DNAPolimerasa Articulo Traducido

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año Rev. Bioquímica. 2005. 74:283–315

doi: 10.1146/annurev.biochem.73.011303.073859
Copyright c 2005 por Annual Reviews. Todos los derechos reservados
REPLICASES DE ADN CELULAR : Componentes

y Dinámica en la Horquilla de Replicación
Aaron Johnson2 y Mike O'Donnell1,2 1Instituto Médico

Howard Hughes, 2Universidad Rockefeller, Ciudad de Nueva
York, Nueva York 10021-6399; correo electrónico:
johnsoa@mail.rockefeller.edu, odonnel@mail.rockefeller.edu
Palabras clave replicación de ADN, abrazaderas deslizantes de ADN, ADN polimerasa, cargador de
abrazadera de procesividad, interacciones proteína-ADN
ÿ Resumen Las replicasas de ADN cromosómico son máquinas de múltiples componentes que han
desarrollado estrategias inteligentes para realizar su función. Aunque la estructura del ADN es elegante en
su simplicidad, el trabajo de duplicarlo está lejos de ser simple. En el corazón de la maquinaria de la
replicasa se encuentra una máquina de carga de pinza heteropentamérica AAA+ que acopla la hidrólisis de
ATP para cargar proteínas de pinza circulares en el ADN. Las abrazaderas rodean el ADN y sujetan las
polimerasas a la plantilla para la acción procesiva. Las estructuras de pinzas de carga y de pinzas deslizantes
se han resuelto tanto en sistemas procarióticos como eucarióticos.
Los cargadores de abrazadera heteropentaméricos son oligómeros circulares, lo que refleja la forma circular
de sus respectivos sustratos de abrazadera. Las abrazaderas y los cargadores de abrazaderas también
funcionan en otros procesos metabólicos del ADN, incluida la reparación, los mecanismos de control y la
progresión del ciclo celular. Las polimerasas gemelas y las abrazaderas coordinan sus acciones con un
cargador de abrazaderas y otras proteínas para formar una máquina replisoma que hace avanzar la horquilla
de replicación.
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ................................................. .... 284
LA REPLICASA DE E. coli ............................................... ... 286
Núcleo Pol III .............................................. .......... 286
La abrazadera deslizante ÿ ............................................... ... 288 El cargador de abrazadera complejo
ÿ .................................. 290 La partículareplisoma
de holoenzima
...............................................
...............................................
... 293293Tráfico
Dinámica
de proteínas
del
en pinzas deslizantes de ADN ...........................
296 295 LA REPLICASA EUCARIOTA ..... ....................................
Antígeno nuclear de células en proliferación ................................ 298 El cargador de pinzas

RFC .. .............................................
replisoma
300 ADN
eucariótico
polimerasas
..... ..........................................
eucarióticas . .......................................
304 Complejos 303
RFC
El
alternativos y otras funciones para cargadores de abrazadera .......... 307
OBSERVACIONES FINALES ............................................. 307
0066-4154/05/0707-0283$20.00 283
284 JOHNSON O'DONNELL
INTRODUCCIÓN
Los ADN cromosómicos son moléculas extremadamente grandes, y el vasto depósito de información
que contienen debe duplicarse con precisión [consulte (1) para obtener una descripción general].
El gran tamaño de estas moléculas puede explicar por qué todas las células utilizan un cargador
de abrazadera para colocar una abrazadera deslizante circular en el ADN que une las polimerasas
de ADN a sus sustratos largos para una síntesis altamente procesiva (consulte la Figura 1). El
antígeno nuclear de células proliferantes eucariotas (PCNA) y las proteínas de abrazadera
procariotas (ÿ) tienen secuencias no relacionadas, pero tienen estructuras sorprendentemente
similares y, por lo tanto, comparten un ancestro común (2, 3). Las abrazaderas deben abrirse y
cerrarse alrededor del ADN, y este trabajo lo realiza una ATPasa multiproteica que carga abrazaderas [revisado e
Figura 1 Componentes de las replicasas celulares. La tabla enumera los tres componentes de
replicasa en los sistemas bien definidos de Escherichia coli, eucariotas, Archaea y fago T4. El
siguiente esquema es un mecanismo generalizado de acción de replicasa. Un cargador de pinza
multiproteico acopla la unión de ATP y la hidrólisis con la carga de una pinza de procesividad en
forma de anillo que luego es utilizada por la polimerasa replicativa como atadura a la plantilla de ADN.
RÉPLICAS CELULARES 285
El factor de replicación C eucariota (RFC) y las subunidades cargadoras de pinzas procariotas

(complejo ÿ) están dispuestas en un círculo y cada una es miembro de la familia de proteínas AAA+
[revisado brevemente en (4)].
Las replicasas de todas las células funcionan dentro de un contexto mayor, involucrando a
muchas otras proteínas. Por ejemplo, dos actividades básicas en una horquilla de replicación
incluyen una helicasa para separar el ADN dúplex y una primasa que produce cebadores de ARN
cortos, que son necesarios para iniciar la síntesis de ADN. Esta maquinaria más grande, a menudo
denominada "replisoma", está bastante bien definida en los procariotas (1, 5–8). En E. coli, y
presumiblemente en otras bacterias, las polimerasas de cadena principal y rezagada están
conectadas al cargador de abrazadera, que también se une a una helicasa homohexamérica (DnaB
en E. coli). La helicasa actúa sobre la hebra rezagada y activa la RNA primasa (DnaG en E. coli).
La replicasa también establece una conexión funcional específica con la proteína de unión al ADN
monocatenario (SSB), que está presente en la bifurcación para proteger el ADN monocatenario
(ssDNA) y derretir las horquillas.
El replisoma eucariótico, por el contrario, involucra muchas más proteínas y está menos definido
en el momento actual [revisado en (9–11)]. La helicasa, la primasa y la SSB eucariotas son todos
heterooligómeros. Se cree que la helicasa es el complejo heterohexam érico MCM (12), y la
primasa es la ADN polimerasa ÿ/primasa de cuatro subunidades que produce un cebador híbrido
de ARN/ADN (13). La proteína A de replicación heterotrimérica (RPA) funciona como SSB (14). Se
cree que varias proteínas eucariotas adicionales sin homólogos procariotas también actúan durante
el inicio de la replicación y la progresión de la horquilla (p. ej., Cdc45, complejo GINS, Dpb11, Sld2
y Sld3) (15–17). Actualmente se desconocen las funciones de la mayoría de estos componentes.
Además, se cree que las polimerasas de cadena principal y cadena retrasada son enzimas
diferentes, Pol ÿ (3 a 4 subunidades) y Pol ÿ (4 subunidades). Todavía no está claro sobre qué
hebras actúan estas polimerasas. Finalmente, muchas de estas proteínas están reguladas por
modificación postraduccional, incluida la abrazadera PCNA que se ubiquitina y sumoila (18–20).
Los cargadores de abrazadera y abrazadera de replicasas celulares, tanto procariotas como

eucariotas, también funcionan en varios otros procesos además de la replicación. Por ejemplo,
PCNA y ÿ se unen a la ligasa de ADN, así como a las proteínas reparadoras de desajustes y por
escisión, aunque el papel exacto de estas interacciones aún no está del todo claro (21–23).
Una secuencia de consenso débil para proteínas que se unen a PCNA revela una amplia gama de
proteínas adicionales que se unen a esta abrazadera y generalmente están involucradas en la
reparación, la estructura de la cromatina o el control del ciclo celular (21). Las abrazaderas también
funcionan con otras ADN polimerasas (23, 24), lo que probablemente ayude a dirigirlas a los sitios
donde se requiere su acción. Los eucariotas incluso utilizan cargadores de abrazadera RFC
alternativos en los que una subunidad se reemplaza por una proteína única que presumiblemente
especializa el complejo para la función alternativa (25–27, 234–243). Estos cargadores de
abrazadera alternativos cargan abrazaderas PCNA en sitios de destino específicos o, en un caso,
cargan una abrazadera similar a PCNA.
Debido a las limitaciones de espacio, esta revisión se centra en las replicasas procariotas y
eucariotas y omite una descripción de las replicasas arqueobacterianas, bacteriófagas y virales.
Sin embargo, las arqueobacterias también utilizan una abrazadera y un cargador de abrazadera similares.
estrategia, al igual que el bacteriófago T4 (ver la tabla en la Figura 1) [revisado en (7, 28),
respectivamente]. Lamentamos que las limitaciones de espacio impidan la discusión del replisoma
del fago T4 de manera similar; es un sistema enormemente valioso del que surgieron muchos
conceptos iniciales básicos de la acción de los replisomas, y continúa brindando nuevos
conocimientos. Una revisión reciente de esta serie (7) destila de manera experta las contribuciones
de T4 hasta la fecha y cómo se relacionan con el sistema E. coli . Las polimerasas replicativas de
la mayoría de los bacteriófagos y virus no utilizan un cargador de abrazadera y abrazadera, pero
estas polimerasas generalmente requieren uno o dos factores accesorios que confieren
procesividad [consulte el fago T7 (7, 29, 30), el virus vaccinia (31, 32) virus del herpes (33, 34) y
Pol ÿ (35)]. Los autores también se han abstenido de discutir el inicio de la replicación del ADN
debido a la limitación de espacio. Existen muchas revisiones útiles sobre este tema [ver (1, 28,
36, 37)].
LA REPLICASA DE E. coli
La primera replicasa celular que se estudió, la holoenzima de ADN polimerasa III de E. coli , se
aisló como una partícula intacta de extractos de E. coli a principios de la década de 1980, y su
estructura y función sirven como un paradigma adecuado para su contraparte eucariota (1). Por
lo tanto, comenzamos esta revisión con la maquinaria de replicasa procariótica.
Núcleo Pol III
La ADN polimerasa III (Pol III) se identificó originalmente en una cepa mutante de E. coli, polA-
(38). Esta cepa carecía de la actividad de ADN polimerasa I comparativamente fuerte, lo que
desenmascaraba la polimerasa replicativa. La identidad de esta actividad era probablemente el
subcomplejo central de la polimerasa. La actividad específica del núcleo de Pol III es similar a la
de Pol I, pero como se describirá a continuación, el núcleo de Pol III funciona con proteínas
accesorias que lo convierten en una enzima extremadamente eficiente que tiene la actividad
específica más alta de cualquier ADN polimerasa de E. coli (1) .
El núcleo Pol III es un heterotrímero 1:1:1 de la polimerasa ÿ, la exonucleasa correctora ÿ 3
-5 y las subunidades ÿ (39, 40) (ver Tabla 1). La subunidad ÿ (codificada por dnaE) contiene la
actividad de la ADN polimerasa, incorporando 8 nucleótidos/segundo (ntd/s), similar al núcleo Pol
III (20 ntd/s) (41). La subunidad ÿ (dnaQ) es la exonucleasa correctora 3-5. Es interesante notar
que sin ÿ, la procesividad de la holoenzima se reduce notablemente de >50 kb a alrededor de 1,5
kb (42), lo que garantiza que la subunidad ÿ correctora esté presente durante la duplicación del
genoma. Por el contrario, la subunidad ÿ pequeña (holE) no tiene ninguna función conocida
además de una ligera estimulación de ÿ (43) y el gen holE puede eliminarse con pocas
consecuencias (44).
Hay poca información estructural disponible para el núcleo Pol III. La subunidad ÿ es un
miembro de la familia C de ADN polimerasas (45). Los miembros de esta familia están presentes
solo en las bacterias y sigue siendo la única familia importante para la que no se ha resuelto la
estructura cristalina. Se puede suponer que contendrá los dominios característicos de la palma,
el pulgar y los dedos y el mecanismo de catálisis de dos metales presente
TABLA 1 Componentes del replisoma de Escherichia coli y funciones asociadasa
en todas las demás polimerasas (46). La mutagénesis por deleción sugiere que el sitio activo
está ubicado en los dos tercios N-terminales de ÿ, mientras que los contactos con otros
componentes de la holoenzima se realizan a través de la región C-terminal (47, 48).
Las estructuras de resolución atómica de porciones de ÿ y ÿ están disponibles (49–51). La
subunidad ÿ está compuesta por dos dominios (52). El dominio N-terminal (186 residuos
de 243) contiene el sitio activo de exonucleasa y el sitio de unión ÿ. La estructura cristalina de

este fragmento activo ha sido resuelta (49), y es estructuralmente similar a otras exonucleasas
asociadas a polimerasa y al dominio de exonucleasa de la ADN polimerasa I. El sustrato de ADN
preferido para ÿ es un extremo 3 de cadena sencilla y un El extremo 3 empotrado con pares de
bases completos es un sustrato deficiente para ÿ solo (53, 54).
Sin embargo, ÿ se asocia estrechamente con el extremo C terminal de ÿ y estimula la actividad
de ÿ en un extremo 3 empotrado, probablemente al llevar ÿ al sitio del cebador. ÿ degrada
preferentemente un cebador/plantilla con un terminal 3 empotrado no coincidente. Además, la
polimerización ÿ se inhibe por un desajuste, lo que proporciona ÿ más tiempo para completar la
escisión.
La estructura de ÿ se parece a un dominio de interacción con el ADN de la ADN polimerasa
eucariótica ÿ (50, 51). Esta similitud estructural puede ser la base de la ligera estimulación de ÿ
por ÿ y el aumento del fenotipo mutador de un mutante sin holE en un fondo mutante ÿ (44).
La abrazadera deslizante ÿ
El núcleo Pol III por sí mismo es lento, incorpora 20 ntd/s, y es débilmente procesable,
extendiéndose solo de 1 a 10 bases por evento de enlace (41). De hecho, no importa cuánto
tiempo o enzima esté disponible, el núcleo Pol III no puede extender un ciclo completo de cebador
único alrededor de un genoma de ssDNA M13 (55, 56).
Para convertirse en una replicasa eficiente, la polimerasa central requiere la abrazadera ÿ.
Acoplado a ÿ, el núcleo se vuelve extremadamente rápido (ÿ750 ntd/s) y procesivo (>50 kb).
Los estudios bioquímicos revelaron inicialmente que ÿ se une al ADN topológicamente (57), lo
que implica que tiene forma de anillo y rodea el dúplex, por lo que se desliza libremente a lo largo
de él. Esta hipótesis fue rápidamente probada por análisis de estructura (3) (Figura 2). La
polimerasa central se asocia directamente con ÿ (57–59), ocupando inicialmente alrededor de 22
pares de bases (pb) del cebador (60, 61). A medida que el núcleo extiende el ADN, tira de la
abrazadera ÿ detrás de él.
La estructura cristalina del dímero ÿ (3) muestra que los dos protómeros en forma de media
ÿ
luna forman un anillo con un gran canal central de ~35 A de diámetro que fácilmente
puede acomodar
ADN de
doble cadena (ds) modelado en el interior (Figura 2a,b ).
De hecho, existe espacio para una o dos capas de agua entre el ADN y ÿ, lo que sugiere que ÿ
puede “patinar sobre hielo” a lo largo del dúplex. El centro del anillo ÿ está revestido con 12
hélices ÿ, cuyos pares están sostenidos por una lámina ÿ externa. Este par de hélices y el motivo
de la hoja forman un dominio globular, que se repite seis veces alrededor del anillo, creando una
pseudosimetría séxtuple. Cada monómero ÿ consta de tres dominios y se dimeriza de cabeza a
cola con otro para producir dos "caras" estructuralmente distintas.
Una cara tiene varios bucles y extremos en C que sobresalen. Esta es la cara del anillo que
interactúa con otras proteínas como se analiza a continuación (62, 63).
La abrazadera ÿ es un dímero compacto y su vida media en el ADN es de más de 1 hora a 37
°C (64, 65). La subunidad ÿ del complejo ÿ puede abrir ÿ por sí misma, según lo determine su
capacidad para eliminar rápidamente la abrazadera ÿ del ADN (64, 66). Parece que solo un ÿ se
une a ÿ2 y no disocia el dímero ÿ en monómeros, aunque
Figura 2 Estructura y dinámica de la abrazadera deslizante ÿ. (a,b) Estructura cristalina del

dímero ÿ con ADN bicatenario modelado a través del canal central (cortesía de D. Jeruzalmi y J.
Kuriyan). El panel (b) resalta las dos "caras" del anillo. La cara C-terminal (derecha) está
implicada en muchas de las interacciones de ÿ con otras proteínas. (c) Superposición de una
subunidad ÿ de la estructura del dímero ÿ (púrpura) y el monómero ÿ de la estructura cristalina
ÿ1ÿ1 (amarillo), utilizando el dominio II como referencia. (d ) Modelo de una abrazadera ÿ abierta
hecha mediante la disposición de dos estructuras de monómero ÿ de ÿ1ÿ1 para crear una
interfaz de dímero [descrita en (67)]. Paneles (c) y (d ) adaptados de (67), copyright 2001, con permiso de E
debe desestabilizar una interfaz (62, 65, 66). Esta idea es consistente con la capacidad
del complejo ÿ para cargar ÿ que está reticulado a través de una interfaz de dímero (66).
Se ha resuelto una estructura cocristalina de ÿ unida a un mutante monomérico de ÿ (67).
Esta estructura muestra dos puntos distintos de contacto entre ÿ y ÿ. Los puntos de
contacto están ubicados en los extremos opuestos de la misma hélice ÿ, que se encuentra en el
Dominio N-terminal de ÿ. Un extremo de la hélice se une a un bolsillo hidrofóbico entre los dominios II
y III de ÿ. El otro extremo parece empujar un bucle en la interfaz del dímero, lo que lleva a una interfaz
distorsionada que ya no puede cerrarse. Se propone que ÿ agarra a ÿ a través del bolsillo hidrofóbico
y empuja el bucle para romper la interfaz o mantener abierta la interfaz. El análisis mutacional de
estos puntos de contacto ha confirmado su papel en la interacción pinza-cargador y la apertura de la
pinza (68).
La estructura ÿ-ÿ explica cómo se agrieta la interfaz, pero no cómo se abre el anillo para acomodar
el ADN en el canal central. La comparación del dímero ÿ y el monómero ÿ (de la estructura ÿ-ÿ)
muestra movimientos de cuerpo rígido significativos entre los dominios, lo que lleva a una forma de
media luna menos profunda en el monómero (67) (consulte la Figura 2c). Esto implica que el anillo ÿ
está bajo tensión de resorte en el estado cerrado hasta que ÿ interrumpe una interfaz, lo que permite
que la tensión entre los dominios se relaje y produzca un espacio para el paso de la cadena de ADN
(consulte la Figura 2d). Las fuertes interacciones en las interfaces de los dímeros probablemente
mantienen esta tensión.
El cargador de pinza complejo ÿ

El cargador de pinzas de E. coli es un complejo compuesto por cinco subunidades diferentes en una
estequiometría definida: ÿ 3ÿ1ÿ 1ÿ1ÿ1 (69, 70). El complejo ÿ aprovecha la energía de la unión de
ATP y la hidrólisis para vincular topológicamente ÿ a un ADN cebado, luego se expulsa del ADN,
dejando atrás la abrazadera cerrada (57, 66, 71). Es conveniente diseccionar el cargador de pinzas
por la función principal de cada subunidad (4). Las tres subunidades ÿ son las únicas subunidades
que se unen al ATP (72, 73) y, por lo tanto, se han denominado el "motor" del complejo. La subunidad
ÿ se denomina "llave inglesa" porque es la subunidad principal que interactúa con la abrazadera ÿ y
puede abrir la interfaz del dímero por sí misma.
La subunidad ÿ modula el contacto ÿ-ÿ (66). ÿ parece ser una proteína rígida (74).
A diferencia de ÿ y ÿ, los dominios de ÿ tienen más interacciones intramoleculares y asumen la misma
orientación en la estructura ÿ y ÿ dentro de ÿ 3ÿÿ. Esta característica le ha
valido a ÿ el término "estator", la parte estacionaria de una máquina sobre la cual se mueven otras partes.
En contraste, los tres dominios de ÿ asumen diferentes orientaciones en el trímero ÿ.
Los dominios de ÿ también asumen diferentes orientaciones en ÿ-ÿ en comparación con ÿ 3ÿÿ.
El complejo ÿ 3ÿ1ÿ 1 se denomina cargador de abrazadera “mínimo”, ya que es suficiente para
colocar ÿ en una plantilla de ADN (75). Las subunidades ÿ y ÿ no son esenciales para el mecanismo
de carga de abrazadera (76), pero ÿ vincula el cargador de abrazadera con SSB y primasa (77, 78),
que se analizarán a continuación. ÿ sirve como conector para ÿ (76) y también fortalece el complejo ÿ
3ÿÿ (79).
A partir de estudios bioquímicos (4, 66), se ha determinado un esquema general del mecanismo
de carga de la abrazadera. El cargador de pinzas sin nucleótidos tiene una baja afinidad por la pinza
(62). La subunidad ÿ, que se une fuertemente a ÿ, es probablemente secuestrada por las otras
subunidades sin presencia de ATP. Tras la unión de ATP, el complejo ÿ experimenta un cambio
conformacional (62, 71) que permite una unión fuerte a la abrazadera, con lo cual ÿ abre una interfaz
de dímero de la abrazadera (65). El complejo pinza-cargador tiene una gran afinidad por el ADN, en
particular por una plantilla cebada (71, 80).
El ADN, presumiblemente enhebrado a través de la abrazadera, estimula la actividad ATPasa en
complejo ÿ, y esto permite que el anillo se cierre alrededor del ADN y el cargador de pinzas
se expulse, reciclándolo así para rondas repetidas de carga de pinzas (66, 81). La hidrólisis
de ATP deja el cargador de pinzas en un estado de unión al ADN de baja afinidad,
presumiblemente hasta que el ADP se disocia y el complejo ÿ puede recargarse con
nucleótidos trifosfato (80, 82–84).
La estructura cristalina del complejo ÿ 3ÿÿ proporcionó una visión más profunda de la
acción del cargador de abrazadera (70). Este logro fue seguido dos años más tarde por la
estructura cristalina del cargador de mordaza eucariótico unido a su mordaza (85), que ha
completado muchos detalles que se discutirán más adelante. Las cinco subunidades de E.
coli ÿ 3ÿÿ están dispuestas de forma circular (70) (Figura 3b). Las tres subunidades ÿ son
adyacentes entre sí, flanqueadas por un lado por ÿ y por el otro por, ÿentre
que asísu
para
vezcompletar
interactúan
el anillo. Cada subunidad consta de tres dominios, y la oligomerización está mediada
principalmente por el dominio C-terminal III (Figura 3a,b).
Los dominios N-terminal I y II de las cinco subunidades adoptan el pliegue de la cadena de
la familia AAA+ (ATPasas asociadas con una variedad de actividades celulares) (Figura 3a)
[revisado en (86, 87)]. Aunque solo ÿ se une al ATP (72), ÿ tiene elementos conservados de
la familia AAA+ (88). Por el contrario, la secuencia ÿ ha divergido, lo que hace sorprendente
el descubrimiento de su pliegue AAA+.
Los sitios ATP del complejo ÿ están ubicados en las interfases de las subunidades y se
complementan con residuos de la subunidad adyacente (ver Figura 3c). La ubicación
interfacial de los sitios ATP es típica de los oligómeros AAA+ y se supone que promueve la
comunicación entre las subunidades. ÿ contribuye con una arginina clave al Sitio 1 de ATP
del complejo ÿ, como se ve en el panel izquierdo de la Figura 3c (residuo rojo) con una
molécula de ATP modelada a lo largo del bucle de unión a fosfato (azul). Esta arginina se
encuentra en un motivo conservado de serina-arginina-cisteína (SRC) que está presente en
todos los cargadores de abrazadera conocidos. La mutación de ÿ Arg y el residuo homólogo
en ÿ provoca un defecto grave en la actividad de la ATPasa y la carga de sujeción y también
interrumpe la interacción con el ADN (mutantes ÿ) o ÿ (mutantes ÿ) (89, 90). La mutación del
bucle P de ÿ tiene consecuencias más graves que dan como resultado la pérdida completa de actividad (
Estas observaciones resaltan la coordinación del ciclo ATP con el mecanismo de carga de
abrazadera, lo que sugiere la regulación de la unión del sustrato mediante cambios
conformacionales en distintos sitios ATP durante la unión e hidrólisis de nucleótidos.
Los extremos C (dominios III) de las cinco subunidades del complejo ÿ mínimo forman un
anillo apretado o collar (91), pero los dominios AAA+ N-terminales (I y II) están asociados de
forma más laxa, con una falta total de contacto entre ÿ y ÿ en estos dominios, creando una
brecha en la porción N-terminal del anillo (70) (Figura 3b). Esta brecha puede funcionar para
permitir que el ADN pase a ÿ posicionado debajo del complejo de abrazadera-cargador,
como se analiza en la sección RFC de esta revisión. Tanto la unión ATP como la abrazadera
ÿ se producen en estos dominios N-terminales (67, 92). Las conexiones sueltas de estos
dominios han llevado a sugerir que alguna libertad conformacional de los extremos N es
esencial para la función (93). La estructura de ÿ 3ÿÿ carece de ATP y, por lo tanto, se
encuentra en estado inactivo. De acuerdo con esto, un dímero ÿ no puede acoplarse al
complejo ÿ (reemplazando ÿ con ÿ-ÿ) sin choques significativos, incluso con la brecha
sustancial entre ÿ y ÿ (70). Los experimentos biofísicos en solución indican que la distancia entre
Figura 3 Estructura cristalina del complejo E. coli ÿ 3ÿ1ÿ 1 . (a) Subunidades aisladas de la
estructura del complejo, dominios I–III señalados [adaptado de (87), copyright 2002 Nature
Publishing Group (http://www.nature.com)]. (b) Vista lateral de ÿ 3ÿÿ (izquierda). La hélice
de interacción ÿ de ÿ está marcada en amarillo. Vista desde los términos C de ÿ 3ÿÿ
(derecha) [adaptado de (70), copyright 2001, con permiso de Elsevier]. (c) Los sitios ATP
del complejo ÿ en forma de anillo están ubicados en las interfaces de las subunidades, como
se ilustra en la caricatura (derecha) y se toman de la estructura del Sitio ATP 1 (izquierda)
, conservado
con ATP (púrpura) modelado contra el bucle P (azul). El motivo Ser-Arg-Cys (SRC) de ÿ
en todos los cargadores de abrazadera, apunta su arginina (rojo ) hacia el fosfato ÿ de ATP
[adaptado con permiso de (89)].
ÿ y ÿ no cambian drásticamente durante la asociación de sujeción (93). Por lo tanto, puede

ocurrir algún otro cambio conformacional que no requiera aumentar la brecha entre ÿ y ÿ,
. Pordeejemplo,
exponiendo así el elemento unión aÿÿpuede
de ÿ sin cambiar la
empujarse distancia
hacia abajoentre con ÿ , la
ÿ y ÿ. Además,
en relación
subunidad ÿ también se une a ÿ (94). Tomadas en conjunto, estas observaciones implican que
se. forma
forma una extensa
en que superficie
el cargador de interacción
de abrazadera se entre
une alalamordaza y elycargador
abrazadera deilustra
al ADN se mordaza. La
mediante la estructura RFC-PCNA que se analiza más adelante en esta revisión.
La partícula de holoenzima
Sobre la base de las concentraciones de subunidades intracelulares de Pol III, una parte del
cargador de abrazadera se asocia con la holoenzima Pol III, pero la mayoría del cargador de
abrazadera está libre en solución (64, 95). El cargador de abrazadera asociado con la
holoenzima contiene una forma diferente del gen dnaX . La subunidad ÿ se produce a través
de un cambio de marco ribosómico en el gen dnaX, que provoca la terminación casi inmediata
de la traducción para producir una proteína de 47,5 kDa (96, 97). El producto completo de
dnaX es la subunidad ÿ (71,1 kDa), que contiene la secuencia ÿ más una región C-terminal
única de 23,6 kDa (ÿ c) (Figura 4a). El ÿ de 23,6 kDa se compone de dos
C se
dominios,
unen al núcleo
IV y V, que
DnaB y Pol III (a través de ÿ), respectivamente (98, 99). La región ÿc no se requiere para la
carga de abrazadera, pero es
a su capacidad esencial
para paraellareplisoma,
organizar viabilidad como
celularse(100), probablemente
analiza debido
a continuación.
La proteína DnaX está presente en tres copias en el complejo pinza-cargador y, por lo

tanto, varias especies pueden ensamblarse en estequiometrías de ÿ 3, ÿ 2ÿ 1, ÿ 1ÿ 2 y Cada
ÿ 3 (69).
terminal ÿ C reclutará una polimerasa y, por lo tanto, cuanto más ÿ presente en el cargador de
abrazadera, más moléculas de polimerasa del núcleo puede unir.
Se requieren al menos dos polimerasas para la síntesis concurrente de hebras principales y
rezagadas (Figura 4b). Debido a este requisito, se cree que la replicasa de E. coli contiene dos
núcleos Pol III unidos a un cargador de abrazadera ÿ 2ÿ 1ÿÿ ÿÿ y que un orden específico de
ensamblaje conduce a esta partícula (69, 101, 102), que se denomina Pol IIIÿ (o estrella Pol
III). La abrazadera ÿ se asocia con Pol IIIÿ de manera dependiente de ATP para formar la
holoenzima Pol III. Las subunidades de una sola copia del cargador de abrazadera definen
una asimetría inherente y, por lo tanto, por definición, los dos núcleos conectados a las dos
subunidades ÿ se encuentran en entornos algo diferentes (8). La consecuencia de esta
estructura asimétrica podría ser mínima porque un segmento rico en prolina de ÿ separa los
dominios de interacción del cargador de abrazadera y la polimerasa, lo que sugiere una
conexión flexible. Sin embargo, DnaB u otras subunidades de holoenzimas pueden mantener
los núcleos en posiciones asimétricas definidas (103). Se ha propuesto que la estructura
asimétrica impone distintas propiedades a las dos polimerasas, modelando su comportamiento
para adaptarse a las diferentes necesidades de replicación de las hebras principal y rezagada
(8, 102, 104–109).
Dinámica replisoma
Las subunidades ÿ de la holoenzima Pol III no solo conectan dos polimerasas centrales al
cargador de abrazadera central, sino que también conectan la replicasa a la helicasa DnaB.
Figura 4 Organización y dinámica del replisoma de E. coli . (a) La subunidad ÿ de la holoenzima de la

ADN polimerasa III está compuesta por los dominios del cargador de abrazadera I–III (secuencia ÿ) y los
dominios de organización del replisoma IV y V que se unen a la helicasa DnaB y al núcleo Pol III,
respectivamente. ( b ) Ciclo de polimerasa en la horquilla de replicación. A medida que avanza el
replisoma, el cargador de abrazaderas carga una abrazadera ÿ en un cebador de ARN (rosa) sintetizado
por DnaG (arriba a la derecha). Cuando la polimerasa de hebra rezagada se replica en una muesca, se
disocia del ADN y ÿ (abajo a la derecha) y pasa a la abrazadera ÿ recién cargada (abajo a la izquierda).
(ver Figura 4b). El DnaB homohexamérico rodea la hebra rezagada, y cuando su tasa de desenrollado
, aumenta
través de ÿ hasta casi la velocidad de la holoenzima (98, de
99,ÿ35
103,pb/s
110–112).
acoplado a la síntesis de ADN a
A medida que avanza el replisoma, la polimerasa de la cadena principal simplemente extiende el

ADN de forma continua. Los presuntos impedimentos para la extensión de la cadena principal incluyen
sitios de daño en el ADN y el consiguiente colapso de la horquilla. La reparación y reinicio de la
síntesis es un proceso elaborado detallado en revisiones recientes (113, 114). Se ha implicado a la
holoenzima Pol III en la mediación del reinicio de la replicación del ADN después del estancamiento
de la horquilla (115).
La replicación de la hebra rezagada es un proceso discontinuo de ajustes y arranques que se
repite en un tiempo de ciclo de 1 a 3 s. En la Figura 4b se ilustra una descripción general del ciclo de
cadena rezagada . Cada fragmento de Okazaki es iniciado por primasa, que sintetiza un cebador de
ARN de alrededor de 10 a 12 nucleótidos (116, 117). La acción de la primasa requiere interacción
con DnaB, que involucra una región C-terminal de primasa (118, 119).
La primasa extiende el ARN en la dirección opuesta al desenrollamiento de la helicasa y se supone
que se separa de DnaB, lo que puede explicar su acción distributiva observada (120). La primasa
permanece unida al sitio cebado de ARN a través de su interacción con SSB (121–123). Aunque la
primasa eventualmente se disocia, la liberación de primasa es acelerada por la subunidad ÿ del
cargador de abrazadera, que se une a SSB de manera competitiva, reclutando al cargador de
abrazadera a la plantilla de ADN para competir con primasa (124). El cargador de pinzas luego coloca
ÿ en el cebador para la polimerasa de hebra retrasada.
A medida que la polimerasa rezagada extiende un fragmento, se genera un bucle porque está
conectado a la polimerasa líder (a través del cargador de pinzas), pero extiende el ADN en la dirección
opuesta (ver el diagrama superior izquierdo), como se propuso originalmente (125) y se confirmó
recientemente. (126) en el sistema T4. El fragmento de Okazaki de 1 a 3 kb se completará en unos
pocos segundos (Figura 4b, diagrama superior derecho) y, en este punto, el núcleo debe liberarse
rápidamente del ADN para comenzar el siguiente fragmento (diagrama inferior derecho). La Pol III
altamente procesiva requiere un mecanismo específico para este paso de liberación, que separa el
núcleo de ÿ, dejando la abrazadera ÿ en el fragmento terminado. El paso de liberación ocurre solo en
una muesca, lo que garantiza la finalización del fragmento y requiere la subunidad ÿ (127–130). El
núcleo de la hebra retrasada ahora está libre para unirse a una nueva abrazadera ÿ colocada en el
siguiente cebador de ARN por el cargador de abrazaderas (diagrama inferior izquierdo).
La progresión de la horquilla de replicación se ha estudiado en E. coli, utilizando plantillas de ADN

de círculo rodante (103, 107, 116, 120, 131–133). Con este sistema se ha demostrado que las
abrazaderas ÿ se acumulan en la hebra retrasada y que el cargador de abrazadera única puede
cargar rápidamente abrazaderas en el ADN repetidamente durante la progresión de la horquilla (103).
Las abrazaderas ÿ acumuladas pueden reciclarse mediante la acción de descarga del complejo ÿ y
también por el exceso de cinco veces de la subunidad ÿ libre en la célula de E. coli (64).
Tráfico de proteínas en abrazaderas deslizantes de ADN
Muchas proteínas diferentes funcionan con abrazaderas deslizantes. Ahora está surgiendo una
comprensión de la forma en que las proteínas coordinan su flujo de tráfico en las abrazaderas. Para ilustrar
cómo las proteínas pueden cambiar de posición para utilizar la abrazadera, describimos brevemente tres
cambios importantes en ÿ que ocurren durante la progresión de la replicación de E. coli
tenedor.
Se sabe que el cargador de abrazadera ÿ/ÿ y el núcleo Pol III unen la misma cara de ÿ en
esencialmente el mismo lugar, y por lo tanto estos dos factores compiten por la abrazadera
(63, 134). Sin embargo, tanto el núcleo como el complejo ÿ/ÿ deben funcionar con ÿ al comienzo de
cada cadena de ADN. Este evento de tráfico de proteínas se ve facilitado por el hecho de que ATP
la hidrólisis expulsa el cargador de pinzas de ÿ (Figura 5a) (71). Además, la abrazadera
cargador permanece en un estado de actividad reducida durante un breve intervalo, presumiblemente debido a
liberación lenta de ADP (80, 83). El núcleo de la polimerasa es entonces libre para unirse a la abandonada
abrazadera ÿ y, de hecho, se une más fuerte en el ADN que fuera (63).
También se cree que el encendido de ÿ ocurre cuando la polimerasa líder se detiene.
En este caso, se cree que una polimerasa de derivación, ya sea Pol IV o Pol V, toma
posesión de la abrazadera para extender el ADN a través del sitio de pérdida. estructural reciente
el análisis sugiere que Pol IV puede asociarse de dos maneras con ÿ (135, 136). Pol IV
une el borde del anillo ÿ y un bolsillo hidrofóbico, pero Pol IV está angulado
del ADN (135). Es posible que en este modo de unión Pol IV pueda unirse a
ÿ simultáneamente con Pol III (ver Figura 5b). Al detenerse Pol III, Pol IV
debe romper su interacción con el lado del anillo ÿ y oscilar hacia el ADN,
presumiblemente manteniendo su control sobre el bolsillo hidrofóbico de ÿ. Esta acción
desplazaría a Pol III del ADN y tal vez interrumpa el contacto Pol III-ÿ como
bien. Pol IV es distributivo, incluso con ÿ, lo que permite que Pol III recupere la abrazadera
después de que se pasa por alto la lesión. La evidencia reciente con Pol III, Pol V y ÿ sugiere
que puede ocurrir una compensación similar (137). Al final de un fragmento de Okazaki, el
Pol III, normalmente altamente procesable, se disocia rápidamente de ÿ (127–130), liberando
la polimerasa para extender el siguiente fragmento de Okazaki. Este evento de tráfico ÿ es
mediada por la porción ÿ c de ÿ . La subunidad ÿ se une a ÿ a través del extremo ÿ C-terminal
residuos (134). ÿ también
C se une al extremo ÿ C e interrumpe la interacción núcleo-ÿ.
Sin embargo, C se une a ssDNA, y esto evita que ÿ se una a los residuos C-terminales
ÿ de ÿ. Por lo tanto, siempre que haya una plantilla de ssDNA, ÿ funciona C está apagado y el núcleo
con ÿ. Pero cuando todo el ssDNA disponible se convierte en dúplex, ÿ se “activa” y separa el núcleo C
vueltas
de ÿ (consulte la Figura 5c). Estos procesos de conmutación explican cómo

las interacciones con la abrazadera son moduladas por ATP o estructura de ADN para promover
el tráfico de diferentes proteínas en abrazaderas deslizantes para asegurar la progresión de
replicación.
LA RÉPLICA EUCARIOTA
Aunque la complejidad de la arquitectura, la interacción y la regulación de la replicación del ADN es mucho

mayor en los eucariotas que en las bacterias, los componentes centrales de la replicasa
son estructural y funcionalmente más similares que diferentes. Sin embargo, más allá de esto
maquinaria básica se encuentra una red mucho más grande de proteínas necesarias para la propagación
de la horquilla de replicación y la regulación de su avance, así como la coordinación de su
Figura 5 Tres ejemplos de tráfico de proteínas en abrazaderas deslizantes. Las interacciones con la
abrazadera ÿ de E. coli. (a) El cargador de abrazadera del complejo ÿ se asocia estrechamente con ÿ
cuando se une a ATP. El ADN desencadena la hidrólisis de ATP, lo que da como resultado una baja
afinidad por ÿ y ADN. (b) Cuando Pol III, la polimerasa replicativa, encuentra una lesión en la plantilla
de ADN, se detiene, incapaz de superar su fidelidad inherente para incorporarse frente a una base dañada.
El estancamiento permite que una polimerasa propensa a errores, como Pol IV (rojo ), viaje
pasivamente en ÿ, una oportunidad de intercambiar lugares con Pol III en ÿ para replicarse más allá
de la lesión. [Adaptado con permiso de (135).] (c) Pol III mantiene un estrecho control sobre ÿ a través
del extremo de la polimerasa C. Sin embargo, cuando replica completamente su sustrato de ADN, la
polimerasa debe liberarse de ÿ para reciclarse al siguiente sitio cebado. La subunidad ÿ modula esta
interacción, uniéndose a la cola de la polimerasa C solo cuando no hay más molde monocatenario
presente. Esto corta la conexión entre la polimerasa y la abrazadera [adaptado con permiso de (134),
copyright 2003, Academia Nacional de Ciencias, EE. UU.].
actividad con otras maquinarias metabólicas del ADN. Muchos de estos detalles recién ahora
se están enfocando.
Antígeno nuclear de células en proliferación
PCNA deriva su nombre del hallazgo inicial de que la proteína es abundante en las células
en proliferación (138). Se demostró que PCNA está directamente involucrado en la replicación
del ADN a través de su capacidad para estimular la ADN polimerasa ÿ en la replicación de
tramos largos de ADN cebado (139–141). Esta característica sugirió que puede ser análoga a
la subunidad ÿ de E. coli , aunque en ese momento tampoco se sabía que fueran pinzas deslizantes.
El trabajo posterior mostró la importancia de PCNA para el virus simio 40 (SV40)
La replicación del ADN y su actividad mejorada en presencia de RFC y ATP (142).
Como unidad monomérica, PCNA tiene aproximadamente dos tercios del tamaño de ÿ y, en
consecuencia, cada protómero contiene dos dominios estructuralmente similares en lugar de los tres
dominios que se encuentran en ÿ (2). Los pliegues de la cadena de los dos dominios PCNA son los
mismos que los que se encuentran en los dominios de ÿ. PCNA y ÿ forman estructuras en forma de
anillo muy similares, excepto que PCNA debe trimerizarse para formar un anillo de seis dominios (Figura 6a).
Al igual que ÿ, el anillo PCNA se une de forma bastante estable al ADN (t1/2 = 24 min) (143).
Los protómeros de PCNA también están dispuestos de cabeza a cola para crear dos "caras"
distintas del anillo, reflejando ÿ. Como en el sistema de E. coli , el cargador de pinzas
eucariótico y la polimerasa compiten por unirse a la misma cara del anillo PCNA, la cara desde
la que se proyectan los extremos C (144, 145).
Una variedad de proteínas involucradas en la reparación del ADN y el control del ciclo
celular interactúan con PCNA, pero este tema se trata en otro lugar [revisado en (21, 23)].
Relevante para la revisión actual, ha surgido una secuencia de consenso débil de unión a
PCNA: QxxhXXaa, donde x = cualquier residuo; h = L,I,M; ya = F,Y (21, 23). La estructura
cristalina del PCNA humano en complejo con un péptido derivado del regulador del ciclo
celular p21WAF1/Cip1 fue la primera en demostrar que estos mecanismos de unión a abrazaderas
Figura 6 Estructuras de la pinza eucariótica y el cargador de pinzas de Saccharomyces

cerevisiae. ( a ) Vista de la cara C-terminal de PCNA. El PCNA en forma de anillo es un
trímero de cabeza a cola de un monómero de dos dominios. La pseudosimetría séxtuple de
la abrazadera ÿ también es evidente en PCNA. (b) La estructura del factor de replicación C
(RFC) unido a PCNA revela la similitud estructural entre RFC y el complejo ÿ. RFC se une a
la cara C-terminal de PCNA. ( c – e ) Las subunidades RFC están dispuestas en una hélice
que rastrea el surco menor del ADN en forma B modelado a través del anillo PCNA. (d ) En
esta caricatura, el extremo 5 de una plantilla de cebador empotrada se coloca para salir del
canal central de la abrazadera y el cargador de abrazadera a través del espacio entre RFC1
y RFC5. ( e ) Regiones N-terminales de las cinco subunidades RFC y el anillo PCNA de la estructura RFC-P
Dos hélices conservadas en cada subunidad RFC (amarillo) están en posición de interactuar
con el ADN (naranja/ verde) que pasa a través del canal central de PCNA (gris) con los 5
terminales (esferas verdes) saliendo entre RFC1 y RFC5. [Adaptado con permiso de (85),
copyright 2004 Nature Publishing Group (http://www.nature.com).]

las proteínas interactúan con PCNA en un bolsillo hidrofóbico ubicado entre los dos dominios de
un protómero (146). El hallazgo se generaliza a la posición en la que la ADN polimerasa se une
a la pinza T4 gp45 (147-149). Además, la subunidad ÿ del núcleo Pol III y la subunidad ÿ del
complejo ÿ se unen a E. coli ÿ en un punto entre los dominios II y III (24, 67, 150).
El cargador de abrazadera RFC
El cargador de abrazadera eucariótico se aisló por primera vez como un componente necesario
del sistema de replicación del genoma SV40 in vitro (151) [revisado en (152)]. La actividad se
denominó originalmente factor de replicación C (RFC) (51) o activador-1 (153). RFC es una
ATPasa dependiente de ADN que funciona con PCNA para conferir procesividad a la ADN
polimerasa ÿ (142) [revisado en (154, 155)]. La similitud entre RFC y E. coli ÿ complex fue
evidente desde el principio. RFC consta de cinco proteínas diferentes que son homólogas entre
sí y con ÿ y ÿ del complejo ÿ de E. coli (156, 157).
Los motivos de secuencia comunes entre estas proteínas AAA+ cargadoras de pinzas se han
denominado cajas RFC.
En resumen, RFC actúa de manera similar al complejo ÿ. En una reacción dependiente de
ATP, RFC carga PCNA en una unión empotrada de 3 cebador/plantilla y luego se disocia, lo que
permite que PCNA funcione con Pol ÿ (158, 159). Las subunidades RFC en S. cere visiae se
denominan RFC1–5 (157) (consulte la Tabla 2 para ver la nomenclatura RFC humana).
RFC2–5 comparten un peso molecular similar y una arquitectura de tres dominios característica
de la subunidad ÿ de E. coli (85, 160). RFC1 también contiene estos tres dominios, junto con
extensiones considerables de terminales N y C (161). La región N-terminal (residuos 1 a 275 en
S. cerevisiae) tiene una clara homología con las ADN ligasas, aunque no hay evidencia de
actividad ligasa. La eliminación del extremo N de RFC1 da como resultado la sensibilidad a los
agentes que dañan el ADN (162), pero esta región no es necesaria para la carga in vitro (163) o
la viabilidad celular (162). El dominio C-terminal (residuos 660–861 en S. cerevisiae) aún no se
ha caracterizado genética o bioquímicamente.
La composición de cinco subunidades de RFC tiene una gran similitud con el complejo mínimo
E. coli ÿ 3ÿÿ (85). Sobre la base de las interacciones de las subunidades y la similitud de la
secuencia con las subunidades del complejo ÿ, se propuso la disposición de las subunidades del
pentámero RFC (4, 164) y desde entonces se ha probado mediante análisis de estructura (85).
RFC1 comparte características de la subunidad ÿ en sus residuos conservados que interactúan
con abrazaderas y su posición en el pentámero (163, 165). RFC2–4 se consideran similares a ÿ
en su capacidad para formar un subensamblaje trimérico de ATPasa (166). RFC5 está en la ,
posición de ÿ y, como ÿ, contiene un motivo SRC pero carece de un bucle de unión a fosfato de
consenso (bucle P). Al igual que el complejo ÿ 3ÿÿ, los sitios ATP de RFC están ubicados en
interfaces de subunidades. Sin embargo, a diferencia de ÿ 3ÿÿ, RFC
ATPasa competentes contiene
porque RFC1cuatro sitios
también sede
une
a ATP donde ÿ no lo hace. De hecho, RFC5 también se une a un nucleótido en la estructura
cristalina.
Durante el ciclo RFC ATPasa en S. cerevisiae, el complejo se une inicialmente a dos ATP,
luego a un tercero al unirse a PCNA y a un cuarto cuando localiza el
TABLA 2 Componentes del replisoma eucariótico
Saccharomyces Función y comentarios

replisoma cerevisias [Schizosaccharomyces pombe
componente (kDa) Humano (kDa) nombre (es)]
RFCa RFC (277,7)a RFC (314,9)a RFC1 Cargadora de abrazadera pentamérica

(94,9) p140 (128,2) Se une al ATP; fosforilado
RFC2 (39,7) p37 (39,2) Se une al ATP
RFC3 (38,2) p36 (40,6) Se une al ATP
RFC4 (36,1) p40 (39,7) Se une al ATP
RFC5 (39,9) p38 (38,5) Se une a ATP o ADP
PCNA PCNA (28,9) PCNA (28,7) ÿ87 kDa procesividad homotrimérica

abrazadera deslizante
Pol ÿa Pol ÿ (220,2)a Pol ÿ (238.7)a ADN polimerasa replicativaa

Pol3 (124,6) p125 (123.6) ADN polimerasa, 3 -5 exonucleasa,
se une a PCNA; subunidad A (Sp Pol3)
Pol31 (55,3) p50 (51,3) subunidad estructural; subunidad B (Sp Cdc1)
Pol32 (40,3) p66 (51,4) Se une a PCNA; subunidad C (Sp Cdc27);
se une a la subunidad grande de Pol ÿ
—
p12 (12.4) Estructural, estimula la procesividad; subunidad
D (Esp Cdm1)
pol ÿa Pol ÿ (378.7)a Pol ÿ (350.3)a ADN polimerasa replicativaa
Pol2 (255.7) p261 (261.5) ADN polimerasa, 3 -5 exonucleasa
(Esp Pol2/cdc20)
Dbp2 (78.3) p59 (59,5) Se une a la subunidad de la polimerasa (Sp Dpb2)
Dbp3 (22.7) p17 (17,0) Se une a Dpb4
Dpb4 (22.0) p12 (12,3) Presente en el complejo remodelador de
cromatina ISW2/yCHRAC (Sp Dpb4)
pol ÿa Pol ÿ (355.6)a Pol ÿ (340.6)a ADN polimerasa/primasea
Pol1 (166,8) p180 (165,9) ADN polimerasa
Pol12 (78,8) p68 (66,0) subunidad estructural
Pri2 (62,3) p55 (58.8) Interactúa estrechamente con p48
Pri1 (47,7) p48 (49,9) Subunidad catalítica de ARN primasa
MCMa MCM (605,6)a MCM (535)a Mcm2 Helicasea replicativa putativa 3 -5
(98,8) Mcm2 (91,5) Fosforilado por la quinasa dependiente de Dbf4
Mcm3 (107,5) Mcm3 (91,0) Ubiquitinado, acetilado
Mcm4 (105,0) Mcm4 (96,6) Helicasa con MCM6,7; fosforilado
por CDK; también conocido como Cdc54
Mcm5 (86,4) Mcm5 (82,3) También conocido como Cdc46; Bob1 es una forma mutante
Mcm6 (113,0) Mcm6 (92,3) Helicasa con MCM4,7
Mcm7 (94,9) Mcm7 (81,3) Helicasa con MCM4,6; ubiquitinado
RPAa RPA (114)a RPA (100.5)a Proteína de unión a ADN de cadena sencillaa
RPA70 (70,3) RPA70 (70,3) Se une al ADN, estimula Pol ÿ
RPA30 (29,9) RPA30 (29) Se une a RPA70 y 14, fosforilados
RPA14 (13,8) RPA14 (13,5) Se une a RPA30
aLa información se refiere a un complejo proteico.

ADN cebador/plantilla, que desencadena la hidrólisis de ATP, lo que hace que RFC se
expulse y deje el anillo PCNA cerrado en el ADN (167). Este mecanismo excluye la ruta de
RFC que encuentra primero el ADN y luego recluta PCNA. Los estudios de mutación del
sitio ATP han demostrado que, en general, la interrupción de cualquiera de los cuatro sitios
ATP consenso tiene un efecto significativo en la actividad de RFC (168-170), aunque la
unión de ATP puede ser suficiente para rescatar este defecto en al menos un ATP. sitio (en
RFC4 para S. cerevisiae). Estos mutantes de un solo bucle P todavía se unen fácilmente a
PCNA pero son deficientes en la unión al ADN (170).
Se ha resuelto una estructura cristalina de un complejo RFC-PCNA (85). Para promover
la estabilidad de esta interacción dependiente de nucleótidos mediante la prevención de la
hidrólisis, se usó ATPÿ S y se produjo RFC con mutaciones R a Q en los motivos SRC. La
estructura cristalina de RFC-ATPÿ S-PCNA ha proporcionado una vista detallada de cómo
un cargador de abrazadera interactúa con su abrazadera afín (consulte la Figura 6b).
Además, la estructura ha revelado cómo el ADN se une a un cargador de pinzas. Los
principales contactos de PCNA ocurren a través de RFC1 y RFC3, que se unen al bolsillo
hidrofóbico entre los dominios de dos protómeros de PCNA diferentes. RFC1 interactúa
ampliamente con PCNA, mientras que RFC3 parece estar solo "parcialmente comprometido"
con PCNA y el círculo está cerrado. En la estructura RFC-ATPÿ S-PCNA, RFC2 y RFC5 no
se unen a PCNA en absoluto. Esta interacción subóptima de RFC con PCNA puede explicar
por qué la abrazadera permanece cerrada y solo ligeramente perturbada por su estructura
no unida. Alternativamente, el PCNA cerrado puede deberse a fuerzas de empaquetamiento
de cristal, inestabilidad de un complejo de anillo abierto o la mutación de arginina a glutamina
en los cuatro motivos SRC. Aunque esta mutación debería garantizar que no se hidrolice
ATPÿ S, puede haber impedido o perturbado alguna interacción subunidad RFC-PCNA
necesaria para la apertura de la abrazadera.
La forma en que RFC se une al ADN se sugiere por la disposición helicoidal de las
subunidades de RFC en la estructura, con el eje helicoidal que pasa a través del canal
central del PCNA cerrado (consulte la Figura 6c, e). La hélice comienza en RFC1, la
subunidad que está completamente comprometida con el bolsillo hidrofóbico en un protómero
PCNA. Adyacente a RFC1 está RFC4, desplazado por el operador helicoidal de 61ÿ de
rotación y 5,5 Aÿ de traslación. En general, las operaciones helicoidales que relacionan las
cinco subunidades tienen
se encuentra ÿ25un
Aÿpaso de ÿ5,6de
por encima AÿPCNA
por rotación de 60ÿ, terminandoseparado
y está significativamente en RFC5,del
que
dominio ATPasa de RFC1. Esta hélice y paso dextrógiros imitan a los del ADN dúplex en
forma de B. Además, hay espacio suficiente en el centro de RFC para modelar un dúplex de
ADN, que pasa justo por el centro de PCNA. Cada subunidad RFC tiene dos hélices ÿ que
están orientadas de modo que su dipolo positivo rastrea el esqueleto de fosfato del surco
menor del ADN modelado en la estructura (Figura 6e). Varios residuos básicos en estas
hélices se conservan en E. coli y cargadores de pinzas eucarióticos, de acuerdo con la idea
de que el ADN se une dentro de esta área central de RFC. El modelado de una plantilla
cebada de 3 huecos de otra estructura cristalina en el centro del anillo muestra que el
reconocimiento específico de un cebador/plantilla por RFC puede ocurrir por un simple
choque de la unión de la plantilla cebada con la tapa del dominio III del anillo. subunidades
RFC. Un ADN dúplex rígido no podría avanzar a través de la estructura RFC porque
golpearía la tapa y podría
no se doble para salir por el lado de RFC. El ssDNA flexible de una unión cebada puede doblarse
para salir a través del espacio entre RFC1 y 5, quizás con la ayuda de un parche positivo en la
superficie de RFC1 (consulte la Figura 6e). Esta hipótesis de reconocimiento de cebador/plantilla
específico está de acuerdo con evidencia biofísica reciente de asociación RFC/ADN (171, 172).
ADN polimerasas eucarióticas

Ahora se sabe que muchas ADN polimerasas funcionan en la célula eucariota. Todas estas
polimerasas comparten un mecanismo catalítico común [revisado en (11)], pero la mayoría cumple
una función específica fuera de la duplicación básica del genoma. Las ADN polimerasas ÿ, ÿ y ÿ
son las polimerasas replicativas establecidas y se cree que funcionan juntas en la horquilla de
replicación para copiar el ADN genómico de manera semidiscontinua. Pol ÿ, ÿ y ÿ son todos
miembros de la familia B de ADN polimerasas (45).
ADN POLIMERASA ÿ Inicialmente se pensó que la ADN polimerasa ÿ (Pol ÿ) era la replicasa
principal antes de que se descubriera la Pol ÿ. Pol ÿ es único en su capacidad para iniciar la
síntesis de ADN sintetizando primero su propio cebador de ARN de ~12 nucleótidos y luego
extendiéndolo con alrededor de 20 bases de ADN (173, 174) [revisado en (13)]. Ahora se
cree que Pol ÿ es la primasa eucariótica, que produce un cebador híbrido de ARN/ADN,
seguido de un interruptor de polimerasa que permite que la replicasa se haga cargo de la
elongación (175). El cambio está mediado por RFC, que desplaza a Pol ÿ del cebador a
través de la competencia por RPA (176, 177).
Pol ÿ consta de cuatro subunidades (13). La actividad de la ADN polimerasa se encuentra en
la subunidad más grande (p180) y la actividad de la primasa se encuentra en la subunidad más
pequeña (p48). Las funciones exactas de las dos subunidades intermedias no están claras, pero
las cuatro subunidades están presentes en Pol ÿ aislado de levadura, humano, Xenopus y Drosophila.
ADN POLIMERASA ÿ La ADN polimerasa ÿ (Pol ÿ) en levaduras de fisión, seres humanos y otros
organismos eucarióticos se compone de cuatro subunidades esenciales (178, 179). Curiosamente,
en S. cerevisiae, Pol ÿ tiene solo tres subunidades y no existe un homólogo aparente para la
cuarta subunidad (180). Además, la tercera subunidad se puede eliminar de la levadura en ciernes,
aunque se compromete el crecimiento celular (181).
Recientemente se ha propuesto una nomenclatura de subunidad unificada para Pol ÿ (182).
Sobre la base de las subunidades Pol ÿ de Schizosaccharomyces pombe y sus homólogos en
otros eucariotas, las subunidades se han renombrado A–D para los polipéptidos Pol3(A), Cdc1(B),
Cdc27(C) y Cdm1(D). Gran parte del debate se ha centrado en la posibilidad de que el complejo
Pol ÿ se autoasocie en un dímero. La evidencia más reciente en múltiples sistemas indica que el
complejo Pol ÿ contiene solo una copia de cada subunidad en un amplio rango de concentraciones
y tiene una forma alargada que resultó en la confusión anterior sobre si era una partícula de
polimerasa dimérica (183, 184). Los subcomplejos de Pol ÿ también se pueden aislar como un
dímero A/B central (180, 185). Un módulo de dedo de zinc en la subunidad A interactúa con la
subunidad B, que actúa como puente hacia las subunidades C y D (cuando están presentes)
(183, 186, 187). La polimerasa y
Las actividades de exonucleasa 3-5 de Pol ÿ están presentes en la subunidad A grande. La

polimerasa Pol ÿ extiende el ADN con alta fidelidad, pero la exonucleasa parece sorprendentemente
ineficaz in vitro en S. pombe (188) y puede ser más importante cuando PCNA sujeta Pol ÿ al ADN
(189, 190).
Pol ÿ se asocia con PCNA a través de interacciones con al menos dos de sus subunidades.
La abrazadera se coloca detrás de la polimerasa (191), evitando la disociación de la polimerasa
mientras extiende un cebador (192). La interacción más fuerte es entre PCNA y la subunidad C
(193). La subunidad C contiene el motivo de interacción PCNA de consenso, y los estudios en
levadura muestran que esta subunidad que interactúa con PCNA estimula Pol ÿ (183, 194).
Sorprendentemente, la estimulación no depende del motivo que interactúa con PCNA sino
principalmente del dominio involucrado en conexión con el complejo A/B. El heterodímero A/B solo
también puede asociarse con PCNA, presumiblemente a través de la subunidad A (180). La
estimulación de la subunidad C en la actividad de Pol ÿ podría deberse a la estabilización del
complejo proteico más que a la mejora catalítica. Incluso la subunidad D pequeña del complejo Pol
ÿ de cuatro subunidades humanas estimuló significativamente el subcomplejo A/B/C en ensayos
con RFC y PCNA (179).
ADN POLIMERASA ÿ (POL ÿ) Los estudios que muestran que Pol ÿ es esencial en la levadura
la colocaron en la horquilla de replicación (195). De hecho, los ensayos de inmunoprecipitación
de cromatina (ChIP) en levadura indican que Pol ÿ se encuentra en los orígenes antes de la
fase S (196) y se aleja de los orígenes al liberar un bloque de fase S (197), lo que es
consistente con un papel en la replicación cromosómica. Sin embargo, hay algunos estudios
genéticos contradictorios sobre si se requiere la actividad intrínseca de la polimerasa de ADN
para la replicación o si la proteína puede desempeñar otra función, ya sea como sensor de
ADN o proteína de punto de control (198–200), o tal vez mantiene unidas a otras proteínas.
que son esenciales en la partícula replisómica (201). Aunque se requerirá más trabajo para
comprender completamente el papel exacto de Pol ÿ, se cree ampliamente que está
directamente involucrado en la síntesis de ADN en la horquilla de replicación.
Un informe reciente sobre Pol ÿ concluye que es un heterotetrámero con una estequiometría de
1:1:1:1, presumiblemente en todos los eucariotas (202). La ADN polimerasa y la exonucleasa 3-5
de Pol ÿ residen en la subunidad más grande y parecen tener una mayor fidelidad que Pol ÿ/PCNA
(203). La tercera subunidad más grande, Dpb4, también es miembro de un complejo que parece
estar involucrado en la remodelación de la cromatina (204) (A. Tackett y B. Chait, comunicación
personal). La actividad de Pol ÿ no requiere absolutamente PCNA, pero la estimulación de PCNA
aumenta a medida que aumenta la fuerza iónica (205–207).
El motivo de interacción PCNA en la subunidad grande de Pol ÿ no es esencial para la viabilidad
celular, pero el análisis mutacional de esta secuencia sugiere un papel en la reparación del ADN
(208).
El replisoma eucariótico
La naturaleza esencial tanto de Pol ÿ como de Pol ÿ y el hecho de que ambos funcionan con PCNA
como partículas de polimerasa monomérica han dado lugar a propuestas renovadas de que
funcionan juntos para replicar las hebras principales y rezagadas. Xenopo
Los extractos han demostrado que el agotamiento de cualquiera de las polimerasas da como
resultado una caída dramática en la replicación (209, 210). El agotamiento de Pol ÿ dio lugar a
muchas hebras nacientes cortas que pueden haber sido fragmentos de Okazaki incorrectamente
alargados, mientras que el agotamiento de Pol ÿ simplemente ralentizó la maquinaria de replicación.
La viabilidad de las cepas de levadura con deleción de Pol ÿ sugiere que Pol ÿ no es esencial para
la viabilidad celular (198, 201, 211). Sin embargo, un mutante puntual inactivo de Pol ÿ provocó la muerte celular (
Una posible explicación de esta aparente contradicción es que otra polimerasa, presumiblemente
Pol ÿ, puede llevar a cabo la replicación del ADN en ausencia total de Pol ÿ pero que el mutante
puntual de Pol ÿ actuó como un negativo dominante para detener la bifurcación.
Los estudios intensivos de la replicación in vitro del origen de SV40 han brindado una gran
comprensión de la función de horquilla eucariótica, pero el antígeno T de SV40 cumple muchas
funciones que normalmente desempeñan las proteínas del huésped, incluida la función de helicasa
(213). El estudio de las polimerasas en este sistema muestra que Pol ÿ y Pol ÿ, e incluso Pol ÿ solo
en algunas condiciones, son suficientes para la replicación. Sin embargo, el tamaño pequeño del
genoma y el uso del antígeno T pueden minimizar los requisitos para la replicación [revisado en
(152)]. La reconstitución de un replisoma eucariótico en una plantilla de círculo rodante puede facilitar
en gran medida nuestra comprensión de las funciones de Pol ÿ y Pol ÿ y en qué hebra(s) operan.
El tamaño 10 veces más pequeño de los fragmentos de cadena rezagada de eucariotas (ÿ200
pb) en comparación con E. coli se contrarresta con la tasa de movimiento de horquilla 10 veces más
lenta. No se ha demostrado el uso estequiométrico de abrazaderas de PCNA durante la replicación
de la hebra retrasada, pero se presume que ocurre como ocurre con la abrazadera ÿ de E. coli . El
hecho de que las abrazaderas de PCNA se queden atrás en los fragmentos de cadena rezagada
está implícito en el hecho de que PCNA interactúa y, en algunos casos, estimula los factores
necesarios para la maduración del fragmento de Okazaki (214-216). También hay una observación
interesante de que los complejos PCNA-DNA pueden persistir a través de la mitosis, marcando los
cromosomas para la herencia epigenética (217, 218).
Los factores de replisomas eucariotas que contienen helicasa, primasa y SSB están compuestos
cada uno de ellos por ensamblajes multiproteicos en eucariotas [revisado en (9)]. Esta complejidad
contrasta con los factores de una sola subunidad en E. coli. Por ejemplo, incluso la SSB en
eucariotas, denominada RPA, se compone de tres subunidades en un heterotrímero 1:1:1 [revisado
en (14)]. Se cree ampliamente que la helicasa eucariótica es el complejo heterohexamérico MCM2-7
[revisado en (12)], aunque esta conclusión aún no es firme. Al igual que E. coli DnaB, el complejo
MCM hexamérica tiene forma de anillo, pero cada subunidad MCM es un polipéptido diferente. Se
han propuesto arreglos de subunidades para el complejo MCM2-7 (219, 220). La actividad helicasa
se ha observado solo para el subcomplejo MCM4/6/7 (221–223), pero los seis genes MCM son
esenciales en una variedad de sistemas (224) [también, consulte las referencias en (12)]. Estos
hallazgos han llevado a sugerir que una o más de las subunidades MCM2,3,5 actúan como
reguladores (219, 222, 225). De acuerdo con este punto de vista, MCM2 inhibe la helicasa MCM4/6/7.
El complejo MCM también es un objetivo de la fosforilación y la ubiquitinación y se cree que requiere
activación para la acción de la helicasa después del ensamblaje en el ADN. Las subunidades MCM
son proteínas AAA+ y, por lo tanto, se cree que tienen un origen evolutivo distinto del DnaB, que se
construye a partir del módulo RecA.
Figura 7 Disposición hipotética de proteínas en la horquilla de replicación eucariótica. El

complejo MCM hexamérica rodea la cadena principal. En esta caricatura, Pol ÿ se coloca
en la hebra principal y Pol ÿ en la rezagada, con RFC uniendo las dos polimerasas y la
helicasa. La acción de Pol ÿ/primasa lo coloca en la hebra rezagada junto con RPA unido
al ADN monocatenario en bucle. Otros factores involucrados en la replicación y que se
sabe que se unen a ciertas proteínas en la horquilla de replicación incluyen Cdc45, Sld2,
Sld3, Dpb11 y el complejo GINS heterotetramérico.
Además, estas helicasas se translocan en el ADN con polaridades opuestas (221–223), lo que
coloca a las MCM en la hebra principal (consulte la Figura 7). Sin embargo, al igual que DnaB,
se ha demostrado que los MCM son capaces de rodear dos cadenas de ADN (223, 226), y
existe evidencia de que pueden formar un doble hexámero en los sistemas Archaea (227, 228)
y S. pombe (229). . Una línea de evidencia de esto proviene de un MCM de un solo gen de
arqueas que produce un doble hexámero circular con actividad de helicasa (227).
La actividad helicasa de MCM es bastante débil, algo que recuerda a la actividad helicasa
relativamente débil de E. coli DnaB. Como se describió anteriormente, DnaB se vuelve
altamente activo cuando se acopla a la holoenzima Pol III, y este acoplamiento se produce a
través de la subunidad ÿ del cargador de abrazadera (111). Parece probable que un arreglo similar pueda
existen en eucariotas. En el esquema de la Figura 7, se propone que RFC actúe como un

andamio similar al complejo ÿ/ÿ en E. coli, uniendo las dos polimerasas y acoplándolas a la
helicasa. Las conexiones propuestas simplemente se infieren porque solo existe poca evidencia
de una interacción RFC-Pol ÿ (176, 177), y todavía no existe ninguna para que RFC se una a
Pol ÿ o al complejo MCM. Sin embargo, existe evidencia de la presencia de muchos otros
actores proteicos necesarios para la síntesis de ADN y que se supone que actúan en la horquilla
de replicación eucariótica. Aunque las funciones individuales de estos factores son en gran
parte desconocidas, los estudios de interacción de proteínas indican una red como se ilustra
esquemáticamente en la Figura 7. Se sabe desde hace algún tiempo que se requiere Cdc45
para la replicación, y se ha documentado la interacción entre Cdc45 y MCM (230, 231 ). Los
actores más nuevos incluyen Sld3, que se une a Cdc45 (17), y el complejo heterotetrámero
GINS, que parece tener forma de anillo (15, 232). El complejo GINS también parece unirse a
Pol ÿ y, de manera similar a Sld3, se ensambla en los orígenes justo antes de la síntesis de
ADN (15). Se cree que Dpb11 se une tanto a Pol ÿ como a Pol ÿ (233), y también forma un
complejo con Sld2 (16). Se requerirá el estudio bioquímico de estos diversos factores, solos y
en combinación, para comprender sus funciones individuales en la replicación cromosómica y
para determinar si todos funcionan juntos en cada horquilla de replicación.
Complejos RFC alternativos y otras funciones para cargadores de abrazadera
Las abrazaderas deslizantes se utilizan en una variedad de procesos metabólicos del ADN (21,
23), y se puede suponer que su cargador de abrazadera respectivo también está involucrado
en la mayoría de estos procesos. Además, la composición de la subunidad del cargador de
pinzas eucariótico se altera para realizar funciones novedosas en el metabolismo del ADN. Esta
alteración implica el uso de una subunidad de cargador de abrazadera alternativa, en lugar de
RFC1. En la levadura de fisión y en humanos, la subunidad Rad17 (Rad24 en S. cerevisiae)
reemplaza a p140 (RFC1) en complejo con RFC2–5 (25, 234). El complejo Rad17-RFC está
involucrado en la respuesta del punto de control de daños en el ADN, junto con una nueva
abrazadera deslizante similar a PCNA formada a partir del trímero Rad9/Rad1/Hus1 (Ddc1/
Rad17/Mec3 en S. cerevisiae) [revisado en (235)] . Este cargador de pinzas carga la pinza
“911” en el ADN cebado en una reacción estimulada por RPA (236–239) y lo hace con polaridad opuesta a R
La función de la abrazadera 911 no está clara, pero presumiblemente recluta otros factores
cuando se carga en el ADN. Puede haber una actividad de exonucleasa 3-5 en Rad9 o Hus1,
proporcionando así una actividad bioquímica para el propio anillo (240). RFC1 también puede
ser reemplazado por Ctf18/Chl12 (26, 241) o Elg1 (27, 242, 243), que están involucrados en la
cohesión y la estabilidad del genoma, respectivamente, aunque no se conocen las funciones
específicas de estos complejos.
OBSERVACIONES FINALES
Cada año que pasa trae avances significativos en nuestra comprensión de los mecanismos de
horquilla de replicación. Sin embargo, por cada pregunta respondida, surgen 10 más.
Incluso en el sistema procariótico relativamente bien definido e intensamente estudiado
Quedan numerosas preguntas. Todavía no sabemos cómo se organizan realmente las

proteínas en la horquilla de replicación. ¿Cómo están orientadas las dos polimerasas, miran
en la misma dirección? ¿La helicasa rodea una o más hebras? ¿Actúa como un doble
hexámero? ¿Cómo se posiciona la helicasa sobre la replicasa?
¿Cómo se mide y regula la longitud de los fragmentos de Okazaki? ¿Qué sucede cuando el
replisoma encuentra una lesión en la cadena principal o retrasada?
¿Continúa la helicasa desenrollando el ADN y, de ser así, hasta dónde llega antes de
detenerse? Para avanzar más allá de una lesión, E. coli monta la respuesta SOS y supera la
lesión mediante procesos de reparación recombinante, denominados colectivamente "reinicio
de la replicación" [revisado en (113, 114)]. ¿Cómo coordina la maquinaria de replicación su
acción con la de reparación y recombinación? ¿Cómo se ocupa el repli some de la transcripción
de la polimerasa de ARN y otras proteínas fuertemente unidas al ADN?
Las abrazaderas deslizantes tanto en procariotas como en eucariotas interactúan con

muchas ADN polimerasas y proteínas reparadoras diferentes. Por ejemplo, ÿ y PCNA
interactúan con las proteínas de reparación de desajustes y de reparación por escisión. ¿Cuál
es el papel de las pinzas en estos procesos? Las abrazaderas también se unen a una variedad
de polimerasas de ADN especializadas, como las de la familia Y, que tienen baja fidelidad
pero pueden pasar por alto ciertas lesiones. ¿Cómo estas polimerasas intercambian lugares
con la replicasa en el momento y lugar adecuados para eludir las lesiones? ¿Cómo se
restringe el uso de la abrazadera por parte de estas enzimas de baja fidelidad y se devuelve
a la replicasa de alta fidelidad después de que se elude una lesión? PCNA parece estar
modificado por ubiquitinación y/o sumoilación para ayudar en este proceso. ¿Cómo controlan
estas modificaciones el tráfico de diferentes polimerasas en PCNA? Los eucariotas usan una
variedad de cargadores de abrazadera alternativos en los que RFC1 se reemplaza por otra
proteína. Estos sustitutos de RFC1 parecen estar involucrados en la respuesta al daño del
ADN, la cohesión de la cromatina y la estabilidad del genoma. ¿Cómo funcionan estos
cargadores de pinzas alternativos y cómo interactúan con la maquinaria de replicación normal?
Claramente queda mucho trabajo por hacer para abordar estos importantes temas.
El conocimiento de la composición del replisoma eucariota se está convirtiendo rápidamente
en un desafío complejo. ¿Cuántos factores más hay? ¿Cómo se conectan y cuáles son sus
funciones individuales? ¿Funcionan todas estas proteínas dentro del mismo replisoma o
existen varios tipos de replisomas eucariotas, especializados para diferentes regiones del
cromosoma o para diferentes momentos en la fase S? ¿Cómo se regula el ensamblaje y la
función del replisoma al comienzo de la fase S? ¿Cómo se relaciona esto con los factores de
crecimiento que funcionan en la superficie celular y las complejas redes de control del ciclo
celular y quinasa que llegan al núcleo? ¿Cómo ejercen su influencia el punto de control de
daños en el ADN y otros mecanismos de punto de control durante los eventos de fase S en
curso?
Los autores esperan que esta revisión resalte varios avances importantes en nuestro
conocimiento de la estructura y función de la replicasa. Sin embargo, estos comentarios
finales subrayan cuánto queda por aprender y tal vez proporcionen una idea de cuánto nos
queda por recorrer.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Los autores agradecen a las siguientes personas por sus útiles comentarios y debates: Greg Bowman,
Brian Chait, Megan Davey, David Jeruzalmi, John Kuriyan y Alan Tackett. También estamos
agradecidos con Nina Yao por brindarnos ayuda con las ilustraciones. Este trabajo fue apoyado por
una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (GM38839) y por el Instituto Médico Howard
Hughes.
La Revisión anual de bioquímica está en línea en http://

biochem.annualreviews.org
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Y, Griffith JD, et al. 2003. actual Biol. 13: 1583–95
Revisión anual de bioquímica

Volumen 74, 2005
CONTENIDO
DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS A LA INSERCIÓN GENÉTICA ,

Pablo Zamecnik 1
LA BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON ,

Marcos R. Cookson 29
APLICACIONES DE MICROARRAYS DE ADN EN BIOLOGÍA,

Roland B. Stoughton 53
PROTEÍNAS DE DOMINIO DE ZONA PELLUCIDA , Luca Jovine, Costel C. Darie,

Eveline S. Litscher y Paul M. Wassarman HIDROXILACIÓN 83
DE PROLINA Y EXPRESIÓN GÉNICA,

William G. Kaelin Jr. 115
PERSPECTIVAS ESTRUCTURALES SOBRE LA FIDELIDAD TRADUCCIONAL ,

James M. Ogle y V. Ramakrishnan 129
ORÍGENES DEL CÓDIGO GENÉTICO : LA TEORÍA DEL TRIPLETE ESCAPADO ,

Michael Yarus, J. Gregory Caporaso y Rob Knight 179
UNA ABUNDANCIA DE REGULADORES DE ARN , Gisela Storz, Shoshy Altuvia,

y Karen M. Wassarman 199
LAS GUANILATO CINASAS ASOCIADAS A LA MEMBRANA REGULAN LA ADHESIÓN
Y PLASTICIDAD EN LAS UNIONES CELULARES , Lars Funke, Srikanth Dakoji,

y David S.Bredt 219
ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y FORMACIÓN DE BIOLÓGICOS

CONJUNTOS DE HIERRO-AZUFRE , Deborah C. Johnson, Dennis R. Dean,
Archer D. Smith y Michael K. Johnson 247
REPLICASAS DE ADN CELULAR : COMPONENTES Y DINÁMICA A NIVEL
HORQUILLA DE REPLICACIÓN , Aaron Johnson y Mike O'Donnell 283
SÍNTESIS DE TRANSLESIÓN EUCARIOTICA ADN POLIMERASA:
ESPECIFICIDAD DE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN, Satya Prakash,

Robert E. Johnson y Louise Prakash 317
PROTEÍNAS NOD-LRR : PAPEL EN LAS INTERACCIONES HUÉSPED-MICROBIANO Y
ENFERMEDAD INFLAMATORIA , Naohiro Inohara, Mathias Chamaillard,
Christine McDonald y Gabriel Núñez ˜ 355
v
vi CONTENIDO
REGULACIÓN DE LA FUNCIÓN DE PROTEÍNAS POR GLICOSAMINOGLICANOS —AS

EJEMPLIFICADO POR QUIMIOQUINAS, TM Handel, Z. Johnson, SE Crown,
EK Lau, M. Sweeney y AE Proudfoot 385
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA AMIDA HIDROLASA DE ÁCIDO GRASO ,
Michele K. McKinney y Benjamin F. Cravatt 411
PROCESOS DE POLIMERIZACIÓN NO DEPENDIENTES DE LA PLANTILLA :
LAS POLIHIDROXIALCANOATO SINTASAS COMO PARADIGMA,
JoAnne Stubbe, Jiamin Tian, Aimin He, Anthony J. Sinskey,
Adam G. Lawrence y Pinghua Liu 433
METILTRANSFERASA DE CITOSINA EUCARIOTICA, Mary Grace Goll
y Timothy H. Bestor 481
MONITOREO DEL BALANCE ENERGÉTICO : METABOLITOS DE ÁCIDOS GRASOS
SÍNTESIS COMO SENSORES HIPOTALÁMICOS , Paul Dowell, Zhiyuan Hu,
y M. Daniel Lane 515
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN FISIOLÓGICA DE LA BAJA DENSIDAD
RECEPTOR DE LIPOPROTEÍNAS , Hyesung Jeon y Stephen C. Blacklow 535
SUPERÓXIDO DE COBRE-ZINC DISMUTASA Y LATERALES AMIOTRÓFICOS
ESCLEROSIS, Joan Selverstone Valentine, Peter A. Doucette,
y Soshanna Zittin Potter 563
LA ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS COMPLEJOS SMC Y KLEISIN ,
Kim Nasmyth y Christian H. Haering 595
ANTIBIÓTICOS DIRIGIDOS A LOS RIBOSOMAS : RESISTENCIA, SELECTIVIDAD,
SINERGIA Y REGULACIÓN CELULAR , Ada Yonath REPARACIÓN DE 649
LA DESIGUALDAD DEL ADN , Thomas A. Kunkel y Dorothy A. Erie TERAPIA 681
GÉNICA : MEDICINA DEL SIGLO XXI , Inder M. Verma
y Matthew D.Weitzman 711
LA RESPUESTA DE LA PROTEÍNA DESPLEGADA DE MAMÍFEROS , Martin Schroder ¨
y Randal J. Kaufman LA 739
BIOLOGÍA ESTRUCTURAL DE LOS ÁCIDOS GRASOS TIPO II
BIOSÍNTESIS, Stephen W. White, Jie Zheng, Yong-Mei Zhang,
y Charles O. Rock 791
ESTUDIOS ESTRUCTURALES MEDIANTE TOMOGRAFÍA ELECTRÓNICA : A PARTIR DE CÉLULAS
´ ¨
TO MOLECULES, Vladan Luciÿ c, Friedrich F orster y
Wolfgang Baumeister 833
LAS FAMILIAS DE PROTEÍNAS Y SU EVOLUCIÓN: UNA ESTRUCTURA
PERSPECTIVA, Christine A. Orengo y Janet M. Thornton 867

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año Rev. Bioquímica. 2005. 74:283–315

REPLICASES DE ADN CELULAR : Componentes

Aaron Johnson2 y Mike O'Donnell1,2 1Instituto Médico

Antígeno nuclear de células en proliferación ................................ 298 El cargador de pinzas

OBSERVACIONES FINALES ............................................. 307

284 JOHNSON O'DONNELL

RÉPLICAS CELULARES 285

El factor de replicación C eucariota (RFC) y las subunidades cargadoras de pinzas procariotas

Los cargadores de abrazadera y abrazadera de replicasas celulares, tanto procariotas como

286 JOHNSON O'DONNELL

Núcleo Pol III

RÉPLICAS CELULARES 287

TABLA 1 Componentes del replisoma de Escherichia coli y funciones asociadasa

288 JOHNSON O'DONNELL

de 243) contiene el sitio activo de exonucleasa y el sitio de unión ÿ. La estructura cristalina de

RÉPLICAS CELULARES 289

Figura 2 Estructura y dinámica de la abrazadera deslizante ÿ. (a,b) Estructura cristalina del

290 JOHNSON O'DONNELL

El cargador de pinza complejo ÿ

RÉPLICAS CELULARES 291

292 JOHNSON O'DONNELL

RÉPLICAS CELULARES 293

ÿ y ÿ no cambian drásticamente durante la asociación de sujeción (93). Por lo tanto, puede

La proteína DnaX está presente en tres copias en el complejo pinza-cargador y, por lo

294 JOHNSON O'DONNELL

Figura 4 Organización y dinámica del replisoma de E. coli . (a) La subunidad ÿ de la holoenzima de la

RÉPLICAS CELULARES 295

A medida que avanza el replisoma, la polimerasa de la cadena principal simplemente extiende el

La progresión de la horquilla de replicación se ha estudiado en E. coli, utilizando plantillas de ADN

Tráfico de proteínas en abrazaderas deslizantes de ADN

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de ÿ (consulte la Figura 5c). Estos procesos de conmutación explican cómo

Aunque la complejidad de la arquitectura, la interacción y la regulación de la replicación del ADN es mucho

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Antígeno nuclear de células en proliferación

Figura 6 Estructuras de la pinza eucariótica y el cargador de pinzas de Saccharomyces

RÉPLICAS CELULARES 299

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El cargador de abrazadera RFC

RÉPLICAS CELULARES 301

TABLA 2 Componentes del replisoma eucariótico

Saccharomyces Función y comentarios

RFCa RFC (277,7)a RFC (314,9)a RFC1 Cargadora de abrazadera pentamérica

RFC3 (38,2) p36 (40,6) Se une al ATP

RFC4 (36,1) p40 (39,7) Se une al ATP

RFC5 (39,9) p38 (38,5) Se une a ATP o ADP

PCNA PCNA (28,9) PCNA (28,7) ÿ87 kDa procesividad homotrimérica

Pol ÿa Pol ÿ (220,2)a Pol ÿ (238.7)a ADN polimerasa replicativaa

aLa información se refiere a un complejo proteico.

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RÉPLICAS CELULARES 303

ADN polimerasas eucarióticas

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Las actividades de exonucleasa 3-5 de Pol ÿ están presentes en la subunidad A grande. La

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Figura 7 Disposición hipotética de proteínas en la horquilla de replicación eucariótica. El

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existen en eucariotas. En el esquema de la Figura 7, se propone que RFC actúe como un

Complejos RFC alternativos y otras funciones para cargadores de abrazadera

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