COMPROBACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

La integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por
ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa.
La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos
nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como
un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que
poseen.
En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga
negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo
(ánodo) durante la electroforesis

RESOLUCIÓN Y VELOCIDAD DE SEPARACIÓN

La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis dependen de:

-Concentración de agarosa (o acrilamida): a mayor concentración, menor tamaño de poro y
por lo tanto mayor resistencia al paso de las moléculas. A mayor concentración, además, se mejora lar
resolución o separación de los fragmentos pequeños. Cuando partimos de fragmentos grandes (más
de 1500 pb o DNA genómico), se suele utilizar una concentración de agarosa del 0,8-1%; fragmentos
de 500-1500 pb con geles de 1,5-2%; los menores, con geles de concentración 4-6%.
-El voltaje aplicado durante la electroforesis: a mayor voltaje, la migración se realizará con
mayor rapidez y en menor tiempo. Para evitar la fragmentación del DNA genómico, deben utilizarse
voltajes de unos 60V. Para la separación de fragmentos, jugamos con voltajes entre 20 y 120 V.

VISUALIZACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con
AGENTES INTERCALANTES. Son colorantes que se añaden al gel cuando se prepara, y se intercalan
entre las bases nitrogenadas del DNA, emitiendo fluorescencia cuando se les excita con una longitud
de onda apropiada. El más utilizado clásicamente es bromuro de etidio es ampliamente utilizado para
la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades
mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio.
En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como el Red Safe®,
desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.

Materiales
-Preparación del gel de agarosa
Buffer TBE (También se puede utilizar TAE, que incorpora ácido acético en lugar de ácido
bórico)
 Agarosa
Red Safe®
-Preparación de muestras: muestra de DNA genómico + buffer de carga
-Generuler
-Buffer de carga: glicerol + azul de bromofenol
-Sistema de electroforesis completo
-Cinta adhesiva
-Fuente de alimentación
-Micropipeta , puntas correspondientes, probeta, matraz Erln-Meyer
-Otro inventariable: Microondas, agitador, balanza

Procedimiento
1. Preparación del buffer TBE
1. Preparar 100 ml de solución EDTA pH 8.0
2. Preparar 500 ml de buffer TBE 5X
3. A partir del TBE 5X, preparar 1000 ml 1X.
4. Etiquetar debidamente la solución madre y la solución de trabajo 1X
2. Preparación del gel de agarosa
1. Montamos el sistema de preparación de geles. Si hay fuga, sellamos las juntas con cinta adhesiva
2. Colocamos el peine en la futura zona de carga del gel.
3. Prepararemos gel al 1%
4. Pesamos la agarosa, añadimos 100 ml de TBE y disolvemos 2’ en el microondas, extrayendo el
matraz frecuentemente y agitando hasta completa disolución.
5. Enfriarlo un poco bajo grifo (AGARRAR CON GUANTE TÉRMICO)
6. Añadir RedSafe, a una concentración de 1µl/20 ml (añadiremos 5 µl)
7. Vertemos el gel en la cubeta molde.
8. Dejamos solidificar.
NOTA: TENER CUIDADO PARA QUE NO QUEDEN BURBUJAS EN ZONA DE CARGA Y SEPARACIÓN.
3. Preparación de las muestras
9. Preparar las muestras para cargar, mezclando 15 µl de muestra + 4 µl de buffer de carga. (4 partes
de muestra por 1 parte de buffer de carga)
10. Realizar un spin para que todo baje hacia el fondo del tubo.
4. Carga y electroforesis
11. Retirar cinta del molde del gel
12. Colocar el molde con el gel dentro de la cubeta grande y rellenar con buffer TBE. OJO: COLOCAR LOS
POCILLOS EN LA ZONA DEL POLO NEGATIVO
a. Polo negativo o cátodo: NEGRO
b. Polo positivo o ánodo: ROJO
13. En la primera calle, cargaremos el patrón de bandas de tamaños conocidos, denominado Generuler
(5 o 6 µl, para tener 0,5 o 0,6 µg).
14. Con la micropipeta p100, pipetear con cuidado de que no se formen burbujas el contenido del tubo
y cargarlo con CUIDADO Y SIN FORMAR BURBUJAS en el pocillo correspondiente
15. Tapar con la tapa.
 16. Enchufar la fuente de alimentación.
17. Seleccionar un voltaje de 60 V y dejar correr las muestras durante el tiempo necesario para que se
produzca el desplazamiento de las muestras y la separación de los marcadores. VIGILARLO!!!
Aproximadamente tarda 1 h en correr, pero es variable.
5. Carga y electroforesis
18. Retirar cinta del molde del gel
19. Colocar el molde con el gel dentro de la cubeta grande y rellenar con buffer TBE. OJO: COLOCAR LOS
POCILLOS EN LA ZONA DEL POLO NEGATIVO
a. Polo negativo o cátodo: NEGRO
b. Polo positivo o ánodo: ROJO
20. En la primera calle, cargaremos el patrón de bandas de tamaños conocidos, denominado Generuler
(5 µl, para tener 0,5 µg).
21. Con la micropipeta p20 o p100, pipetear con cuidado de que no se formen burbujas el contenido
del tubo y cargarlo con CUIDADO Y SIN FORMAR BURBUJAS en el pocillo correspondiente
22. Tapar con la tapa.
6. Observación
23. Apagar la fuente de electroforesis
24. Extraer el gel de la cubeta molde
25. Colocarlo con cuidado sobre la base del transiluminador, hacia arriba la cara donde realizamos la
carga y con la calle del Generuler a la izquierda, y cubrirlo con la tapa de metacrilato.
26. Encender el ultravioleta
27. Tomar una fotografía del gel e interpretar los resultados obtenidos
ACTIVIDADES
1. Calcula la cantidad de solutos necesarios para preparar 500 ml de TBE

2. ¿Qué función tiene el Redsafe®? ¿A qué concentración se añade al gel?

3. Toma una fotografía del resultado de tu electroforesis e interpreta los resultados obtenidos.

4. ¿Cuál de tus muestras utilizarías para realizar una PCR posterior y por qué?