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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR O FILTRACIN MOLECULAR O

FILTRACIN EN GEL
Consiste en que se tiene un gel que es un soporte, que generalmente es
Polidextrano, o polmero entre polidextrano y acrilamida, o polmero entre
polidextrano y agarosa, Este gel crea una serie de canalculos (que
pueden ser pequeos o grandes), y las molculas que se tienen en fase
estacionaria o suspendida en este caso la protenas (amarillas, rojas,
naranjas) van a entrar o no en estos poros.
Entran o no en los poros dependiendo del tamao de exclusin del gel (el
tamao de exclusin del gel quiere decir que tamao de partculas no
entrar a estos poros) utilizado.
Si se tiene un gel con tamao de exclusin 10.000,el cual se utiliza
mucho para la eliminacin de sales de las muestras de proteinas, quiere
decir que todas las moleculas con una tamao menor a 10.000 entran a
los canales y las mayores a 10.000 no entran a los canales.

Si se tiene la face movil (3); van a entrar


las molculas mas pequeas a los
canales, y el camino que van a tener que
recorrer (arrastradas por el solvente)es
mucho mayor que las molculas que no
entran y entonces a partir de esto, en el
tiempo las molculas grandes van a ser
arrastradas rpidamente, las molculas
pequeas van a ser menos rpidas y las
chiquititas o sales van a ser
prcticamente retenidas un largo tiempo
en el gel, entonces se tendr esta
situacin : ( MONO QUE HIZO EN PIZARRA DEL CUAL NO DISPONGO)

Las que salen primero son las ms grandes, despus medianas y despus pequeas.
Las primeras protenas no son retenidas, las medianas son medianamente retenidas y las
pequeas son altamente retenidas

Se basa en un principio de permeacin, son


coladores pero al revs, van pasando lo ms
grande pero lo ms chico va quedando ya que se
arrastran a lo largo de la red de capilares que va
formando el gel y se demoran ms en llegar abajo.
Las ms grandes se van a ir solo por la orilla y van
a caer prontamente de la columna.
Los materiales que se utilizan son materiales que
no poseen resistencia mecnica (por el echo de
tener poros).
En esta cromatografa a diferencia de las otras que
hemos visto, la resolucin de los Peaks que yo
obtengo depende de la geometra de la columna.
Hay una relacin entre el dimetro y alto de la
columna y an ms hay una relacin de volumen
de muestra que yo puedo cargar, no se puede
poner litros y litros de mezcla por que se van a
mezclar todos, Se debe poner una cierta cantidad
de muestra, la cual est limitada ha diferencia de las columnas anteriores que se
vieron por ejemplo de intercambio inico y de interacciones hidrofbicas en donde la
cantidad de muestra all no importa mientras no se sature el sistema.

Se utiliza un unico solvente, un unico tampn. Por lo tanto como depende tanto de la
geometria y de la estabilidad de la muestra estas cromatografas si una vez que se
tiene estandarizada, mantengo las condiciones, siempre se va a producir lo mismo. Al
igual que lo que se realizo en el prctico de electroforesis si se tiene la suerte de tener
protenas estndares con tamaos conocidos se puede poner la muestra de las
protenas estndares y se puede hacer LogPM v/s Volumen de Elusin (es decir cuanto
volumen se ocupo para sacar la protena de la columna), y en funcin de ese volumen
utilizado se obtiene la masa molecular de la protena interpolando el volumen de
elusin de la muestra a determinar y luego sacando el antilogaritmo de LogPM.
La masa molecular de la protena es en condiciones de disolucin (en condiciones
nativas). La masa molecular que nosotros determinamos en el prctico es en
condiciones denaturantes por la participacin del SDS.
Por lo tanto se puede determinar fcilmente, una vez que se tiene la columna calibrada
se puede usar siempre que se utilice el mismo tampn, la misma fuerza inica, la
misma temperatura, la misma cantidad de muestra cargada, el flujo sea el mismo.
Estas columnas dada la eficiencia que se necesita siempre son columnas largas, tienen
60, 70 cm por 150cm. Se usan sobre todo para purificar protenas que posterior se
necesitan hacer funcionar (por ejemplo en electroforesis no se puede hacer funcionar
la protena por que est asociada a SDS, o se denatur).
Se debe determinar un volumen de vaco de la columna que corresponde a todo el
volumen que tengo en el espacio. Si se pone una muestra que no es absorbida, no es
retenidael volumen que pasa es el volumen muerto de la columna (espacio vaci)
el cual se obtiene poniendo una molcula de alto peso molecular como azul de
dextrano que pesa 1 o 2 millones de tamao molecular, por ende no va a pasar nunca,
por lo tanto yo se que no saldr ninguna protena hacia debajo de donde este la
molcula de dextrano.
Es importante sealar que cada vez que se utilice la columna, posterior, se debe lavar
con el mismo tampn utilizado, con 3 veces los mL de la columna, por ejemplo si la
columna es de 25 mL se debe lavar con un volumen equivalente de buffer a 75mL.
Tambin se puede determinar el volumen total que se tiene adentro de la columna, el
cual es algo que va a ser totalmente retenido. Algo que est ubicado en el inici de la
columna, cuanto demora en llegar al final.
Volumen columna: Volumen completo de la columna, desde arriba haca abajo (Gel
ms partculas, ms solvente, mas todo). Eso quiere decir que si se pone algo arriba y
empieza a bajar y cuanto est abajo querr decir que se elimino todo el contenido y
ese es el volumen mximo que se podra demorar algo, es la sal ms pequea que
puede atravesar toda la columna por lo tanto despus de ese volumen no puede salir
nada. Algo que se puso en el inicio de la columna, no puede salir ms all del volumen
columna.
No puede salir antes del volumen de vaci, y no puede salir despus del volumen de
columna.
Si la muestra interacciona con el soporte (gel-matriz), ser retenida por sobre el
volumen de columna, esto es indicativo que hay interaccin entre la muestra y la
columna (material de soporte). Esto no se puede dar, generalmente ocurre cuando se
utilizan bajas fuerzas inicas, como por ejemplo tampones 10Mm, por eso los
fabricantes recomiendan usar mnimo una fuerza inica entre 50 y 75mM en
cromatografa de filtracin molecular.
Otro problema, (cuando una hace cromatografa de intercambio inico y salen dos
cosas juntas, este problema se poda solucionar cambiando el gradiente), como ac no
se tiene gradiente, lo que se hace es aumentar el tamao de la columna (la misma
pero ms grande, larga).
Ahora si no queda ms material para la columna para aumentar el tamao de la
columna (me suicido xD). Solucin; Se usa la misma columna y se aumenta el flujo
(la velocidad con que se pasa la muestra) como ltimo recurso, la solucin ideal es
aumentar el largo de la columna.

Problema: Un profesor determin la masa de una protena la cual dio 85.000, sin
embargo los alumnos luego determinaron otra vez la masa de la protena y dio 40.000
-

Protena Transformer
La protena en forma nativa es un dmero (dos subunidades de 40.000), por lo
tanto lo que se determin fue un monmero. Esta tcnica ve el volumen
hidrodinmico de las protenas, y todos los clculos se basan en que la columna
posee esferas perfectas. Esta tcnica tiene un +-10% de error, si determino
40.000, mi protena puede tener entre 37.000 y 43.000 de peso molecular.
Tampoco es conveniente informar pesos moleculares de 43.234, sino slo
43.000 (en todos los geles se informa as).
Solo cuando se conoce la estructura atmica completa de la protena, se puede
usar la unidad Dalton o kDa. En todos los geles se usan kDa, pero en realidad
no se estn midiendo kDa. 1 Dalton es la masa de un tomo de hidrgeno, por
lo tanto con estas tcnicas no se puede determinar si tiene un hidrgeno ms o
un hidrgeno menos.
Slo cuando se conoce la secuencia completa de la protena se puede informar
la masa como kDa. En sentido estricto no se deberan dar unidades de medida
cuando se determina el tamao de una protena por estos mtodos

Si no entendieron encontr esto que puede ser til


La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna
por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms
precisamente, segn su radio de Stokes.
En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en
largos polmeros entrecruzados que forman una red
tridimensional porosa. A los fines prcticos, las columnas se
empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas
por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas
partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que
algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn
ingresar a esos poros, en tanto que otras (las
suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los
poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual
determina una serie de caminos a ser recorridos por las
molculas que acceden al interior de esta.
Los poros de la matriz deben ser de tamao comparable al
tamao de las molculas que se desea separar. Las
molculas de mayor tamao que los poros harn el camino
ms corto, ya que nunca entran a la malla de la fase
estacionaria. Se dice que estas molculas son excluidas.
Las molculas pequeas pueden difundir dentro de la
matriz. Cuanto menor es su tamao, mayor es la
probabilidad de que entren a un poro. As, a menor
tamao de la molcula, ms largo el camino que seguir
dentro de la malla de la fase estacionaria.
En una columna de filtracin molecular, las partculas que
forman la fase estacionaria estn empaquetadas dentro de
una columna cilndrica por donde fluye la fase mvil (el
eluyente). Es frecuente que estas columnas estn en posicin vertical y que el pasaje
de la fase mvil sea impulsado por la fuerza de gravedad.
Las molculas excluidas se mueven continuamente junto con el eluyente, en tanto que
aquellas que por su tamao pueden ingresar a la fase estacionaria son retardadas en
funcin de sus tamaos. Por lo tanto, las primeras molculas que eluyen son las
excluidas, y luego, en orden de tamao decreciente, las molculas no excluidas.

La cromatografa de filtracin en gel, ms corrientemente llamada de exclusin


molecular, es una tcnica de purificacin muy extendida y apreciada debido a su
sencillez y eficacia en la resolucin de mezclas complejas de macromolculas. Esta
tcnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analticos (por ejemplo, para
la determinacin de pesos moleculares).
1. 2. Principio de la cromatografa de filtracin en gel
Con la cromatografa de filtracin en gel se separan molculas en virtud de sus
diferencias de tamao. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de
un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Estas esferas estn constituidas por
largas cadenas de polmeros unidas entre si por enlaces qumicos para formar una red
tridimensional.
El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio
(Fig. 1) quedando listo para su uso.
En el interior de una columna
de
cromatografa
pueden
distinguirse varios volmenes
(Fig. 2):
a) El volumen total (Vt), que
es el volumen que ocupa el
cilindro de gel hidratado.
b) El volumen de vaco (Vo),
o el volumen existente entre
las esferas del gel.
c) El volumen ocupado por
las esferas del gel, que se
expresa como la diferencia
entre los dos volmenes
anteriores: Vt-Vo.

Cuando una mezcla de


molculas
de
diferentes
tamaos se hace pasar a
travs de la columna de gel,
se produce la separacin en virtud del siguiente principio:
- Las molculas de muy pequeo tamao penetran en el interior de las esferas que
componen el gel y, por consiguiente, no son extradas de la columna hasta que no ha
pasado a travs de ella un volumen de
lquido igual a su volumen total (Vt). Sin
embargo, aquellas molculas cuyo tamao es
mayor que el de los poros de las esferas del
gel, no pueden penetrar en su interior y
atraviesan
la
columna
recorriendo
nicamente el volumen vaco (Vo), siendo las
primeras en salir de la columna. El resto de
las molculas, de tamao intermedio,
presentan una mayor o menor facilidad para
difundir al interior de las esferas en funcin
de
su
tamao,
siendo
extradas
fraccionadamente con volmenes que estn
comprendidos entre el Vt y el Vo.
Cuanto mayor es una molcula, menos capacidad tiene para acceder al interior de
las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de lquido que se requiere para
extraerla de la columna.
Teniendo en cuenta que para las protenas globulares el tamao est, en general,
relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografa separa las sustancias en
funcin de dichos pesos moleculares, obtenindose primero las ms pesadas.
1.3. Grados de los Geles
Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamao
de sus poros. ste viene expresado por dos nmeros que representan pesos
moleculares, correspondiendo el menor de ellos al peso molecular mximo de una
sustancia que difunda perfectamente a travs de todos los poros del gel, y el mayor, al

peso molecular mnimo que ha de tener una sustancia para que pueda ser excluida de
las esferas del gel.
Las sustancias de peso molecular fuera de dicho rango no son fraccionadas sino que
se extraen conjuntamente con el volumen vaco (Vo), las de peso molecular mayor que
el rango, o con el volumen total (Vt), las ms pequeas que dicho rango.
En el mercado se encuentran geles con rangos de fraccionamiento muy diversos
(desde 1.000-5.000, hasta 10.000-4.000.000), lo que posibilita la separacin a
diferentes escalas de pesos moleculares.
1.4. Factores que influyen en la separacin
Adems de la diferencia intrnseca de tamao existente entre las molculas que van
a ser cromatografiadas, hay diferentes factores que influyen en una correcta
separacin de las mismas:
- Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de diferente
tamao aumenta con la longitud de la columna.
- Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del lquido con
que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila
-1

entre 2 y 10 cm h .
- El volumen de la muestra a cromatografiar. Debe ser pequeo comparado con el
volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando
volmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total.
- Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran
profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado
homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.
1.5. Caracterizacin del comportamiento cromatogrfico de un soluto
Los resultados de la cromatografa de filtracin en gel se expresan habitualmente en
forma de grficas (cromatogramas) donde se representa la cantidad de solutos en
funcin del volumen de lquido extrado de la columna (Fig. 3).
Se pueden utilizar varios parmetros para
caracterizar
el
comportamiento
cromatogrfico de una sustancia:
- Volumen de elucin (Ve). Se define como el
volumen de lquido necesario para extraer
una determinada sustancia. Presenta el
inconveniente de depender fuertemente del
volumen total de la columna. El volumen de
elucin (Ve) de una sustancia vara entre Vt y
Vo.