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PRACTICA N°8

Explicación del proceso de degradación de


carbohidratos por E.Coli y Pseusomona sp, utilizando
pruebas bioquimicas

1. Objetivos:

1.1 Identificar qué bacteria organismo de fermentar la glucosa y la


lactosa y/o sacarosa, con producción o no de gases y evidenciar la
posible producción de ácido sulfhídrico.
1.2 Elaborar una siembra de E.coli y Pseudomonas en agar TSI.

2. Introducción:

Las pruebas bioquímicas son una serie de análisis clínico que sirven a la
medicina como apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias.
Se prepararon medios de TSI se inoculó una muestra de pseudomonas y
E.coli. Los medios fueron colocados en la incubadora los tubos fueron
colocados en la incubadora por 24 horas, luego de este lapso, se
observaron cambios en los medios que ayudaron a identificar la bacteria
presente en la colonia de la que se obtuvo la muestra.

3. Materiales y métodos:

3.1 Agar TSI. (Figura n°1)


3.2 Medios de cultivo (Figura n° 3,4)
3.3 Tubos esterilizados con tapón.
3.4. Asa en punta

Figura n°5: Siembra de la bacteria en


medio TSI
Métodos:

 Se inoculan los tubos de TSI con punta.


 Se introduce la punta hasta casi el fondo del tubo y sale haciendo una
estría con movimiento de un lado a otro.
 Se pasa a incubación por 24 horas a 37°C. Interpretar en este tiempo,
ni antes, ni después.

4. Resultados:
E.Coli:
El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de ph, rojo
fenol, a 6 horas de la incubación la zona de la estría y el fondo del tubo
tendrán un color amarillo (fermentador de glucosa)
Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa
Después de 18 – 24 horas el medio permanece amarillo, reacción
ácido sobre ácido. Fermentador de lactosa.
La producción de gas romperá el agar o lo empujará hacia arriba.
Reacción de a/a más gas. (Figura n°2)
Pseudomonas:
Cuando el microorganismo inoculado (pseudomonas) no es capaz de
fermentar la glucosa, mucho menos podrá fermentar otros
carbohidratos. Por tanto, aquí no se forman ácidos, pero existe
formación de aminas en el bisel por la utilización de las peptonas.

En este caso el bisel vira a un rojo más fuerte y el fondo del tubo puede
quedar sin cambio o puede alcalinizarse también, quedando todo el
tubo rojo.

Interpretación: K/K significa bisel alcalino / fondo alcalino o neutro.


Este resultado indica que el microorganismo no pertenece a la
Familia Enterobacteriaceae (Figuran°2).
5. Fundamento Teórico:
Agar de hierro y triple azúcar (TSI)
El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de
carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias
posibilidades de fermentación de acuerdo a las características
metabólicas del microorganismo como son:
Utilización de glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo
la glucosa provocan en este medio una reacción alcalina en la
superficie (roja) sobre un fondo ácido (amarillo, k/a) debido a que
realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la superficie,
convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18
a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja
(0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se
encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y
produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el
medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se
realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en
lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH ácido (amarillo).
Utilización de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen
la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción
ácida en la superficie (amarilla) y ácida en el fondo (amarilla, a/a). En
este caso después de 18 a 24 hrs como la concentración de lactosa
es alta (1.0%), o sea 10 veces más que la de la glucosa presente, no
se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo
como en la superficie. En el |caso de usar sacarosa la reacción sería
la misma.
Sin utilización de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar
ninguno de los carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa),
lo que se usaría serían las peptonas, ya sea aeróbicamente o
anaeróbicamente. Sólo utilizándolas aeróbicamente daría una
superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea k/sc).
Si las usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre
fondo alcalino (rojo) o sea k/k.
En este medio también es posible detectar la producción de gas por la
formación de burbujas dentro del medio, y la producción de ácido
sulfhídrico, el cual reaccionará con un indicador con base de fierro
dando un color negro debido al sulfuro de hierro formado.
E. coli: forma catalasa y sintetiza vitaminas del complejo B. La
fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones
aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior) (2)
El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y
concentración 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los
fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar.
Una vez producido toda la glucosa en piruvato, este se metaboliza por
el ciclo e Krebs formando productos finales ácidos.
El ácido en el medio hace vira el amarillo del indicador de ph, rojo fenol,
a 6 horas de la incubación la zona de la estría y el fondo del tubo
tendrán un color amarillo (fermentador de glucosa) (2).
Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa.
Después de 18 – 24 horas el medio permanece amarillo, reacción
ácido sobre ácido.
La producción de gas romperá el agar o lo empujará hacia arriba.
Reacción de a/a más gas.
Producción de gas, el gas se produce a partir del ácido fórmico,
obtenido de la fermentación de la glucosa (2).

Formicoliasa
H COO H CO2 + H2
Ácido fórmico
Pseudomonas: En esta familia esta incluidos los bacilos rectos o
ligeramente curvados. Gram negativos, de flagelación polar, incapaces de
formar esporas y que crecen aeróbicamente. La ganancia energética tiene
lugar por respiración aeróbica, en algunas especies por respiración
anaeróbica (desnitrifacación, respiración de nitratos), pero no por
fermentación.
El género Psudomonas encama al prototipo de la familia y se caracteriza
por los siguientes distintivos de la familia. Desde el punto de vista
fisiológico y metabólico los Pseudomonas se caracterizan por el amplio
espectro de nutrientes orgánicos utilizables. También utilizan un gran
número de compuestos heterocíclicos y aromáticos, que no son atacados
por otras bacterias. Los azúcares se degradan generalmente por la vía de
ENTNER-Doudoroff. Algunas especies de Pseudomonas oxidan los
azucares de forma incompleta y excretan los ácidos correspondientes
(gluconato, 2-oxogluconato)(3).
6. Conclusiones:

6.1. Se concluye que, la enterobacteria E.coli fermenta los hidratos


de carbono en el medio TSI y también produce gas; en cambio la
pseudomonas no fermenta lo hidratos de carbono del medio pero lo
hace virar al color rojo al alcanizar el medio y utiliza la ruta
metabólica ENTNER-Doudoroff.
6.2. Se hicieron las siembras en medio TSI dando como resultado
positivo en la E.Coli A/A; y dando negativo con Pseudomona K/K.

7. Referencias Bibliograficas:
(1) Chavaría Rivas E. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de
Enterobacterias. Academiaedu (en línea) 2012;(acceso 8 de junio
2019); (1) 1-2. Disponible
en:https://www.academia.edu/13501646/PRUEBAS_BIOQUÍMICA
S_PARA_LA_IDENTIFICACIÓN_DE_ENTEROBACTERIAS?fbcli
d
(2) Castillo Martínez L. Identificación de bacilos gram negativo no
fermentador para aplicación en celdas de combustible microbianas
y en bioremediación [Tesis Doctoral]. Centro de investigación en
materiales avanzados, S.C. posgrado, San Juan del rio Querétaro;
2012.
(3) Schdegel H, 1997, Microbiología General, Barcelona.
8. Anexos:

Figura n°1: Medios TSI Figura n°2: E.coli A/A y Pseudomona K/K

Figura n°3: E.coli en Agar Figura n°4: Pseudomona en Citrato.


Mackonkey