PRÁCTICA #8.

SEPARACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

Joan Sebastian  Rodriguez Carlosama        cod: 202127357

Hernan Dario Roballo Rodriguez                cod: 202127108

Dairo Sebastián Pinilla Duarte           cód: 202127967

INTRODUCCIÓN

Los reactivos de biuret contienen CuSO4 (debido a la presencia de NaOH) en una solución
acuosa alcalina. La reacción se basa en la formación de un compuesto púrpura debido a la
formación de un complejo de coordinación entre el ion Cu+2 y el par solitario de electrones
de nitrógeno que forman parte del enlace peptídico si la reacción es positiva. Si el biuret tiene
una reacción negativa, permanece azul.

Las proteínas tienen un nivel de pH característico donde su carga neta es cero. Este valor de
pH se denomina punto isoeléctrico (PI). En el punto isoeléctrico, las cargas positivas y
negativas están en equilibrio, por lo que las proteínas tienen el mayor potencial de
precipitación, reduciendo su solubilidad y favoreciendo su agregación. El punto isoeléctrico
es el valor de pH en el que la carga neta es cero y no se produce transferencia de campo
eléctrico. Para los aminoácidos, generalmente se consideran puntos isotónicos, donde las
cargas positivas y negativas son iguales.

Para las proteínas, estos dos puntos no siempre son los mismos porque los iones distintos de
los iones de hidrógeno (H+) pueden unirse a los aminoácidos. La caseína constituye el 80 %
de la proteína de la leche y el 2,7 % de la composición de la leche líquida. La caseína es una
proteína láctea conjugada del tipo fosfoproteína, que se separa de la leche por acidificación y
forma una masa blanca. En la caseína, la mayoría de los grupos fosfato están unidos a los
grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina.
La caseína en la leche existe en forma de sales de calcio. Las caseínas son un grupo
heterogéneo de proteínas y, por lo tanto, difíciles de definir. Pero todas las proteínas de
caseína tienen una cosa en común: cuando la leche se acidifica a un pH de 4,6, precipitan. Es
por eso que la caseína también se conoce como una proteína de leche insoluble.

MARCO TEÓRICO

Proteínas: Las proteínas son moléculas grandes y complejas que desempeñan muchas
funciones críticas en el cuerpo. Realizan la mayor parte del trabajo en las células y son
necesarias para la estructura, función y regulación de los tejidos y órganos del cuerpo.

Propiedades de las proteínas: Las propiedades de las proteínas dependen básicamente de los
radicales R presentes en los aminoácidos que las constituyen, que pueden reaccionar entre sí
y con las sustancias que los rodean. El centro activo de una proteína viene dado por los
aminoácidos, cuyos radicales pueden reaccionar con otras moléculas. Las principales
propiedades de las proteínas son tres:

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Especificidad: La especificidad se refiere a su función; cada una lleva a cabo una
determinada función y lo realiza porque posee una determinada estructura primaria y una
conformación espacial propia; por lo que un cambio en la estructura de la proteína puede
significar una pérdida de la función. Además, no todas las proteínas son iguales en todos los
organismos, cada individuo posee proteínas específicas suyas que se ponen de manifiesto en
los procesos de rechazo de órganos trasplantados. La semejanza entre proteínas son un grado
de parentesco entre individuos, por lo que sirve para la construcción de "árboles
filogenéticos".

Solubilidad: Las proteínas son solubles en agua cuando adoptan una conformación globular.
La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al ionizarse,
establecen enlaces débiles (puentes de hidrógeno) con las moléculas de agua.

Desnaturalización: Consiste en la pérdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes

que forman dicha estructura. Todas las proteínas desnaturalizadas tienen la misma
conformación, muy abierta y con una interacción máxima con el disolvente, por lo que una
proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y precipita. La
desnaturalización se puede producir por cambios de temperatura, ( huevo cocido o frito ),
variaciones del pH. En algunos casos, si las condiciones se restablecen, una proteína
desnaturalizada puede volver a su anterior plegamiento o conformación, proceso que se
denomina renaturalización.

PROCEDIMIENTO

La clara de 1 huevo: Se vierte la clara de huevo en un vaso de precipitado y se adicionan 50

ml de agua destilada, se agitó con el fin de disolver. Esta solución se utilizó para las pruebas
a desarrollar en el laboratorio.

1. REACCIÓN CON BIURET

Tubo No. Albúmina de Leche Sacarosa Reactivo de

huevo Biuret
1 2 ml 0.5 ml
2 2 ml 0.5 ml
3 2 ml 0.5ml

Agitar cada tubo y observar la coloración formada. Dibuje los resultados obtenidos.

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 Huevo, leche, sacarosa

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Coloración de la albúmina de huevo: luego de haber agregado reactivo de biuret 0.5 ml, se
agitó el tubo de ensayo y se observó después de un minuto que esté presentó un precipitado
de color violeta oscuro y a medida que pasó unos pocos minutos el color se volvió más
intenso. segun la teoria nos dice que al tornarse de color violeta oscuro nos indica que la
reacción fue positiva e indicando la presencia de proteínas.

Coloración de la leche: al agregar reactivo de biuret 0.5 ml, se agitó el tubo de ensayo y se
observó después de un minuto que este presentó un color violeta claro. Esto quiere decir que
si hay presencia de enlaces peptídicos.

Coloración de la sacarosa: al agregar reactivo de biuret 0.5 ml, se agitó el tubo de ensayo y
se observó después de un minuto que este presentó una coloración azul cielo. En esta
reacción no hay presencia de enlaces peptídicos.

2. PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POR ACCIÓN DEL CALOR

Se tomaron en 2 tubos de ensayo 5 mL de la solución de clara de huevo. A uno de ellos

se agregaron 0.5 mL de ácido acético al 5%. Luego se colocaron ambos tubos en un
vaso de precipitado que contenía agua de la llave a temperatura ambiente y se empezó a
calentar. Con la ayuda de un termómetro se determinó la temperatura en que empezó a
precipitar las proteínas; esto se determina porque la solución empieza a enturbiarse.

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ANÁLISIS DE RESULTADOS:

- Tubo con ácido acético al 5%: En este caso a medida que aumenta la temperatura de
la proteína, su estructura cambia, provocando la desnaturalización de la proteína.
Como también el factor de cambio de pH provocado por el ácido, facilita la
deformación de las estructuras de un estado complejo como lo pueden ser las
terciarias y las cuaternarias a una estructura básica como lo es la primaria.

- Tubo sin reactivos: A medida que aumenta la temperatura de la proteína, la

estructura cambia, provocando la desnaturalización de la proteína. Esto se llama
reacción de Maillard, un tipo de glicación no enzimática de proteínas, lo que significa
una modificación que resulta de un cambio químico en los aminoácidos.

3. PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POR DESHIDRATACIÓN

Por acción de sales

Tubo Albúmina Leche Sacaros Sulfato de

No. de huevo a amonio sólido

1 3 mL 0.5 g
2 3 mL 0.5 g
3 3 mL 0.5 g

Observe la formación de precipitado. Dibuje los resultados obtenidos

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ANÁLISIS DE RESULTADOS

● Formación de precipitado de huevo: Se logra identificar una precipitación muy

notable a la albúmina de Huevo, la razón por la cual ocurre es debido a que este tipo
de proteínas presenta un conjunto de enlaces peptídicos muy fuertes, que muy difícil
se pueden separar y desnaturalizar.
● Formación de precipitado de leche: Esta proteína presenta enlaces débiles, lo que
permitió que la leche se diluyera, de tal manera que no presente precipitados que sean
notables.
● Formación de precipitado de sacarosa: Finalmente la sacarosa presenta enlaces que
son un tanto fuertes, el cual no se fracturó en su totalidad, de esta manera generando
un precipitado notable

El agente que facilitó la separación de las proteínas fue el Sulfato de Amonio, ya que altera la
solubilidad por la presencia de sal en altas concentraciones, este reactivo también provoca la
desnaturalización de las estructuras de los aminoácidos.

Por acción del etanol

Tubo No. Albúmin Leche Sacaro Etanol al

a de sa 95%
huevo
1 2 mL 2 mL
2 2 mL 2 mL
3 2 mL 2 mL

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 Se adiciona despacio el etanol y sin agitar. Observe la formación de precipitado en la
zona de unión de los dos líquidos.

Dibuje los resultados obtenidos.

ANÁLISIS DE RESULTADOS
La función del etanol consta de principalmente en 3 Formas:
l) Cambiar la fluidez de la membrana que afectará directamente la operación
proteínas tales como enzimas y canales.
2) Produce una deshidratación a nivel de membrana.
3) interactúa directamente con las proteínas de la membrana.
● Albúmina de huevo: El alcohol reacciona con la albúmina, responsable de convertir
la clara transparente en una tonalidad blanca; ya que el alcohol rompe los enlaces
proteicos de las claras de huevo.
● Leche: El alcohol provoca inestabilidad coloidal de las micelas de caseína debido a su
efecto desnaturalizante. Entre los muchos factores que contribuyen a la inestabilidad
de la leche se encuentran el pH de la leche, la raza, la calidad nutricional y el
equilibrio mineral. Por esta razón los enlaces peptídicos se separan hasta cierto punto
quedando en el precipitado las estructuras que no fueron separadas.
● Sacarosa: Por último, el etanol tuvo total efecto sobre la sacarosa pues desintegró
cada estructura que poseía, sin generar precipitación

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5. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA

Extracción de la Caseína

Coloque 50 mL de leche en un vaso de precipitado y adicione 50 mL de agua destilada,

agite y ajuste el pH a 4.8 adicionando HCl 0.5N (con la ayuda del pHmetro), a este pH la
caseína precipita. Deje en reposo la solución por 10 minutos, decante el líquido y el resto
fíltrelo a través de papel de filtro.

Transfiera el precipitado anterior a un vaso de precipitado y adicione 20 mL de etanol al

95%, agite por 5 minutos y filtre de nuevo. El precipitado es la caseína pura. Seque lo mejor
posible con el papel de filtro.

Preparación de la solución de caseína:

Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50 mL.

Agregue 20 mL de agua destilada y 5 mL de NaOH 1N; agite hasta lograr una solución
total de la caseína.

Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 mL, adicione 5mL de
ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50 mL y mezcle bien.

La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

Realizar la prueba de biuret.

Determinación del punto isoeléctrico de la caseína

Preparar los siguientes tubos:

Tubo No. Agua Ácido Ácido Ácido Caseína

Acético Acético Acético PH
0.01 0.1 N 1.0 N resultante
N
1 8.4 ml 0.6 ml - - 1.0 ml 5.9
2 7.7 ml 1.3 ml - - 1.0 ml 5.6
3 8.8 ml - 0.2 ml - 1.0 ml 5.3
4 8.5 ml - 0.5 ml - 1.0 ml 5.0
5 8.0 ml - 1.0 ml - 1.0 ml 4.7
6 7.0 ml - 2.0 ml - 1.0 ml 4.4

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 7 5.0 ml - 4.0 ml - 1.0 ml 4.1
8 1.0 ml - 8.0 ml - 1.0 ml 3.8
9 7.4 ml - - 1.6 ml 1.0 ml 3.5

✓ Agitar cada uno de los tubos de ensayo cada vez que añade un reactivo y esperar unos 3
minutos.
✓ La aparición de turbidez indicará la insolubilidad de la proteína.
✓ Mayor turbidez menor solubilidad de la proteína.
✓ Escriba el valor del punto isoeléctrico de la caseína y explique por qué llego a esa
conclusión.
El punto isoelectrico de la caseína no se logro identificar pero el de la albúmina de
huevo es 4.4 se llega a esta conclusión teniendo en cuenta que en este tubo se presentó
mayor turbidez y algo de precipitado según la teoría este tipo de proteínas en general,
son solubles en agua, se digieren fácilmente y contienen una buena proporción de
aminoácidos esenciales. Su punto isoeléctrico es 4,9 y pues nuestro dato está cerca hay
que tener en cuenta que se pudieron cometer errores en el momento de medir.

● Qué clase de proteína es la caseína desde el punto de vista de su

configuración, composición, estructura y función.
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se
separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las
fosfoproteinas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una
sustancia que contiene ácido fosfórico, está químicamente unida a una
sustancia que contiene ácido fosfórico, la mayoría de los grupos fosfato están
unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina (22).

● Qué color y consistencia tiene la caseína obtenida.

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 Hay que tener en cuenta que no pudimos utilizar la caseína de acuerdo que un
grupo al utilizarla no obtuvo resultados y se concluyó que podía estar en mal
estado o mal preparada de acuerdo a esto se utilizó la albúmina de huevo la
cual no se obtuvo mucho resultado solo en uno intentó haber un poquito
precipitado y otros 4 intentaron obtener una leve turbidez y las demás no se
obtuvo ningún resultado, al haber utilizado la caseína esta tiende a tomar un
color violeta y en uno de estos tubos se notaría más turbio .
● ¿La caseína tiene que ver con la calidad de la leche?
Dentro de la caseína de la leche, la kappa-caseína tiene gran influencia en la
composición de la leche en relación con su capacidad de coagulación, tiempo
de formación del cuajo, tasa de formación de la cuajada, y vigor del coágulo
en la producción de queso para consumo humano

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS.

● ¿Qué son las proteínas y qué es lo que hacen? (s/f). Medlineplus.gov. Recuperado el
25 de noviembre de 2022, de
https://medlineplus.gov/spanish/genetica/entender/comofuncionangenes/proteina/
●
● Propiedades de las proteínas. (s/f). Juntadeandalucia.Es. Recuperado el 25 de
noviembre de 2022, de
https://www.juntadeandalucia.es/averroes/centros-tic/18009389/moodle2/pluginfile.ph
p/515/mod_resource/content/1/proteinas/13_propiedades_de_las_protenas.html
●
● juntadeandalucia.es. Recuperado el 25 de noviembre de 2022, de
https://www.juntadeandalucia.es/averroes/centros-tic/29000694/helvia/aula/archivos/r
epositorio/0/10/html/pproteinas.html#:~:text=La%20especificidad%20se%20refiere%
20a,una%20p%C3%A9rdida%20de%20la%20funci%C3%B3n.

● Aula Virtual de Biología. (s/f). Www.um.es. Recuperado el 25 de noviembre de 2022,

de https://www.um.es/molecula/prot06.html

● Comunicación Sistema UNIVA. (2020, September 9). ¿Exponer la proteína en polvo

al calor genera algún riesgo? - La Piedad. La Piedad.
https://www.univa.mx/la-piedad/2020/09/09/exponer-la-proteina-en-polvo-al-calor-ge
nera-algun-riesgo/#:~:text=Cuando%20la%20prote%C3%ADna%20aumenta%20su,q
u%C3%ADmico%20de%20los%20amino%C3%A1cidos%20constituidos.

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● R
‌ ubén, J., & Mairena, E. (n.d.). Efecto del Etanol sobre las Membranas Biológicas.
http://cidbimena.desastres.hn/RMH/pdf/1993/pdf/Vol61-1-1993-4.pdf

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