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DISEO DE OLIGOS Aunque no existe una 'regla' general, se recomienda que: 1.

Los primers no tengan ninguna discrepancia (mismatch), a exepcin de los utilizados para mutagenesis. 2. No exista algn sitio alternativo en el templado donde el primer pueda hibridarse. 3. Los primers no formen estructura secundaria, especialmente en el extremo 3' o que sean parcialmente complementarios 4. La longitud del oligo sea de 20 a 24 bases para reducir al mnimo la posibilidad de hibridizacin en sitios secundarios en el vector o inserto. 5. La temperatura de fusin (Tm) sea de 55oC o ms, de manera que este por arriba de la temperatura de "annealing". 6. El oligo no contenga "strings" de ms de una base. Es de especial importancia evitar 3 o mas G's o C's consecutivas. 7. Los primers tengan un contenido de C/G entre 40 y 60%. Para primers con contenido menor al 50% de C/G, es necesario incrementar la secuencia de los mismos para levar la Tm sobre la temperatura de annealing. 8. El primer sea ms afn en su extremo 3

Diseo de Oligonuclet idos para PCR

Uno de los parmetros ms importantes para tener xito en la amplificacin por PCR es el diseo de los oligonucletidos cebadores (oligos o primers). Si stos no estn bien diseados la PCR puede no funcionar bien; el resultado es la nula amplificacin del producto debido a amplificacin no especfica o a la formacin de dmeros de oligonucletidos que pueden competir con la amplificacin del producto deseado. Qu debemos tener en cuenta a la hora de disear oligonucletidos para PCR? Las principales variables a tener en cuenta son: 1. Tamao del oligonucletido

Temperatura de fusin (Tm) Especificidad Secuencias complementarias Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) or polipurinas (A, G) 6. Secuencia 3 terminal. 7. Secuencia 5 terminal y regiones centrales 2. 3. 4. 5. 1. Tamao del oligonucletido El tamao del oligonucletido influye en la especificidad, en la temperatura de fusin y en el tiempo necesario para la hibridacin del oligonucletido a su secuencia complementaria, por tanto es decisivo para que salga bien la PCR. Los oligonucletidos de 18 a 24 bases son muy especficos de secuencia, siempre que la temperatura de hibridacin sea ptima. El tamao del oligonucletido es proporcional a la eficiencia de hibridacin: en general, cuanto ms largo sea el oligonucletido ms ineficiente ser la hibridacin. Si hay pocos moldes con su oligonucletido hibridado (o anillado) en cada paso de la PCR el resultado va a ser muy poco producto amplificado. Los oligos no deberan ser demasiado cortos a menos que se especifique lo contrario en el protocolo. La meta es disear un oligonucletido con una temperatura de hibridacin (la que programamos en el termociclador) de al menos 50C. La relacin entre temperatura de hibridacin y temperatura de fusin es muy importante en la PCR. Como regla general la temperatura de hibridacin debe ser 5- 8C ms baja que la de fusin. Por tanto, si queremos un oligonucletido con una temperatura de hibridacin de al menos 50C, correspondera a un oligonucletido con una temperatura de fusin de (Tm ~ 55-58C). A menudo, la temperatura de hibridacin as determinada no es ptima y es necesario determinarla empricamente. Se puede hacer fcilmente con un termociclador con gradiente (por ejemplo el Mastercycler gradient de Eppendorf). 2. Temperatura de fusin (Tm) Es importante tener en cuenta que en una reaccin de PCR hay dos oligonucletidos. Ambos oligonucletidos deberan disearse de manera que tengan temperaturas de fusin similares. Si los oligonucletidos no tienen Tm parecidas, la amplificacin ser menos eficiente o incluso puede no funcionar ya que el oligonucletido con la Tm ms alta hibridar mal o inespecficamente a bajas temperaturas mientras que el oligonucletido con la Tm ms baja puede que no

funcione a temperaturas ms altas. Las temperaturas de fusin de los oligos se calculan de una manera muy exacta con clculos termodinmicos usando la siguiente frmula: Tmoligonucletido = H [S+ R ln (c/4)] 273.15C + 16.6 log 10 [K+] donde H es la entalpa y S la entropa para la formacin de la hlice, R es la constante molar y c es la concentracin del oligonucletido. Pero lo ms sencillo es usar cualquiera de los paquetes de software para el diseo de oligonucletidos del mercado. Por suerte, una buena aproximacin (generalmente vlida para oligos en el rango de 1824 bases) a la Tm se puede calcular con la frmula: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Frmula de Wallace En esta tabla hay valores de Tm de oligonucletidos de varios tamaos usando la frmula de Wallace asumiendo un contenido en G/C del 50%. Tamao Tm = 2 (A+T) Tamao Tm = 2 (A+T) + del + 4(G+C) del Oligonucletido 4(G+C) Oligonucletido 4 6 8 10 12 14 16 18 12C 18C 24C 30C 36C 42C 48C 54C 22 24 26 28 30 32 34 36 66C 72C 78C 84C 90C 96C 102C 108C

20 60C 38 114C Las temperaturas calculadas usando la ecuacin de Wallace son inexactas en los valores extremos. Adems hay que tener cuidado de que la Tm del producto sea lo suficientemente baja para asegurar que est totalmente desnaturalizada a 92. Este parmetro ayudar a asegurar una PCR ms eficiente, pero no siempre es necesario para amplificar por PCR. En general, productos entre 100600 pares de bases se amplifican eficientemente en muchas reacciones de PCR. En caso de duda, la Tm del producto puede calcularse con la frmula:

Tm = 81.5 + 16.6 log10[K+] + 0.41 (%G+C)675/tamao. Bajo condiciones estndar de PCR de 50 mM KCL, se reduce a: Tm = 59.9 + 0.41 (%G+C) 675/tamao 3. Especificidad La especificidad del oligonucletido depende parcialmente del tamao del oligonucletido. Es evidente que hay ms combinaciones de oligos de 24 bases que de 15 bases. Con todo, debemos elegir oligonucletidos que tengan una secuencia nica en el molde de DNA que queremos amplificar. Por ejemplo: un oligonucletido diseado con una secuencia altamente repetitiva resultar en un smear cuando amplifiquemos DNA genmico; sin embargo, el mismo oligonucletido puede dar una sola banda si amplificamos un clon de una genoteca de DNA. Como la Taq Polimerasa es activa en un amplio rango de temperaturas, puede extender el oligonucletido a temperaturas bajas de hibridacin. Si la temperatura es demasiado baja, puede suceder una hibridacin no especfica que ser extendida por la polimerasa con que haya una pequea homologa en el extemo 3 del oligonucletido. En general, una temperatura de fusin de 55C 72C es la ms adecuada (Fjate que corresponde a un tamao de oligonucletido de 1824 bases segn la regla de Wallace). 4. Complementariedad en la secuencia de los oligonucletidos Es muy importante que los oligonucletidos no tengan homologa intraoligonucletido en ms de 3 pares de bases. Si un oligonucletido tiene una regin de auto-homologa, se pueden formar estructuras parcialmente de doble cadena que interferirn con la hibridacin al molde. Otro peligro es la homologa entre los dos oligonucletidos. Homologa parcial en las regiones medias de dos oligonucletidos puede interferir con la hibridacin. Si la homologa ocurriese en el extremo 3' de cada oligonucletido, se dar la formacin de dmeros de oligonucletido que impedirn la formacin del producto por competicin. 5. Contenido en G/C y extensiones de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G) La composicin de bases de los oligonucletidos debera ser del 45% al 55% en GC. La secuencia del oligonucletido debera elegirse de

manera que no contenga zonas de poliG o poliC que puedan llevar a hibridacin no especfica. Hay que evitar tambin las zonas ricas en poli A y poli T ya que es por donde puede deshibridarse el complejo moldeoligonucletido lo que llevara a una menor eficiencia de amplificacin. Tambin hay que evitar secuencias ricas en polipirimidinas (T, C) y polipurinas (A, G). Idealmente el oligonucletido deber tener una mezcla casi a alzar de nucletidos, un contenido en GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm estara en el rango de 56C 62C). 6. Secuencia 3-terminal Se sabe que la posicin 3' terminal de los oligonucletidos de PCR es esencial para controlar el apareamiento incorrecto. Ya hemos visto el problema de la homologa del oligonucletido en esas regiones. Otra variable que hay que considerar es que haya algn residuo de G o C en el extremo 3' del oligonucletido. Este cepo de GC (en ingls CG Clamp) ayuda a asegurar que el extremo 3 hibride correctamente debido a los enlaces de hidrgeno que se dan entre los residuos de GC. Tambin ayuda a mejorar la eficiencia de la reaccin de PCR minimizando cualquier deshibridacin que pudiese ocurrir. Los oligos con secuencias inestables en el extremo 3 (G > -9 kCal/mol) a menudo son ms especficos ya que el potencial de apareamiento en lugares incorrectos es menor. Por lo general, esta condicin se puede cumplir incluyendo como mucho dos residuos G o C en la ltimas cinco bases del extremo 3 terminal. 7. Secuencia 5-terminal y regiones centrales. Es conveniente incluir en esas zonas cepos GC para dar mayor estabilidad a la hibridacin del oligonucletido con su secuencia diana. Conclusin Es esencial un buen diseo de oligonucletidos para tener xito en la PCR. Los parmetros ms importantes y que es necesario optimizar son el tamao del oligonucletido, el contenido (%) en GC y la secuencia del extremo 3'. Alguno de estos parmetros pueden optimizarse fcilmente a mano pero otros es mejor hacerlo con herramientas informticas.

EJERCICIO

Por favor contesta a las preguntas siguientes de este ejercicio previo al diseo de oligonucletidos durante esta clase y entrgalo al terminar. Empleando las herramientas que ya vimos en la anterior clase prctica del 10/3/2005: 1. Localiza al menos cuatro herramientas de software no comerciales para el diseo de primers que puedas usar va WWW.

2. Haz una bsqueda con BLAST: primero consigue la secuencia problema (la secuencia la puedes encontrar en la carpeta clase 14 abril 2005 en http://campusvirtal.uma.es) 3. Podras decir de qu organismo se trata? 4. Cuantos ORF hay en esa secuencia y para qu codifican? Imaginaos que estis realizando un estudio de variabilidad de la polimerasa de este organismo y queris amplificar una regin que comprende los aminocidos 980 al 1422 del mRNA de dicha polimerasa. 5. Podras localizar la secuencia de aminocidos de esta polimerasa? Di cmo lo has hecho y/o dnde lo has encontrado. 6. Y la de nucletidos de su mRNA? Di cmo lo has hecho y/o dnde lo has encontrado. 7. Qu % en GC tiene dicho mRNA? Para conseguir amplificar DNA por PCR (o RT-PCR si partimos de RNA, como es el caso) el paso ms crucial es el de diseo de oligonucletidos cebadores o primers. Vamos a disear unos primers aceptables para amplificar esa regin. Primero propondremos unos oligos basndonos en los criterios de diseo que os resumo a continuacin. Los primers deben cumplir los siguientes criterios: Criterios positivos para el diseo de primers Temperatura de fusin TmForward = TmReverse (Tm) Tm = 55-62C T hibridacin ~ 5-8C menos que la Tm Tamao del primer 12-30 b, ptimo 18 a 24 b

Distancia entre primers Contenido en G+C

10 b-10 kb

>= secuencia diana; ideal del 45% al 55% cepo GC en 3 termina en T; G o C en dos (mx) de cinco ltimas bases cepo GC en 5 incluir varias G o C en las ltimas bases Lugares de anillamiento nicos de primers Criterios negativos para el diseo de primers Evitar apareamientos incorrectos Evitar (Tm) interaccin primer-primer

Evitar estructuras en horquilla 1. Busca los nucletidos correspondientes a los codones de los aminocidos 980 y 1422 (el fragmento que queremos amplificar). Qu tamao (en nt) tiene la secuencia que queremos amplificar? Qu porcentaje de GC tiene? 2. Disea unos oligos externos a stos teniendo en cuenta todos los criterios anteriores. El oligo se escribe empezando siempre por su extremo 5 pon el nucletido de comienzo y de fin del oligo con respecto a la secuencia del mRNA. Oligo Reverse (complementario a la secuencia que queremos amplificar): 5............................................................................................................... ................................. Oligo Forward (idntico a la secuencia que queremos amplificar) 5............................................................................................................... ................................. 3. Calcula la Tm de los primers por la frmula de Wallace. Oligo R: Oligo F: 5. Con las herramientas bioinformticas que habis buscado antes podemos comprobar nuestros primers. a) Por ejemplo la herramienta: http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.html nos permite calcular la Tm, contenido en GC, tamao y peso molecular de los oligos. Coinciden los valores con los que habas calculado

manualmente? b) Si queremos adems comprobar que no forme estructuras secundarias como horquillas, hibridaciones ente los dos primers, repeticiones o palndromos podemos ir a: http://207.32.43.70/biotools/oligocalc/oligocalc.asp http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html En este ltimo caso esperad a que salga otra ventana y luego pinchad en el botn Grant this session. Se forman horquillas o dmeros en tus primers? c) Si vas a amplificar mRNA del virus por RT-PCR debes tener presente que la muestra de RNA total de clulas infectadas con virus (previamente purificado de los extractos celulares) es una mezcla de RNAs de origen viral y celular. Para comprobar la especificidad de vuestros primers, es decir, que los oligos no se unan inespecficamente a otras zonas del genoma del virus o bien a otros RNAs virales o celulares, debes hacer una bsqueda en bases de datos introduciendo la secuencia de los primers que has diseado. Qu herramienta has utilizado? Qu homologa de secuencia has encontrado y con qu organismos? 6. Propn un programa de RT-PCR adecuado para amplificar este fragmento partiendo de RNA purificado (recuerda que la temperatura de hibridacin de la PCR va en funcin de los primers que has diseado). 7. Con la secuencia de aminocidos de la zona amplificada busca en BLAST y en la herramienta de bsqueda de funcin de protenas AnaGram (http://jaguar.genetica.uma.es/anagram.htm; recuerda que debes limitar esta bsqueda a 400 amincidos). qu funcin asigna cada uno de estas herramientas a la protena? 8. Por ltimo, quieres clonar en pBR322 para poder expresar esa zona de la protena, disea (o modifica) unos primers que contengan secuencias diana de enzimas de restriccin. (Indica todos los pasos intermedios que te han permitido llegar a ese diseo). Oligo Reverse 5............................................................................................................... ................................. Oligo Forward 5............................................................................................................... ................................