DETERMINACION DE NITROGENO BASICO VOLATIL (NBV)

El contenido de bases volátiles expresado como NBV es usado como un índice de calidad en pescado. método simple y rápido para
determinar el grado de frescura del pescado.

 El NBV está formado por Trimetil amina (TMA), Dimetil amina (DMA), Amoníaco (NH3). En el caso de pescado refrigerado
hay un predominio de TMA,que va a estar asociada con la flora alterante.

OTMA ES UN OSMORREGULADOR NATURAL DEL PEZ .esta en el musculo .es un aceptor final de electrones (es un agente
reductor ) .en anaerobiosis

La determinación de NBV puede efectuarse por varios métodos alternativos:

 Microdifusión (Conway, 1962),

 Método de Lücke y Geidel, (1935)
 Nordsee Gmbh(1972)
 Antonacopoulos (1968)
 Giannini y col. (1979).

El fundamento de estos dos métodos consiste en llevar la muestra a un pH fuertemente alcalino (pH=10-11) por el agregado de
OMg. El OMg fija los ácidos volátiles y libera de sus sales a las bases nitrogenadas

Las bases nitrogenadas se destilan y se recogen sobre un ácido débil (BO3H3) formándose las sales correspondientes.

Se realiza luego una titulación por retorno regenerando el ácido débil con un ácido fuerte (H2SO4 0,1 N o HCL 0,1 N).
 CALCULO

NBV (mg/100g muestra)= [(Vm-Vb) x N x 14,01 x100]/ m

Vm: volumen gastado por la muestra

Vb: volumen gastado por el blanco

m: peso de muestra húmeda.

El Código Alimentario Argentino admite para pescado fresco un límite de 30 mg/100g. Para los elasmobranquios no hay límite

En el método de Antonacopoulos se fijan la velocidad de destilación y el tiempo para obtener un volumen de destilado (150 ml)
correspondiente a un pH de dilución teórico de la solución de bórico (al 0,75%) de 5,5 que es el punto de viraje del indicador
usado (Tashiro: solución alcohólica de rojo de metilo y azul de metileno). Esta solución se titula con un ácido fuerte (H2SO4 0,1 N
o HCL 0,1 N) que regenera el ácido bórico (ácido débil). En el punto final el indicador vira de color verde a gris azulado.

La determinación de NBV es un índice de calidad en pescado fresco, se debe tener en cuenta que:

- Las especies de agua dulce poseen baja concentración de OTMA y por lo tanto los valores de NBV son bajos.

- Los elasmobranquios tienen gran cantidad de urea que da altos valores de NH3 y por lo tanto el valor de NBV es mucho mayor
de 30 mg/100g

- Los moluscos bivalvos poseen mayor cantidad de aminoácidos libres y por lo tanto el NBV siempre presenta valores bajos.

- En productos pesqueros como anchoíta salada un valor elevado de NBV está relacionado con la maduración del producto y por
lo tanto no puede ser usado como índice de calidad.

- En conservas de pescado los valores de NBV son elevados debido a la degradación del OTMa por el calor y por lo tanto no puede
ser usado como índice de calidad.

Antonacopoulos

RESUMEN DEL METODO

a) Colocar agua en la "caldera" del equipo. b) Colocar la muestra, oxido de magnesio y antiespumante en la ampolla del aparato.
c) Calentar el balón hasta destilar por arrastre con vapor de agua las bases volátiles, que se recogen en una solución de acido
bórico. d) Titular con solución valorada de acido sulfúrico o clorhídrico 0,1000 N, usando Tashiro para determinar el punto final.

INSTRUMENTAL

a) Aparato de Antonacopoulos b) Manta calefactora c) Trozos de material poroso d) Erlenmeyer de 250 ml de cuello ancho e)
Cuchillo o espátula para extraer la muestra de los filets frescos f) Taladro con sacabocados para el caso de congelados g) Vaso de
precipitado pequeño h) Balanza que permita pesar 0,1 mg i) Varilla de vidrio j) Piseta k) Microbureta de 2 o 3 mI graduada al 0,01
mI.
REACTIVOS

a) Oxido de magnesio b) Antiespumante de siliconas. e) Solución de acido bórico de una concentración de 3 g en 100 mI de
solución d) Solución valorada de acido sulfúrico o clorhídrico 0,1000 N e) Indicador Tashiro: se prepara disolviendo 125 mg de
rojo de metilo en 50 mI de etanol 95 % Y 82,5 mg de azul de metileno p.a en 50 ml de alcohol del mismo tipo. Mezclar en partes
iguales antes de usar.

ENSAYO EN BLANCO

Se efectúa un ensayo en blanco, paralelamente a la determinación, siguiendo la misma técnica y empleando las mimas cantidades
de todos los reactivos. Es conveniente efectuar un ensayo en blanco inmediatamente antes de la valoración de la muestra, para
luego, al efectuar la valoración, llegar al mismo color en el punto final.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Si se trata de fillets, se raspa el músculo del tercio medio por la parte interior hasta llegar a la piel, con un cuchillo o espátula
adecuada y tratado de obtener trozos menores de 1 mm. Deben obtenerse aproximadamente 50 g de muestra, que se mezclan lo
mejor posible. Si se trata de pescados enteros, se corta un fillet de su tercio medio y se repite la operación anterior.

Si se trata de bloques congelados, se sacan por lo menos tres cilindros con el sacabocados, a no menos de 10 cm del borde y luego
se cortan con un cuchillo, en pedacitos no menores de 1 mm. No deben emplearse las virutas obtenidas con el sacabocados.
Deben obtenerse por lo menos 50 g de muestra, que se mezcla lo mejor posible.

PROCEDIMIENTO

a) El ensayo debe llevarse a cabo por duplicado

b) Se pesan exactamente al miligramo, alrededor de 10 g de muestra

c) Se vierte en la caldera del aparato aproximadamente un litro de agua destilada algo del material poroso.

d) Se colocan en el erIenmeyer 10 ml de la solución de acido bórico (3%) y 30 ml de agua destilada. En forma optativa, se pueden
agregar 40 ml de acido borico 0,75g/ 100 mI. Luego adicionar 5 o 6 gotas del indicador Tashiro.

e) Se coloca el erlenmeyer de manera que el vástago del refrigerante quede sumergido por lo menos 10 mm en el líquido.

f) Se introduce la muestra en la ampolla del aparato Antonacopulos con ayuda de una varilla arrastrándola hasta el fondo.

g) Se lavan la varilla y el vaso de precipitado pequeño que contenía la muestra con la piseta, incorporando el agua de los lavados a
la ampolla.

h) Se agregan a la misma ampolla 2 g de oxido de magnesio y una o dos gotas de antiespumante de siliconas.

i) Se lavan las paredes de la ampolla con la piseta y se conecta rápidamente el tubo de conexión.

DESTILACIÓN

a) Se calienta el balón con la llave del embudo del aparato abierta, para evitar la condensación de agua dentro de la ampolla.

b) Se lleva a ebullición, dejando la llave abierta hasta que sale un chorro continuo de vapor por la misma.

c) Se destila con el vástago del refrigerante sumergido hasta obtener unos 150 ml de destilado. Luego de lo cual se destilan unos
50 ml mas, pero con el vástago sin sumergir.

d) Se desconecta y retira el manto calefactor. Se abre la llave del embudo del balón.

e) Se desarma el aparato aun caliente con el fin de que no se pegue al esmerilado.

f) Se lavan interiormente el tubo de conexión, el refrigerante y el vástago exterior del mismo, incorporando el líquido de lavado al
erlenmeyer.

VALORACIÓN

a) Se valora con la solución de acido sulfúrico o clorhídrico 0,1000 N, agitando el erlenmeyer continuamente.
 b) Próximo al punto final. Se lavan las paredes del erlenmeyer y el pico de la bureta, con pequeños chorros de agua de la piseta,
agregando solución valorada de a media gota hasta alcanzar el punto final.

c) Se considera que se ha alcanzado el punto final cuando el color de la solución vira de verde a gris azulado. Si se llega a un color
rojo-violáceo, se ha pasado del punto final.

Análisis Bacteriológico
Preparación de la muestra para el análisis

1. Limpiar cuidadosamente la envoltura externa de la muestra con un hisopo de algodón empapado en alcohol

2. Corte la envoltura externa con un elemento esterilizado y coloque 25 g de muestra en un vaso homogeneizador, después de
haberla dividido en pequeños trozos.

3.Adicione 225 ml de agua peptonada(para favorecer el crecimiento de halófilos que tienen una concentración de sal
determinada por ser del agua ) y homogenice cuidadosamente. Esta será la solución original de la muestra.

Recuento estándar en placa

1. De la solución original de muestra prepare asépticamente una dilución 10-2, dependiendo del caso, de forma tal que las
placas contengan entre 30 y 300 colonias.

2. Inocular dos placas de petri con 1 ml de la dilución.

3. Adicionar 10 ml de agar para recuento y mezclar cuidadosamente.

4. Incubar a 25 ± 1 ºC durante 24 horas y efectuar el recuento. Se incuba a 25 °C porque las poblaciones son psicrotrofas ,para
nuestros mares .

Indicador de la polución,contaminación por manipulación

Recuento de Pseudomonas sp.- Aeromonas sp. (asociada al ambiente natural del pescado ) GRAM NEGATIVOS

1. Agregar 10 mL de agar GSP previamente enfriado a 50-55 ºC (adicionando con 100.000 UI/L de penicilina G sódica). Dejar
solidificar a temperatura ambiente.

2. Sembrar en superficie por estría de la dilución 10 -1. Generalmente se siembra 0,1 ml con espátula

3. Incubar la placa invertida hasta 72 hs a 25 ± 1 ºC.

Recuento de Vibrio parahemolyticus GRAM NEGATIVO

1. De la solución original 10-1 sembrar 0.1 ml en superficie por duplicado y esparcir utilizando una espátula de Drigalsky.

2. Las placas son preparadas con agar TCBS (agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa) selectivo para Vibrio sp.

3. Incubar a 37 ºC durante 24 hs.

4. Cuando en ambas placas se generan colonias verdes azuladas, se considera Vibrio parahemolyticus positivo. Desarrollo de
colonias en una sola de las placas o colonias amarillas, se considera resultado negativo.

Se interpretan por duplicado ,las dos tienen que tener

crecimiento para considerarlo positivo .

sulfito que produce sulfuro de hidrogeno en presencia de hierro

da sulfuro férrico .

EL MEDIO ES ALCALINO(Ph=8,6) , PORQUE VIBRIO TIENE POCA

RESISTENCIA A CONDICIONES ACIDAS
Investigación de Clostridium sulfitorreductores (presuntivo de C. botulinum tipo E) GRAM POSITIVO ,ESPORULADO .ANAEROBIO

1. Inocular un tubo con una porción del alimento a investigar

2. Calentar en baño maría durante 10 minutos a 80 ºC (para destruir las formas vegetativas y dejar las esporuladas) y enfriar
bajo canilla.

3. Agregar el agar diferencial para clostridios, el cual ha sido previamente fundido y entibiado a 48-50 ºC., en barra no inferior a
los 15 cm. Cubrir la superficie con una capa de parafina estéril.

4. Incubar a 25 ± 1 ºC durante una semana.

-si agregamos pedacito----cualitativa

-si sembramos dilución ----- cuantitativa

El tratamiento térmico es importante por q destruyo flora acompañante porque

hay muchas bacterias que reducen el sulfito a sulfuro .ademas que me quedo con
las formas esporuladas .

Clostridium ---catalasa NEGATIVO (((( Bacillus CATALASA POSITIVO))))

Análisis de Nitrógeno Básico Volátil por Conway

Reactivos

• Acido Bórico•Vaselina + Parafina líquida•K2CO3 soln. (K2CO3 50g + agua destilada 100 ml)•Acido Sulfurico 0.02 N

•Acido Tricloroacético (TCA) 7 %•Mezcla indicadora: verde de bromo cresol y rojo de metilo

Procedimiento

1.Preparación de la muestra

a) Pesar 5g de muestra b) Triturar en mortero c) Adicionar 20 ml de TCA 7 % d) Filtrar después de 30 minutos. e) Solución de
muestra.
TCA favorece la precipitación de proteínas del musculo
y solubilizar el sustancias nitrogenadas no proteicas .

K2CO3 : sirve para desplazar las bases que están en las

muestras porque las bases están como sales de lactato

El ácido bórico (débil) sirve de adsorbente,con esto

recogemos las bases que desplazamos de la muestra ,se
recolectan como una sal de base débil .

Después se valora con HCl.se regenera el ácido bórico.

por cada equivalente de HCL que gasto,equivale a un
equivalente de nitrógeno

2.Microdifusion

a) Colocar 1 ml de ác. bórico (interior) + indicador b) Colocar 1 ml de soln. de muestra (exterior) c) Sellar con vas. + par.

d)Agregar 1 ml de soln. de CO3K2 (exterior)

Ensayo en blanco

1.)Repetir los pasos a,b y d. En el paso b: colocar 1 ml de TCA 7 %. 2)Permitir la difusión de muestra y blanco durante 90 min. a 35 º C.
3) Titular con SO4H2 0.02 N, hasta viraje del verde pálido al rosa tenue