SESIÓN DE

APRENDIZAJE 08
BIENVENIDOS
A NUESTRA
AULA VIRTUAL
 CURSO:
INMUNODIAGNOSTICO

• FUNDAMENTOS DE PRUEBAS
CON METODOLOGÍAS POR
RADIOINMUNOENSAYO

Docente: Lic. William F. PEÑA PALOMINO

 IMPORTANTE :
1. Sé puntual.
2. Mantén micrófono y cámara desactivados.
3. Para hacer preguntas usa el chat
únicamente, espera indicaciones de la
maestra.
4. Al terminar la clase, todos los alumnos
deben salir de esta.
5. Se respetuoso en todo momento.
6. Pon atención, pregunta al final para que
RECUERDA: puedas usar el tiempo designado para
resolver dudas

Recuerda que la clase en línea puede estar

siendo grabada y nuestro reglamento de
conducta se aplica para Cualquier falta a este.
¡Disfruta la clase!
Reconocer el manejo de un laboratorio
OBJETIVOS
clínico, así como sus características y
normas legales de desarrollo e
DE LA SESIÓN
interaccion en el servicio de salud.
DE
APRENDIZAJE
 INTRODUCCION
• En los exámenes de inmunología en general requiere métodos de laboratorio de
precisión.
• Pequeños cambios en los niveles de medición nos puede llevar a errores de
interpretación y resultados.
• Los métodos analíticos para evaluar los problemas inmunologías y endocrinos
están continuamente en expansión.
• Las mediciones tradicionales de factores inmunológicos, proteínas, hormonas
están siendo complementadas por una amplia gama de biomarcadores,
particularmente con respecto a los cánceres.
• La comprensión de los principios básicos de los métodos y el control de calidad son
esenciales para que los médicos puedan evaluar la fiabilidad de los resultados y
trabajar eficazmente con el laboratorio.
• Las pruebas de laboratorio que se practican hoy en día contribuyen
significativamente y de manera directa al costo de la atención.
• Los médicos y los patólogos están obligados a comprender el funcionamiento de la
medicina de laboratorio y trabajar en equipo.
 INTRODUCCION
• El radioinmunoensayo es un tipo de inmunoensayo o método
radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejos
antígeno-anticuerpo, lo que lo dota de una gran especificidad, unida a la gran
sensibilidad de los mé todos radiológicos.
• En sus orígenes, esta técnica fue desarrollada en 1960 por Solomon A. Berson
y Rosalyn Yalow
• Determinaba la concentración de insulina presente en una muestra de plasma
sanguíneo.
• Los anticuerpos deben ser específicos contra la sustancia que queremos
determinar, y tener una gran afinidad.
• La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada, e inferior a la
cantidad de antígeno total.
• Todos los principios básicos empleados en el procedimiento de ELISA son los
mismos usados para el RIA cuantitativo, con la diferencia de que la medición
de la actividad de la enzima en ELISA es por fotocolorimetría, mientras que
en RIA es por contaje de radioactividad.
 INTRODUCCION
• Es una técnica inmunológica propuesta en por Yallow y Berson, que tiene una
gran aplicación en clínica.
• Permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el
organismo en concentraciones tan bajas (como ng/ml (nanogramo=10-9g) o
incluso de pg/ml (picogramo=10-12 g).
• Incluso hacerlo en mezclas con enormes cantidades y diversidad de materiales
extraños, por lo que no es necesario purificar previamente la muestra.
• El radioinmunoanálisis se basa en una reacción antígeno- anticuerpo.
• Los anticuerpos deben ser específicos contra la substancia que queremos
determinar y debe tener una gran afinidad.
• La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada, e inferior a la
cantidad de antígeno total.
• Por lo que va a quedar saturado con él.
 CICLO PARA LA REALIZACION DE UN EXAMEN DE
LABORATORIO
• .
 FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS
BIOQUIMICOS
PREPARACIÓN DEL PACIENTE:
• Ayuno: se aconseja de forma generalizada; en algunos casos se puede
beber agua.
• Alcohol: altera la concentración de lactato, ácido úrico, enzimas
hepáticas.
• Se sugiere evitarlo por lo menos 24 horas antes de la toma del examen.
• Tabaco: contraindicado si se piden catecolaminas, cortisol, ácidos grasos.
• Ejercicio físico: altera los niveles de enzimas musculares como la
creatinfosfoquinasa (CPK).
• Estrés: puede alterar los resultados de diversos análisis
 FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS
BIOQUIMICOS
PREPARACIÓN DEL PACIENTE:
• Dieta: algunos parámetros requieren restricciones o cambios en
la dieta previos a la determinación. Ej. Aclaramiento de
creatinina: no tomar exceso de carne.
• Supresión de la medicación: para el aclaramiento de creatinina
suprimir por ejemplo antiinflamatorios no esteroideos.
• Edad: los resultados pueden variar de acuerdo a esta.
• Embarazo: altera una gran variedad de parámetros de
laboratorio.
 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

• Extracción de sangre:
• en posición sentado o recostado.
• Recolección de orina de 24 horas:
• Algunos parámetros requieren condiciones de acidez por lo
que habrá que añadir un ácido al recipiente de recolección (Ej.
El 5- hidroxiindolacético, aldosterona en orina, etc).
• Niveles de fármacos:
• hay que tener en cuenta la hora de la administración.
• Se suelen tomar las muestras 3-4 horas antes de la siguiente
dosis.
• Hay casos particulares.
 MUESTRA
• Ambiente toma de muestra.
• Verificación de instrucciones adecuadas. (Verbales y escritas)
• Identificación paciente/ muestra.
• Tipo de muestra (arterial o venosa).
• Cantidad de muestra requerida.
• Posición cómoda
• Limpieza del brazo (ALCOHOL 70%)
• Selección del sitio de punción (mediana cubital y mediana cefálica, no
venoclísis, no hematomas).
• Torniquete (No mas de un minuto y quitarse tan pronto fluya la sangre,
no apretado).
• Materiales adecuados (Aditivos, jeringa, tubos, agujas).
• Anticoagulantes (EDTA, heparina).
 MANEJO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE
• Intervalo de tiempo entre la obtención y el análisis.
• La evaporación de la muestra.
• Exposición a la luz (bilirrubinas, porfirinas, vitamina A).
• Descomposición de ciertos analitos con el tiempo.
• Temperatura ambiente, refrigeración, congelación.
INTERFERENCIAS
• Contaminación (tapones, tubos mal lavados).
• Separadores de suero (a temperaturas mayores de 25 grados o mayores
velocidades de centrifugación el gel puede descomponerse, no se
recomienda para determinación de hormonas).
• Descomposición de la muestra debido a altas temperaturas.
 CRITERIO DE RECHAZO DE UNA MUESTRA
• Identificación inadecuada.
• Volumen inadecuado.
• Uso de tubo inadecuado.
• Hemólisis.
• Transporte inadecuado.
 ETAPA ANALÍTICA

FUENTES DE VARIACIÓN:
• Reactivos.
• Material y limpieza.
• Medición de volúmenes.
• Mezclado.
• Tiempo y temperatura de reacción.
• Interferencia/especificidad.
• Instrumentos (manejo adecuado, mantenimiento,
estabilidad electrónica, resolución óptica).
 FASE ANALÍTICA
• TÉCNICAS ANALÍTICAS:
• son los diferentes procedimientos de análisis basados en el
comportamiento de una muestra ante influencias físicas o
químicas:
• Espectrofotometría:
• Electroforesis.
• Cromatografía
• Electroquímica.
• Química seca
• Inmunoensayo
• Microscopia
• Entre otros
 FASE POSTANALÍTICA
• Es el conjunto de procesos que van desde la obtención de los
resultados analíticos hasta que el clínico solicitante tiene el informe
de resultados.
• Es una fase compleja pero decisiva para cumplir una calidad total.
• Validación de resultados:
• Valoración técnica: es la aceptación de los resultados obtenidos por las distintas
técnicas.
• Valoración clínica: los resultados deben ser coherentes con la clínica.
• Informe de resultados: deben ser claros y precisos.
• Tiempo de respuesta: es el tiempo que transcurre hasta que se entregan los
resultados al médico solicitante.
• Debe ser lo más corto posible, sin sacrificar la calidad.
• Teoría de los valores de referencia: son intervalos de normalidad de los
resultados, los límites superior e inferior no son rígidos (se pueden usar los
valores anteriores del propio sujeto aunque normalmente no se tienen datos
suficientes).
 VARIABILIDAD

• Variabilidad de los resultados analíticos:

• Variaciones analíticas: toda determinación analítica está
sometida a una variación que se denomina “error analítico”
• Variaciones extra analíticas: pueden ser fisiológicas, tanto
interindividuales como intraindividuales.
 ENZIMOINMUNOANÁLISIS
• Son técnicas inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones
antígeno-anticuerpo como en el RIA, y siguiendo un protocolo
experimental similar.
• La diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un
enzima en vez de con un isótopo radiactivo.
• La cuantificación se hace por tanto, basándose en la medida de la
actividad del enzima marcador.
• Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, se añade un
sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un
compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad
enzimática con ayuda de un espectrofotómetro.
• Esta medida de la actividad sirve para calcular la concentración de la
molécula problema.
 ENZIMOINMUNOANÁLISIS
• Las técnicas enzimáticas presentan numerosas ventajas respecto al
radioinmunoanálisis (RIA):
• No utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulación y evita
la necesidad de instalaciones y licencias específicas.
• Reactivos de larga duración.
• Posibilidades de automatización.
• Gran sensibilidad.
• Los EIA pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos.
• Ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las
sustancias reactantes antes de medir la actividad enzimática.
• Ensayos heterogéneos sí necesitan la separación física de los reactantes
en las fracciones libre y ligada antes de la determinación de la actividad
de la enzima marcador.
 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• ELISA es una variedad del EIA en la que se utiliza una fase sólida como
método de separación y recibe el nombre de ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay).
• ELISA tipo sándwich: Es la variedad de ELISA más utilizada y que da
mejores resultados.
• Reactivos:
• Anticuerpo monoclonal ligado a la fase sólida y
• Anticuerpo monoclonal marcado con la enzima.
• Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra
determinantes distintos del mismo antígeno, lo que permite que los
dos se puedan unir al antígeno al mismo tiempo, pero por sitios
diferentes.
 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• Los anticuerpos específicos se encuentran unidos a la fase sólida (V.g. la

pared del tubo de análisis), de forma que toda el antigneo presente en la
muestra problema reacciona con ellos quedando inmovilizada.
• A continuación se lava el tubo para eliminar el resto de moléculas sin
interés (no unidas).
• Se añade el resto de anticuerpos marcados con el enzima.
• Estos anticuerpos también se unen al antígeno del complejo
inmovilizado.
• Tras otro lavado que elimina el exceso de anticuerpo marcado no unido,
se añade el sustrato y se cuantifica la reacción.
• La formación de producto será directamente proporcional a la
concentración de antígeno en la muestra
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