WESTERN BLOT (VC Y CC SIN SOBRECARGA DE FE 90 d)

Preparación de la muestra

Partimos 2g de Lóbulo izquierdo de Hígado en 12 ml de Tampón Sacarosa:Albumina, para

obtener el homogenado. (necesitaría 50 mg de tj;(prot. Hígado )=30Ug/Ul
Tomamos 1 ml de Homogenado centrifugamos a 10000 rpm durante 5 min. (pelet lleva
aproximadamente 300 mg de tejido).

Extracción de proteínas

1. Tomamos 40Ug pelet en 200Ul de buffer de extracción de proteínas

con kit MitoScience( Buffer A, 15ml, ref. 8201093/F1058 ),(de 5 a
10 veces el volumen.) Mantener las muestras en hielo a 4ºC.
2. Agitar en voltex 5 min. Cada 20 min. Repetir el proceso 4 veces.
3. Centrifugar 14.000 rpm 20 min.
4. Repartir el sobrenadante en 2 eppendorf de 100ul c.u. Desechar el pelet.
Mantener las muestras a -80 ºC. hasta su determinación.

Determinación de proteínas (kit Thermo scientific. Pierce BCA Protein Assay Kit, Rf.
23225/23227)

1. Diluir las muestsras (1/10) con H2O

2. Preparar Standar BSA (sigma-A4503). Se puede conservar 1-2 días a 4ºC.
SM( 2mg BSA/ml H2O) preparar 10 ml.
Prepara los distintos viales según protocolo; A, B, C, D, E, F, G, H, I.

VIAL V diluyente(H2O) V BSA Concentración final

A 0 300 Ul stock 2.000 Ug/ml
B 125 Ul 375 Ul stock 1.500 Ug/ml
C 325 Ul 325 Ul stock 1.000 Ug/ml
D 175 Ul 175 Ul vial B 750 Ug/ml
E 325 Ul 325 Ul vial C 500 Ug/ml
F 325 Ul 325 Ul vial E 250 Ug/ml
G 325 Ul 325 Ul vial F 125 Ug/ml
H 400 Ul 100 Ul vial G 25 Ug/ml
I 400 Ul 0 0 Ug/ml= Blanco

3. Preparar diseño de placa (tripe replica de cada estándar y doble replica de muestra.
Tomar 3 blancos reactivos). usar gradilla amarilla.
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R R R I I I H H H G G G

B F F F E E E D D D C C C

C B B B A A A R R R
SPL SPL SPL
1 1 2
D SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL
2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8
E SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL S`L1
8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 4
F S`L1 SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL
4 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20
G SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL SPL
20 21 21 22 22 23 23 24 24
H

4. Preparar la mezcla reactiva WR (50 A: 1 B)= 50ml A + 1ml B. Conservar varios

días a Tª ambiente.
5. Preparar la placa en oscuridad (cubrir con papel albal) y añadir:
6. 25Ul de ST o muestra D(1/20)en cada pocillo
7. 200ul WR. Agitar 30 s. en el agitador placas.
8. Incubar a 37º C 30 min. En oscuridad.
9. Enfriar a Tª ambiente
10. Leer Ab. A 562nm. En microplacas preparando previamente el protocolo por
curva de 4 paramétros.
Protocolo Multiplacas
Gen5
Exp. Default
Proc. Read 562, full plate
Play layoult. Def. pocillos tipo filing horiz. Y nº replica
Ej. Según diseño de placa.
Blanco -3 replicas, estándar-3 replicas, simple 2 replicas.
Terminar y OK.
Date Resoluc.- uso datos . transformación blanco y curva de análisis (4 parametros=
curva Fit.
OX: que indica
OY: cambio a λ=562 nm sin blanco.
Confirmar que indica concentración y curva.
Curva: EEM y CV <10. R=0,999 r2= 0.998 Bien.
R=1 r2= 0.999 Excelent.
Ver datos; a 562 nm de Ab. Se trabaja con “BlanK 562”.
Estadistica : curva + tabla.
La concentración de la muestra x 10. Mean= media
Gráfica: curva/resultados
Nota multiplacas= las medidas de Ab. Se hacen a partir del blanco. Por lo que la
concentración de la muestra son las ya calculadas en referencia a las Ab. Del
blanco.
CALCULOS: mg prot./Ul muestra= [prot. ]mg/ml x dilución

1000Ul/ml
 Western Blot

1.- Lo primero es preparar la plantilla del gel, según la cantidad de muestra que hay que
cargar en función de la cantidad de proteina que queremos corre por pocillo (30Ug prot/Ul
muestra).
Mientras preparamos las muestras encendemos el termoblock (baño a 95ºC) para que vaya
adquiriendo temperatura.
Preparar eppendorff(1,5 ml), los rotulamos debidamente según plantilla y comenzamos la
preparación de las muestras. A cada eppendorff se le añade:
- 1º el agua bidestilada,
-2º la muestra (o el marcador de peso molecular=Page Ruler- PR),
-3º Loading 1X buffer (8Ul-muestra, 5Ul-PR) y
-4º Reducing 1X buffer (1,5Ul-muestra, 1Ul-PR). Conseguimos un volumen total de 40Ul-
muestras y 20Ul-PR.
Homogenizar bien; sacudir y agitar con voltex suave.
MODIFICACION DE BIO RAD
No usa Loading /Reducing.
Utiliza 475Ul Sample Buffer 2x (BIO RAD)y 25Ul ß-Mercaptoetanol (ALDRICH- M6250-
100ML)(que rompe la estructura 4ª proteinas (s=s) y deja las cadenas libres).

2.- Calentar durante 5 min. En el termoblock a 95ºC (con la finalidad de asegurarse que el
SDS en el buffer ha disuelto completamente las proteínas y evita la formación de complejos
proteicos de mayor peso).
Mientras preparar “Running Buffer SDS-PAGE 1X.

3.-Centrifugar los eppendorffs durante 60 s a 3000rpm para eliminar las burbujas y

asegurase que toda la muestra está en el fondo.

PREPARACIÓN DEL GEL

Compramos los geles ya preparados (Criterion Precast Gel- 4-20% Tris-HCl 1.0mm)
BIO RAD. Gel TGX (12+2 poc.) ANY KD, Gel Mini-Protean-TGX satín-Free (10 poc.)
Desprender la cinta adhesiva, eliminar el liquido, enjuagar con agua bidestilada el gel con
el frasco lavador, quitar el peine con suavidad hacia arriba y el protector del final del
cassette. Enjuagar los pocillos con agua bidestilada del frasco lavador evitando que el agua
caiga directamente sobre los mismos. (Ese lavado tiene como objetivo homogenizar el
medio en el que se encuentran y que todo tenga la misma reactividad, pues el buffer tendrá
también agua bidestilada.)

1.-colocar los geles en el tanque con la cámara por donde se cargan las muestras hacia
dentro y mirando los nº hacia nosotros.
2.-Añadir 60mnl de Running Buffer (aproximadamente, cubrir hasta arriba no completar)
en la cámara del gel. Eliminar posibles burbujas golpeando suavemente el gel.
3.-Cargar 15Ul de las muestras a los pocillos ( 1º PR, y colocar alternado las muestras 1 por
grupo, con cuidado para evitar desplazamientos a otros pocillos( usar pipetas manuales para
controlar el vaciado y puntas blancas de las cortas, son mas finas y sin corona).
Sujetar la punta y bajar suavemente hasta el fondo del pocillo, depositar la muestra y subir
lentamente en vertical.
BIO RAD. Preparo la plantilla de los geles de otra forma. Ver libreta, usando Marcador
Blue ( Preacision Plus Protein Dual Stra Standards )y marcador UNSTAINER (Preacision
Plus Protein Standards). 1º GEL TGX(12+2) ANY KD Y MB PDVF.

4.-Completar el tanque de electroforesis con Running Buffer= 60ml. (hasta la línea de

llenado hasta revosar el canal del gel)con cuidado de no formar espuma.
BIORAD.25Ul muestra y usa Buffer TRIS/GY/SDS comercial 1X, preparado a partir de
10X.
Nivelar la cubeta y colocar la tapadera verde con electrodos correpondientes N-N y R-R,
enchufar a la fuente de alimentación a temperatura ambiente y comprobar que se producen
burbujas.
Nota= si no hay corriente es por que hay poco o mucho buffer y comprobar que esta
encendido (je, je) Cada tejido corre a diferentes I y depende también del tipo de geles unos
son más lentos y se deben dejar más tiempo.

5.-A temperatura ambiente, correr el gel a 200V entre 20-35 min. (hasta que observemos
que la banda verde del marcador se separa claramente). Anotar la corriente inicial y final.
(0,07 A 1 gel, 0,14 2 geles; 20W).
(Nuestra lectura I inicial= 0,09A y I final=0,03ª).
Fin de la electroforesis a 50min. Con Mario Y 15min aprox. Con BIO RAD.
Cuando se visualiza bien la banda verde y a 0,5 cm del fondo rosa.
BIORAD. 203- a 300V cuando ya han empezado a correr las muestras

6.- Se saca el gel de la cubeta, escurrir y dejar hacia arriba el soporte.

Abrir los cassettes con mucho cuidado para no romper el gel. Una forma para abrirlos es
utilizar un pequeño destornillador, abrir a ambos lados y levantar primero la placa que
señala los pocillos, antes de separar totalmente los cassettes asegurarse de en qué lado del
cassette está el gel, si está pegado a ambos cassettes separarlo de uno de ellos con una
espátula de plástico bien humedecida por la esquina del PR, antes de retirar el gel recortarlo
con una cuchilla por la zona superior (los pocillos de carga del gel= los flecos con el bisturí
y golpeando no rozando la cuchilla) y por la zona inferior encima de la linea rosa (el
frente), y cortar una esquina(superior derecha) en el gel (para saber dónde comienza el
pocillo 1).
\

Humedecer bien el gel y guantes (gotear con las manos)

7.-Separar con pinzas el gel con mucho cuidado y dejarlo en agua bidestilada en la cubeta
de plástico para eliminar los restos de buffer running.
Nota= Eliminar geles y membranas en residuos especiales
BIO RAD. Con Visualize Serparation TGX Satín-Free precas geñs and the ChemiDoc
MP imagen- immediate visualization of protein separation in 1 minute using 1 easy step.
¿ usa fluorescente? Lavar las membranes con agua bidestilada y visualizamos la
electroforesis del gel en fluorescencia, permitiendo validar las muestras.

TRANSFERENCIA (wet system)

BIO RAD. con Transfer Proteins The Trans-Blot Turbo system enables rapid and efficient
transfer of proteins across a wide range of molecular wights.

1.-Rotular las membranas de PVDF( se activan con Metanol) en una de las esquinas con un
portaminas o lápiz bien afilado. (solo anotar N con portaminas, pero sin tocar la
membrana. Cortar el lateral mayor y dejar una anchura de 7,5 cm.
--------------------

7,5cm[

Las proteinas quedan en la cara con la “N” al revés.

2.- Preparar el Buffer de transferencia. Preparar las membranas colocando superpuestas y

en orden; verde, filtro, mb, filtro y verde

3.- Activar las membranas en metanol absoluto HPLC durante 10 s. Sacudir y escurrir con
las pinzas curvas finas y llevar a cubetas con buffer transferencia. Observar las burbujillas
que hay en la mb, quitar moviendo la mb por ambas caras.

4.-Preparar recipientes (se pueden usar los recipientes de plástico donde vienen los geles)
con buffer de transferencia para equilibrar los geles y las membranas durante 25min.

5.- Preparar los papeles Whatman. Recortarlos al tamaño del gel y de la membrana (para
disminuir la resistencia al paso de la corriente y por tanto evitar el sobrecalentamiento).

--------------------
6.- Montar el sándwich (con mucha humedad, añadir buffer transferncia en caja del
sándwich) para la transferencia proteica de la siguiente manera, de abaja hacia arriba (la
transferencia va del ánodo=polo(-)=N al cátodo=polo (+)=P)
Polo negativo (negra)
- parte negra del sándwich
- Esponja negra humedecida en buffer transferencia
- Papel whatman humedecido en buffer transferencia
- Gel(pasar el rodillo para quitar las burbujas)Dejar caer al gel sobre
el papel whatman suavemente, desde nuestro cuerpo hasta el
extremo opuesto.
- Membana(depositar la membrana, con mucho cuidado sobre el gel
evitando tener que recolocar después, hacer coincidir la esquina
rotulada sobre la esquina recortada del gel y anotar que cara de la
membrana está en contacto con el gel, ajustar bien las superficies
limitantes)
- Papel whatman humedecido en buffer transferencia
(Pasar el rodillo en la parte posterior del gel sobre el papel, para no
dejar burbujas, terminar presionando suavemente con la mano.)
- Esponja negra humedecida
- Cerrar el sándwich dejando caer la parte roja, ajustando el carril
blanco corredera.
Polo positivo (rojo)
Nota= todo tiene que estas húmedo con buffer transferencia.
BIO RAD. Sobre la bandeja del “Trands.Blot” coloca; Mb PVDF, gel y filtro, pasando el
rodillo suavemente y en humedad.

7.-Colocar el sándwich dentro del tanque, con el cierre blanco hacia la apertura, en el otro
canal del tanque meter un bloque de hielo.

8.- Añadir el buffer de transferencia (hacia la línea de llenado) y llevar el tanque a la

cámara fría (4ºC ).

9.- Equilibramos y conectamos la fuente de alimentación con el siguiente programa; 0,45A

durante 90min. Anotar el voltaje inicial y final. (= 64 V).
Preparar TBS, TBS-T y Buffer de Bloqueo.

BLOQUEO DE LA MEMBRANA

1.-Sacar el sándwich del tanque de transferencia, escurrir el líquido. Eliminar el buffer de

transferencia de la cubeta, lavar con H2O bidestilada la placa y las esponjas.
Deshacer el sándwich. (la membrana y el gel están como un espejo; las proteínas están cara
debajo de N).
Conservar el gel en cubeta comercial en H2O bidestilada para su posterior desecación.
El gel se puede decolorar y teñir posteriormente con Azul de Carmesí.
Colocar las membranas en las cubetas con la cara hacia arriba y la “N” al revés.
2.- Poner las membranas en TBS durante 5 min. y con agitación suave a Tª ambiente, para
eliminar el buffer de transferencia. Lavar con suave mov. horizontal, volcar y escurrir en
fregadero con cuidado, dejando la mb adherida a las paredes del la cubeta.
Hacer un 2º lavado con TBS 5min. con agitación y a Tª ambiente.

3.- Sumergir la membrana en buffer de bloqueo a temperatura ambiente durante una hora
y con agitación mecánica. (en una caja de vidrio con tapadera). Esto es necesario para
eliminar las partes de la membrana que no presentan proteínas y que pueden dar uniones
falsas con el anticuerpo).Nosotros lo dejamos overnight a 4º C no necesita oscuridad.

UNION AL PRIMER ANTICUERPO

1.- Tras el bloqueo lavar la membrana 2 veces en TBS ( 1 dedo de volumen)durante 5 min.
en agitación mecánica, para eliminar restos del buffer de bloqueo. Escurrir bien el buffer
bloqueo de la cubeta y lavar la tapadera con H2O bidestilada, eliminando la condensación.

2.-Preparar el Anticuerpo primario diluyéndolo en TBS-T (0,01% de Tween-20) a la

dilución estimada o recomendada para el anticuerpo en cuestión (en caso de duda diluir
más). El volumen total para una membrana completa es de 20ml. En el caso de incubar
media membrana solo son necesarios 10ml de preparación.
(DMT-1 d(1:200)=100Ul+20mlTBST, ß-Actina d(1/500= 40Ul+20mlTBST)

---------¦
N ¦
¦
¦
¦
¦
3.- Preparar una bolsita de plástico autosellable y ajustada casi al tamaño de la membrana
(recortar dos lados, por los que introduciremos la mb cuidadosamente con pinzas, escurrir
bien los restos de TBS y con “N” al revés).
Termoselar la parte larga 5 segundos (calentar el termosellador previamente) , añadir
volcando el Anticuerpo primario diluido y termosellar el lado restante habiendo eliminando
previamente todas las burbujas del interior.( con la bolsa sobre la palma de la mano
empujar las burbujas hacia la parte abierta de la bolsa). A la hora de verter el anticuerpo
dentro de la bolsa debemos asegurarnos que lo hacemos por la cara de la membrana que
estuvo en contacto directo con las proteínas del gel, para ello nos fijaremos en la marca que
le hicimos a las membranas “N” al revés. Hacer esto sobre un recipiente donde poder
recoger la solución si se derrama.
Comprobar el correcto sellado( ajustado al limite de la mb). Y dejar en horizontal en la
palma de la mano.

4.- Mantener en agitación (a la máxima velocidad, 50rpm) a 4ºC en la cámara fría, el

tiempo seleccionado para cada anticuerpo (generalmente 1 día= overnight).Sujetar la bosa
por el extremo con una caja para evitar se escurra en la placa agitadora.
c

5.-Abrir la bolsa por una esquina dcha con una tijera(a) y verter la solución con el AC 1 ario
sobre un tubo de plástico con tapón de rosca de 25ml rotulado y preservar a 4ºC.(sellar el
tapón con papel de parafina). Hacer esto sobre un recipiente donde poder recoger la
solución si se derrama.
Cortar entre sello y la mb. ;arriba, lateral dcho y limite inferior(b), para abrir como un
libro(c).
---------¦
¦
b ¦
¦
¦

¦ \
¦a
¦---------------------

Coger la membrana con las pinzas curva por la esquina de la marca del “N” al revés, no
forzar al tirar de la bolsa de plástico.

UNIÓN AL SEGUNDO ANTICUERPO

1.- Lavar la membrana 3 veces durante 5 min. en TBS-T, en agitación media 10rpm.

2.- Preparar el Anticuerpo 2 ario conservado a 4ºC de Mario(Bio Rad Immu-Star Goat Anti-
Mouse-HRP conjúgate, Rf. 170-5047) sobre TBS-T (volumen final con probeta de 80ml ó
100ml).
(Anticuerpo 2 ario para DMT-1 Conejo; d(1/80.000)=1Ul+80ml TBS-T) con pipeta
Hamilton. Se prepara en vaso precipitado de 100ml y medimos 80ml con probeta)
Preparar TBS y TBS-T.

3.-Poner la membrana cara N al revés en un recipiente de vidrio con tapadera, verter la

preparación del Anticuerpo 2 ario por la pared del recipiente cara a la mb. (escurrir bien el
resto de la solución) y dejarlo 60min.( se puede 1h 30min.) en agitación a temperatura
ambiente.

4.-Retirar la solución

5.- Lavar l as membranas con TBS-T x2 durante 15 min. en agitación media a Tª ambiente.
6.- Lavar las membranas con TBS durante 15min. en agitación media a Tª ambiente, ya que
el tween puede producir interferencia con la quimioluminiscencia.
Desechar y añadir nuevo TBS y dejar la membrana en la cubeta hasta la lectura a 4ºC.

DETECCIÓN POR QUIMIOLUMINISCENCIA

(Modulo Nuevo, 1º reservar el día antes 1h.)

COMO REVELAR LAS MEMBRANAS DEL WESTER

Una vez que ve han hecho todos los lavados a la membrana, ésta debe estar conservada en
TBS.
-Preparamos los reactivos de quimioluminiscencia: pipeteamos 5ml de cada reactivo
(4,5+4,5ml) en un bote opaco( marrón).
-llevar bandeja transparente de plástico de electroforesis, folio blanco, papel de
filtro, un
(STRIPPING) LIMPIEZA DEL ANTICUERPO

1.- Escurrir bien la mb con TBS. Mantener la membranas en buffer de stripping( solución
única- termo Restore Western Blot Stripping Buffer, 5l Ref. 21063, aunque se puede
preparar) 10-15 min. min. aplicándoles calor (aproximadamente 30-40ºC) en el
calientaplacas y el recipiente abierto. Añadir solo el volumen que cubra la mb. Durante este
tiempo, iremos elaborando buffer de bloqueo, que utilizaremos posteriormente.
Escurrrir bien la mb con Buffer Stripping.
Preparar Buffer de Bloqueo.

2.- Lavar con TBS x2 veces al menos durante 5 min. en agitación media y a Tª ambiente,
para eliminar el buffer de Stripping.

3.- Ponemos buffer de Bloqueo y lo mantenemos durante 1h a Tª ambiente en agitación

(nosotros overnight).Una vez cumplido este tiempo, la membrana quedará completamente
limpia de anticuerpos. Únicamente preservará la proteína transferida inicialmente y lista
para un nuevo tratamiento con anticuerpo.

4.- Tras el bloqueo lavar la membrana 2 veces en TBS durante 5 min. en agitación
mecánica, y Tª ambiente para eliminar restos del buffer de bloqueo. Escurrir bien el buffer
bloqueo de la cubeta y lavar la tapadera con H 2O bidestilada, eliminando la condensación.
Añadir TBS y conservar la membrana a 4ºC.

La membrana quedará completamente limpia de anticuerpos. Únicamente preservará la

proteína transferida inicialmente y lista para un nuevo tratamiento con anticuerpo.

VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Tinción del gel con coomasie brillant blue

Colocar el gel en agua 2x 5 min. para eliminar el resto de SDS. Añadir la solución de
Coomassie Blue y mantener durante 2 horas en agitación. Lavar con agua bidestilada hasta
que el agua salga limpia y luego dejar el gel en agua toda la noche (para terminar el
lavado). Colocar el gel entre 2 trozos de parafina y escanearlo.

0,2% azul Coomassie R 0,2 g

40% metanol 40ml
7,5% ácido acético 7,5ml
Agua bidestilada 100ml

Esta solución es mantenida hasta que no tenga volumen suficiente para teñir el gel.
(Coomassie Brilliante R-250 BioRad, 10 g, SRf. 161-0400)

Tinción de la membrana con Oro Coloidal

1.- Preparar TBS-T.

2.- Lavar la membrana 3 veces con 100ml de TBS-T durante 20 min.
3.- Lavar 3 veces la membrana con agua bidestilada durante 2 min.
4.- Añadir 50ml de Oro Coloidal a la membrana e incubar hasta que aparezcan las bandas
de proteínas (las bandas más concentradas pueden aparecer a los pocos minutos).
5.- Eliminar el oro coloidal y lavar la membrana 3 veces con agua bidestilada.
6.- La solución de oro coloidal puede ser reutilizada. Conservar a 4ºC.

Colloidal Gold Total Satín, BioRad, RF. 170-6527.

Secado de Geles

Colocar el gel con un papel de filtro por abajo y plástico film por arriba en el secador de
geles (Saavant) y secarlos a 50ºC durante 3h. Para hacer bien el vaco pasar vaselina por los
bordes del secador.

REACTIVOS

Se necesitan puntas blancas y pipetas de 0,5-2Ul, 2-20Ul,20-200Ul

(pipetas 1Ul)
GELES ( BIO-RAD Criterion Precast Gel (4-20% Tris-HCl 1.0mm m. Rf. 345-0034)
Hemos hecho otras pruebas con geles TGX
MEMBRANAS (BIO-RAD Criterion Gel Blotting PVDF with Filter Papers.
Nitrocelulosa; 8.5x13.5cm (20 packs) Rf. 162-0238. Es más sensible y se seca menos pero
la imagen es mejor.

Loading Buffer (XT Simple Buffer 4X BIO-RAD, 10ml Rf. 161-0791)

Diluir a 1X (95Ul puro/285Ul H2O)
Es de color azul intenso. Se conserva a Tª ambiente.
Homegenizar por inversión ya que es muy espumoso.

PR-marcador Peso molecular PAGERULER Prestained protein ladde. Fermentas SM 1811

Conservar a -20ºC
Reducing Agent (BIO-RAD, 1ml Rf. 161-0792)
Diluir a 1X (3Ul puro/57Ul H2O bidestilada) Conservar a 4ºC

Running Buffer (buffer BIO_RAD) 10X

Diluir a 1X (50ml Buffer 10X/500ml H2O) para 1 gel. Conservar en recipiente de vidrio
Para 1 Litro (para 2 geles)
30,2g Tris-Base
114g Glicina
10g SDS
Enrasar hasta 1 L H2O bidestilada
Nosotros usamos buffer comercial.

Buffer de Transferencia (extemporáneo)

Para 2 Litros (para 1 ó 2 geles)

1400ml H2O bidestilada s 4ºC
400ml Metanol HPLC (Panreac 221091-1612 M=32,04)
200ml Tris-Glicina (Buffer ¿Bio Rad?10X, Rf. 161-0771)
TBS (Buffer Tris Salino). Preparamos 2 l (1L para TBS y 1L para TBS-T)

Para 1 Litro
2,42g Tris-base
8g NaCl
Ajustar el pH a 7,6 con ácido clorhídrico y conservar a 4ºC

TBS-Tween 20 (TBS-T)

Adicionar el volumen necesario de Tween 20 (BIO RAD, 100ml, Rf.170-6531) para

obtener una solución 0,1% (v/v) a partir de TBS (1ml en 1 l de TBS)
Conservar a 4ºC.

Buffer de Bloqueo

5%(p/v) Leche descremada(BIORAD Biothing-Grande Blocker, non-fat Dry Milk 300g/

170-6407)
Preparar 100ml para 1 gel
5g leche /100ml TBS-T

Reactivos de quimioluminiscencia

BIORAD Immuno-Star HRP (Rf.170-5041)

luminol/enhancer - A=cataliza por unión al sustrato; 50ml. Tomar 4,5ml
+
Peroxido buffer- B=conjuga Ac+Ag ; 50ml. Tomar 4,5ml
COMO REVELAR LAS MEMBRAS DEL WESTERN

Una vez que se han hecho todos los lavados a la membrana, ésta debe estar conservada a
4ºC en TBS.

Preparamos para llevar una caja con:

Folio blanco para colocar en la bandeja del Funjifilm, permite el contraste de lectura
Bandeja transparente de plástico y tapadera con papel albal para proteger la membrana de la
luz al añadir el reactivo quimioluminiscente.
Papel de filtro y un trozo de parafina (4x2 cuadrantes) para colocar la mb para colorear
sobre superficie humedecida con TBS.
Pinzas de punta curva para manipular las membranas
Rodillo, pipetas pasteur, puntas blancas y pipeta automática de 5ml.

Vamos al modulo nuevo con un día previo de reserva del aparato. Comprobar que estamos
autorizados para entrar en citometría.

-Una vez allí encendemos el ordenador (contraseña: tdi ) y el Fujifilm unos 10 min. para
que se enfríe a -30ºC.
Abrimos el programa Image Reader LAS-400

Especificamos las siguiente opciones:

-Exposure type.increment (para ajustar background)
-Interval time: manual, 2min. (relative)
-Sensitivity:b vhigh (para hacer la foto a la mb)
-precisition: automático (para optimizar la imagen del Ac)
Abrimos el aparato Method/Tray position
-Method: quimioluminiscencia
-Digitize: EPI
-Tray position: (posición de la bandeja) 2
-OK

Colocamos el trozo de parafina en la mesa y sobre él la membrana (dar a las mb 2 vueltas 1

sobre la parte sin proteínas y otra sobre la de proteínas.
Con la pipeta echamos unas gotas de TBS para que se pegue a la mesa y luego secar con
papel secante, presionando sobre el parafilm.

-Mezclamos los reactivos de quimioluminiscencia. Pipeteando 4,5ml A+4,5ml B por

membrana (ó 2,5ml A+2,5ml B en mb pequeñas) en un tubo forrado de papel de aluminio.
Lo volcamos con cuidado sobre la mb. Por propia tensión superficial de la mb el líquido no
se derrama y forma una capa uniforme sobre la mb. (soplar con suavidad y nunca dejar que
se seque).
Esperamos 5 min. en oscuridad con tapadera de albal, pasado el tiempo tomamos la mb por
una esquina dejando escurrir el líquido, la secamos un poco apoyando una esquina sobre el
papel de filtro y la colocamos sobre la bandeja transparente.
Metemos la bandeja en la posición 2 en el Fujifilm ( con medio folio blanco debajo).
Centrar la mb. Colocada con la cara de las proteínas hacia arriba y N al reves.
Ajustamos el brillo =3
Ajuste de contraste= hasta que veamos la N perfect.
Precisión=manuela 1” (1º probar con automática)
Le damos a FOCUSIN para enfocar la mb bien en la pantalla del programa.
-RETURN
Cuando todo este OK le podemos dar a START (para busca el t de exposición, solo nos
dejará comenzar si el aparato a llegado a -30ºC.
Una vez tomadas todas la imágenes (cada 1” durante 15min.) que necesitemos le damos a
STOP y SAVE , seleccionamos desde la imagen 1 hasta la última (6) que queramos guardar
y seleccionamos la carpeta donde queremos guardar (Lab.23)
Una vez guardadas las imágenes podemos cerrar el programa.
Las imágenes hay que exportarlas al formato tif de 16 bits (grey)
-programa: MULTI GAUGE
File-export-Guardar como Original Imagen By Gray TIFF File(*.tif)
Para guardar la imagen de la mb pondremos; nombre Ac, nº veces,nº min. en nuestro
formato

Volver a dejar la mb en tuper con TBS hasta volver a usar.

Buscamos una imagen con un t superior al t de exposición. Ej. 8 “ (en automático)

Conclusiones

DMT-1 Ac1º dilución 1:200 (100UL Ac+20ml TBS-T),

Ac2º conejo d 1:150.000(1UL Ac+150ml TBS-T)

Hepcidina 1:200 Ac2º conejo d 1:150.000