PRACTICA N°2

MEDICIONES, CURVA DE
CALIBRACION Y CONTROL DE
CALIDAD
Mg. CALDERON CORDOVA ANYELA NATALY
ACTIVIDAD ENZIMATICA
Se puede determinar la actividad enzimática analizando:
• La aparición de algún producto
• La desaparición del sustrato
• La variación de un cofactor o de algún componente de
la reacción

La fase de retardo tiene lugar inmediatamente después de

mezclar los
reactivos con la muestra biológica. Su duración es muy variable
(segundos a minutos).
La fase lineal en la que la formación de producto permanece
constante, siendo la concentración de enzima de la
muestra es el único factor limitante.
Por último, a medida que va
transcurriendo la reacción, llega un momento en que el sustrato u
otro reactivo se van agotando (fase de agotamiento de
sustrato) y la velocidad de reacción disminuye hasta anularse.
 ACTIVIDAD ENZIMATICA
❖Si el producto absorbe luz a una longitud de onda determinada podemos
evaluar la aparición del producto analizando el incremento de absorbancia
a dicha longitud de onda.
❖Si el sustrato absorbe luz a una longitud de onda determinada podemos
evaluar la desaparición del sustrato analizando la disminución de absorbancia
a dicha longitud de onda.
❖De igual modo podemos analizar la variación de un cofactor o de algún
componente de la reacción. Ej. es muy frecuente utilizar la aparición o
desaparición de NADH o NADPH, así
TIPOS DE MEDICIONES
 MEDICIONES DE PUNTO FINAL:
Características principales de punto final:
➢Determinar la cantidad total de analitos consumidos durante la progresión de una
reacción.
➢En este método se considera el punto final de la reacción en lugar de dos puntos
específicos como en el método cinético.
➢El punto final se produce entre 5 y 15 minutos a 37℃
➢ La reacción puede dar un producto coloreado o un producto incoloro al final
➢ Se mide al final de un tiempo fijo de incubación.
➢ La absorbancia de la muestra aumenta con el tiempo.
➢ Alcanza un valor estable que cambiara más con el tiempo.
 MÉTODO CINÉTICO
En ellos se mide la velocidad de la reacción mediante la medida de la variación de la absorbancia en el tiempo
y eso se relaciona con la concentración. Es una medición continua, a diferencia de la del punto final, se mide en
tiempos regulares. Se puede medir la cantidad de sustrato no transformado o la cantidad de producto formado

✓ Altamente Específico: esto se logra con una correcta selección

del sustrato, de acuerdo a la enzima que se quiera determinar.
✓ Buena Exactitud y Precisión: el método debe contar con pocas
medidas volumétricas que es donde se producen errores
apreciables.
✓ Simple: debe poder aplicarse a cualquier laboratorio de rutina,
desde el punto de vista económico y el tiempo requerido para
su realización.
✓ Sensibilidad suficiente: permite detectar deltas de absorbancias
de 0,002, lo que implica un límite de detección de 0,1 UI/lt.
 METODOS CINETICOS
MEDICIÓN DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
MEDICIÓN DE DOS PUNTOS
✓ La velocidad de la reacción se averigua con diversas
✓ Adolece de muchas fuentes de error, ya que el
técnicas y según diversos principios.
proceso de la reacción solo se mide en dos
✓ Entre las numerosas técnicas para la medición de
lugares.
enzimas, ocupan un lugar destacado los test en los que
✓ En actividades enzimáticas elevadas, la reacción
las coenzimas NADH y NADHP sirven de indicador, como
puede hacerse más lenta o detenerse por
se verá en la siguiente clasificación puramente práctica:
consumo del substrato, incluso antes de la
✓ 2b1-: Métodos cinéticos sin NADH o NADHP
segunda medición.
✓ 2b2-: Métodos cinéticos con NADH o NADHP.
 CURVA DE CALIBRACIÓN
Curva de referencia construida con
cantidades conocidas de una
sustancia que se utiliza para
determinar la cantidad de esta
sustancia (proteínas) presente en una
muestra incógnita.
Generalmente la reacción es lineal

donde CA es la concentración del analito, y la señal

medida, a la ordenada en el origen y b la pendiente
de la recta.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
ERRORES