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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD DEL ZULIA


FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE BIOANALISIS
CATEDRA: ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografía líquida de
Alta Resolución HPLC
Cromatografía
 Es un conjunto de técnicas basadas en el
principio de retención selectiva cuyo
objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla y en algunos
casos identificar estos si es que no se
conoce su composición.
Cromatográma
 Esuna gráfica u otro tipo de presentación
de la respuesta de un detector, la
concentración de un analito en el efluente u
otra magnitud usada como medida de la
concentración en el efluente, frente al
volumen de efluente o al tiempo.
Términos Básicos
Tiempo de Retención Platos teóricos
 Es el tiempo transcurrido  Se utiliza como una
entre el instante en que medida de la eficiencia de
se introduce la mezcla y la columna, este
el instante en que se directamente relacionado
detecta la señal propia con la varianza, por ello
del componente en su resulta convenientemente
máxima intensidad. Los medir la eficiencia de la
tiempos de retención no columna en los términos
son reproducibles, ni de varianza y longitud de
siquiera en una misma la columna.
columna cromatográfica.
Términos Básicos
Resolución Selectividad
 Es el parámetro que  Muestra las diferencia de
expresa el grado de afinidad por los solutos de
separación que se puede las fases involucradas,
obtener en un sistema indica el potencial de
cromatográfico para dos separación de esos
componentes dados. solutos en el sistema,
Relaciona la capacidad pero no mide la
separadora de un sistema separación real.
cromatográfico para dos
componentes.
Términos Básicos
Eficiencia

Elución  Es el procedimiento en el que la fase


móvil se pasa de forma continua a
través o a lo largo del lecho
cromatográfico y la muestra se
suministra al sistema de forma
discreta, como una pequeña cantidad
en un tiempo breve.
Términos Básicos
Fase Estacionaria
 Es la que recubre la columna cromatográfica, interiormente sin
desplazarse. La fase estacionaria consiste en partículas,
generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie micro
porosa, de forma que presenta un amplio desarrollo
superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o
extendida en forma de capa.
 Puede ser un líquido o un gas que recorre
la columna cromatográfica transportando
Fase móvil los componentes de la mezcla a través de
dicho sistema.

Es aquella sustancia que se pone en


ELUYENTE contacto con la fase estacionaria y permite
que se desplace la muestra.
Fundamento de la
cromatografía
Existen dos tipos de fundamento:
 Fundamento remoto:  Fundamento próximo: Se
Este fundamento se encuentra en el hecho de
encuentra en alguna o que es muy improbable que
algunas propiedades dos especies presenten
cuantitativamente el mismo
físicas o físico químicas
par de propiedades físicas o
de los analitos: físico - químicas frente a un
solubilidad, adsorción sistema cromatográfico
(tendencia a ser dado. Por tanto, en estas
retenidos en sólidos diferencias, que pueden ser
finamente divididos), muy pequeñas, se basa la
volatilidad, tamaño, separación cromatográfica.
carga, reactividad
química o bioquímica,
Cromatograma
Componentes de un
instrumentos de cromatografía
HPLC
 Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro
pequeño, generalmente de acero inoxidable.

 Tipos de Bombas:
 Bombas reciprocas
 Bombas de desplazamiento
 Bombas neumáticas
Componentes de un
instrumentos de cromatografía
HPLC
 Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías
que permite introducir en el flujo de solvente, la
muestra contenida en un aro o loop de volumen
calibrado. Se producen pequeñas cantidades de
muestra (0.1-100μL)

 Columnas: Las columnas para cromatografí­a de


líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en
algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de
paredes resistentes. Estas ultimas solo se utilizan a
presiones menores de unos 600 psi. Existen diversos
tipos: columnas analíticas, precolumnas, columnas
termostatizadas.
Componentes de un instrumentos
de cromatografía HPLC
Detector Registrador integrador
 Produce una señal eléctrica  Realiza un gráfico de
proporcional a la cantidad intensidad en función del
de materia y esa señal es tiempo (cromatograma) que
enviada al registrador. idealmente, se trata de picos
Deben de tener un volumen gaussianos y cada pico
interno pequeño para
reducir el ensanchamiento corresponde a un
de pico. Basados en una componente de la muestra
propiedad de la fase móvil original. Este que El
(refracción, densidad etc.) y integrador calcula además el
en una propiedad del soluto área correspondiente a cada
(absorbancia en UV, pico, la cual es proporcional
fluorescencia etc.) a la cantidad de sustancia
Componentes de un
instrumentos de cromatografía
HPLC
Cuadro comparativo de
Detectores
Cromatografía de fase normal
y de fase inversa
 Fase normal: se caracteriza por separar los compuestos en base
a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y
una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de
interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es
retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción
aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar
(en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de
retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales
del compuesto de interés, sino también en factores estéricos de
forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden
diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más
polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los
compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos
tienden a aumentar el tiempo de retención.
Cayo en desuso debido a la falta de reproductibilidad de los
tiempos de retención puesto que los disolventes próticos
cambiaban el estado de hidratación de la silica o alúmina de la
cromatografía.
Cromatografía de fase normal
y de fase inversa
 Fase inversa: consiste en una fase inmóvil apolar y una
fase móvil de polaridad moderada. El tiempo de retención
aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil
y disminuye con la introducción de disolventes más
hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan
utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
especificación adicional. La cromatografía de fase reversa
se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas
que resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La
fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase
estacionaria es la disminución del área del segmento
apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto
hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía
libre de la entropía asociada con la minimización de la
interfase compuesto-disolvente polar.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor
facilidad que las columnas de silica normales.
Separación isocrática y
separación con gradiente
Parámetros que afectan la
resolución de la columna
 Diámetro de la partícula: La mayoría de HPLC
tradicionales se realizan con una fase
estacionaria unida al exterior de partículas
esféricas de silica. Estas partículas pueden tener
diferentes medidas, siento las de 5\mum de
diámetro las más utilizadas. Partículas más
pequeñas ofrecen una mayor superficie y una
mejor separación, pero la presión que se requiere
por obtener una velocidad lineal óptima aumenta
de forma inversamente proporcional al cubo del
diámetro de la partícula. Esto significa que
disminuir la medida de las partículas a la mitad,
aumentaría la resolución de la columna, pero a la
vez, aumentaría la presión necesaria en un factor
de ocho.
Parámetros que afectan la
resolución de la columna
 Longitud de la columna: El diámetro interno de
una columna de HPLC es un aspecto crítico que
determina la cantidad de muestra que se puede
cargar a la columna y también influye en su
sensibilidad. La resolución aumenta con la longitud
de la columna. La banda individual de cada sustancia
puede ensancharse con el tiempo debido a procesos
disfuncionales, disminuyendo por tanto la resolución.
Parámetros que afectan la
resolución de la columna
 Diámetro de la columna: El diámetro interno de
una columna de HPLC es un aspecto crítico que
determina la cantidad de muestra que se puede
cargar a la columna y también influye en su
sensibilidad. Las columnas de diámetro interno más
grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la
purificación de compuestos para su utilización
posterior. En cambio, las columnas de diámetro
interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis
cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el
aumento la sensibilidad y la minimización del
consumo de disolventes que conllevan. Estas
columnas se suelen denominar columnas de rango
analítico y normalmente están asociadas a un
Características del solvente
(fase móvil).
• Es un solvente líquido, el cual puede ser
puro o una mezcla de solventes.
• El tiempo de retención aumenta con la
adición de disolvente polar a la fase móvil
y disminuye con la introducción de
disolventes más hidrofóbicos.
• El líquido, se obliga a pasar a través del
sólido bajo presión o bien se deja percolar
a través de él, por efecto de la gravedad.
Análisis cualitativos y
cuantitativos en HPLC
Aplicación de la HPLC en análisis
Diversos
 Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales
inorgánicas, ácidos orgánicos, etc.
 Compuestos de alto peso molecular, como polímeros,
hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
 Compuestos termolábiles y no volátiles, como
vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas
y un producto muy grande de otros productos
farmacéuticos.
 Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto
tiempo.
 Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos
(nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de
intercambio iónico.
 Determinación de esteroides.
 El análisis de medicamentos (determinación de los
componentes activos de una tableta analgésica, análisis
de barbitúricos, anticonceptivos, etc).
Aplicación de la HPLC en análisis
Diversos
 En separaciones según el tipo químico, ya que su
finalidad no es la separación de compuestos
individuales, sino de grupos diferentes de sustancias
presentes en las mezcla.
 La identificación y cuantificación aproximada de
azúcares (separación de isómeros de las aldohexosas
que son difíciles de separar con otras técnicas
cromatográficas) aunque está restringido a laboratorios
que puedan hacer frente a los altos costes que esta
técnica tiene.
 Los edulcorantes a granel al igual que los azúcares se
determinan por HPLC (en refrescos y alimentos), como
el aspartamo o la sacarina.
 También se emplea para la determinación de vitaminas,
como es el caso de la vit. B2 (riboflavina), vit. E, vit. D,
vit. A y carotenoides.
 Y para el análisis de residuos de pesticidas en frutas y
verduras, además de la observación de ácidos