y el gen blanco (por separado) se digieren con la enzima de restricción. Los fragmentos
se purifican y se combinan. Ambos tienen "extremos cohesivos", o salientes de ADN de cadena
sencilla, por lo que pueden pegarse.

La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos complementarios para formar una única
molécula completa de ADN. Esto produce un plásmido recombinante que contiene el gen blanco.

2. Transformación y selección bacteriana

Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos y otros tipos de ADN
en bacterias, como la inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios. Durante la transformación,
células bacterianas preparadas especialmente se someten a un choque (como alta temperatura) que
las anima a incorporar ADN extraño.

El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de plásmidos deseados, plásmidos de
productos secundarios y fragmentos de ADN lineal) se agrega a las bacterias. Las bacterias se
someten a un golpe de calor, que mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la
transformación. Sin embargo, solo una pequeña minoría de las bacterias incorporará con éxito un
plásmido.

[Ocultar explicación.]
¡Magnífica pregunta! Curiosamente, nadie parece estar completamente seguro de la respuesta,
aunque la transformación por choque térmico es una técnica muy común en la biología molecular.
En general, se piensa que el choque de calor cambia la fluidez de la membrana o causa la formación
de poros (agujeros), lo que facilita que el ADN cruce y entre a la célula^11start superscript, 1, end
superscript.

Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos que permite a las
bacterias sobrevivir en presencia de un antibiótico específico. Así, las bacterias que incorporan el
plásmido pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que contenga el antibiótico. Las
bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que contienen plásmido pueden vivir y
reproducirse. Cada bacteria sobreviviente dará lugar a un pequeño grupo con forma de punto,
o colonia, de bacterias idénticas que contienen el mismo plásmido.
 Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos.

Panel de la derecha: todas las bacterias de la transformación se colocan en una placa con
antibióticos. Las bacterias sin plásmido mueren a causa del antibiótico. Cada bacteria que tenga
plásmido forma una colonia, un grupo de bacterias clonales que contienen el mismo plásmido. Una
colonia típica se ve como un punto pequeño y blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.

No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido adecuado. Eso es porque, durante una
ligación, los fragmentos de ADN no siempre se "pegan" exactamente como queremos. Por el
contrario, debemos recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una contiene el plásmido
correcto. Se usan métodos como la digestión con enzimas de restricción y la PCR para revisar los
plásmidos.

3. Producción de proteínas

Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido adecuado, podemos hacer
crecer un gran cultivo de bacterias que contengan el plásmido. Luego le damos a las bacterias una
señal química que les ordena producir la proteína blanco.

Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes cantidades de proteína. Por
ejemplo, si nuestro plásmido contuviera el gen de la insulina humana, las bacterias comenzarían a
transcribir el gen y traducir el ARNm para producir muchas moléculas de la proteína de la insulina
humana.
[Ocultar explicación.]
Los seres humanos y las bacterias comparten el mismo código genético, lo que significa que un gen
humano puede ser transcrito y traducido en bacterias.

Sin embargo, para que un gen humano se exprese en bacterias, debe tener una modificación
importante. En concreto, debe carecer de intrones. Los intrones son secuencias interpuestas que se
encuentran en muchos genes humanos y se eliminan de los transcritos de ARN eucariontes
mediante empalme para formar un ARNm maduro. Las bacterias no tienen intrones y no pueden
empalmar transcritos de ARN.

¿Cómo podemos obtener una versión de un gen humano sin intrones? Puede hacerse una versión sin
intrones de un gen humano a partir del ARNm que codifica el gen, mediante el uso de la enzima
transcriptasa reversa. La transcriptasa reversa sintetiza una cadena de ADN usando una cadena de
ARNm como molde. Después de un paso adicional se produce una versión del gen de ADN de
doble cadena sin intrones (llamado ADNc).

La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un matraz de 1 litro, por ejemplo). Se induce la
expresión del gen contenido en el plásmido en las bacterias de ese cultivo, con lo que el gen blanco
se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en proteína. La proteína codificada por el gen se
acumula dentro de las bacterias.

Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden romperse para liberarla.
Hay muchas otras proteínas y macromoléculas flotando en las bacterias además de la proteína
blanco (la insulina en nuestro ejemplo). Debido a esto, la proteína blanco debe ser purificada o
separada del resto del contenido de las células con técnicas bioquímicas. La proteína purificada
puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina, administrarse a pacientes.
[Ocultar explicación.]
Pues... sí y no. La insulina recombinante que hacen las compañías farmacéuticas de verdad se
genera en bacterias y se expresa de un plásmido que contiene un gen modificado de la insulina
 humana. La insulina que producen las bacterias se purifica mediante un tipo de columna de
purificación.

Sin embargo, producir insulina biológicamente activa requiere algunos pasos adicionales. La
insulina se produce como una cadena polipeptídica única. Sin embargo, se deben formar puentes
disulfuro dentro de la cadena y parte de ella debe cortarse para formar dos cadenas separadas (que
se mantienen juntas únicamente por los puentes disulfuro). Solo entonces la insulina es
biológicamente activa, es decir, capaz de actuar como una hormona en el cuerpo de un paciente.

La producción de insulina que pueden usar los diabéticos requiere que estos pasos adicionales se
incorporen al procedimiento de purificación de proteína para que la proteína insulina alcance su
forma tridimensional correcta.

Usos de la clonación de ADN

Las moléculas de ADN construidas mediante técnicas de clonación se utilizan para muchos fines en
la biología molecular. Una breve lista de ejemplos incluye:

 Productos biofarmacéuticos. La clonación de ADN puede utilizarse para producir proteínas

humanas con aplicaciones biomédicas, como la insulina mencionada anteriormente. Otros ejemplos
de proteínas recombinantes incluyen la hormona del crecimiento humana, que se administra a
pacientes que son incapaces de sintetizarla, y el activador tisular del plasminógeno (tPA), que se
utiliza para tratar infartos y prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas
suelen producirse en bacterias.

 Terapia génica. En algunos trastornos genéticos, los pacientes carecen de la forma funcional de un
gen en particular. La terapia génica intenta proporcionar una copia normal del gen a las células del
cuerpo del paciente. Por ejemplo, la clonación de ADN se utilizó para construir plásmidos que
contuvieran una versión normal del gen que falla en la fibrosis quística. Cuando se suministraban
los plásmidos a los pulmones de pacientes con fibrosis quística, la función pulmonar se deterioraba
más lentamente.

 Análisis genético. En laboratorios de básica investigación, los biólogos suelen usar la clonación de
ADN para crear versiones recombinantes artificiales de genes que les ayudan a entender cómo
funcionan los genes normales de un organismo.
Estos son solo algunos ejemplos de cómo hoy en día se utiliza la clonación de ADN en la biología.
La clonación de ADN es una técnica muy común que se utiliza en una gran variedad de
aplicaciones de la biología molecular.