TP 2

Caracterización de Biomoléculas
(lípidos y proteínas)

y actividad enzimática

Cecilia V. Cimino

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I. LÍPIDOS
1- Extracción
2- Separación por Cromatografía en Capa FinaTLC

II. PROTEÍNAS
1- Caracterización
2- Estabilidad

III.ENZIMAS
1- Extracción
2- Determinación de actividad

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 I- LÍPIDOS

Sustancias insolubles en agua

Solubles en solventes no polares

Pertenecen al grupo de las biomoléculas

NO son macromoléculas.

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 1- Extracción

Separación o aislamiento de un componente del seno de una mezcla

Extracción con una mezcla de solventes orgánicos

Muestras: yema de huevo, semillas de girasol, aceite de maíz y mayonesa comercial.

Mezcla de Folch  Tapar, agitar  una fase  cloroformo + agua  Agitar

(cloroformo/metanol: 2/1)

Separar fase orgánica

Muestra para
sembrar en TLC

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 Cromatografía en Capa Fina (TLC)
2- separación
Fase móvil: hexano/éter etílico/acido acético
Fase estacionaria: sílica

•Dos fases: estacionaria y móvil

(solventes).
•La muestra se coloca en la fase
estacionaria,
•La fase móvil la atraviesa
•Cada componente se movilizará con
una velocidad de migración que
dependerá de su afinidad por ambas
fases.

A mayor afinidad por la fase

estacionaria, menor velocidad de
migración.

 Efectiva y versátil para separar

lípidos polares y neutros.
 Ventajas: simplicidad, facilidad de
manipulación, alta sensibilidad, alto
poder de resolución, rapidez.

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 Revelado
con vapores de iodo Menos triglicéridos
(interacciona con los polar
lípidos dando un color
pardo )

colesterol

En el TP se utiliza una
mezcla de solventes para
separar lípidos no polares
(neutros)
Más polar fosfolípidos

Criterio de No identificación

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 II- PROTEÍNAS
1- caracterización: R. biuret

•Reactivo Cu++ en medio

alcalino
Fundamento
• (+) color violeta complejo de
coordinación entre el Cu++ y los
pares electrónicos libres
nitrógenos (imino de la unión
peptídica)
• Son necesarias por lo menos
dos uniones peptídicas

• Controles negativos y positivos

• Ensayo cualitativo (presencia)
• Ensayo cuantitativo: (cantidad)
curva de calibración)

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 Tipo de Ensayo Solución a investigar
Control Negativo (Blanco) Agua destilada
Control Positivo Caseína al 0,1%
Muestra 1 Gelatina comercial al 1%
Muestra 2 Clara de huevo al 10%

Resultados:

Negativo Positivo Positivo Positivo

(Blanco) (Gelatina) (Caseína) (Clara)

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 2 - Estabilidad de Proteínas en Dispersión Acuosa

Proteínas: estabilizadas
en solución por dos
factores:
• hidratación
• carga eléctrica

Capa de hidratación
Capa de contraiones

Distintos agentes influyen sobre la

estabilidad de las proteínas:
• pH Desnaturalización: pérdida de todas las
• Sales estructuras de la proteína (menos la
• Solventes orgánicos primaria) con disminución de su solubilidad.
• Temperatura
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2.1 – efecto del ph

AcH NaOH

Caseína

suspensión proteica sobrenadante

+ agente Las variaciones de pH
desestabilizante alteran la ionización
de las cadenas
laterales de la
proteína, variando su
distribución de carga y
pérdida de estabilidad precipitado su conformación.

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2.2 – efecto de las sales

Sulfato de NaOH
amonio
Gelatina

La acción de soluciones salinas concentradas

alteran la capa de hidratación de las proteínas
disminuyendo su solubilidad.

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2.3 – efecto de las solventes orgánicos

Acetona NaOH
fría
Caseína

La acción de disolventes orgánicos

alteran las interacciones hidrofóbicas
de la proteína, variando su
conformación.

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 III - Enzimas

Las enzimas son un tipo especial de proteínas que requieren condiciones

óptimas de acción, catalizan reacciones químicas específicas y que para su
funcionamiento resulta esencial mantener la conformación nativa.

Si se desea detectar actividad enzimática en un extracto biológico, no

basta con determinar la existencia de la proteína, sino que se requiere un
ensayo que pruebe que la misma es funcional

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 Actividad de la catalasa

Para medir la actividad enzimática se requiere un método

analítico sencillo que determine el consumo del sustrato o la
formación de productos de reacción.

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 III.1 -Extraccion de la catalasa

Biuret

Disgregación Actividad
Filtración Centrifugación
en mortero
en frío
enzimática

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III.2 - Determinación de la actividad enzimática

Stock
NaOHde catalasa
H2O2
Agua O2
destilada

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 Actividades de desarrollo

1. a) ¿Por qué cree que luego de la extracción con la mezcla de Folch los lípidos quedan
retenidos en la fase clorofórmica?
b)¿Qué característica importante de los lípidos hace posible esta extracción?
c) En la fase orgánica obtenida, ¿cree que estén presentes otras biomoléculas?

2. a) ¿Por qué cree necesario el paso de revelado luego de la cromatografía?

b)¿Cree que en las muestras utilizadas hay más de un tipo de lípidos? ¿Cómo llega a esta
conclusión?
c) ¿Qué característica de los lípidos determina este comportamiento en la TLC?
d) Si luego del revelado usted puede visualizar dos manchas a la misma distancia del punto de
siembra, puede asegurar que se trata del mismo lípido?

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3. Qué reacciones de caracterización realizaría para verificar que la gelatina está
constituida por proteínas? Cuál es el fundamento de esta reacción de caracterización?
Indicar reactivos y visualización de la reacción.

4. a)Si realiza la reacción del Biuret sobre una solución del aminoácido alanina, obtendrá
resultado (+) o (-)? -¿Puedo utilizar el método de Biuret para identificar albúmina bovina
en una mezcla de proteínas? Fundamente su respuesta.
b) ¿En qué caso el resultado de la reacción de Biuret puede generar un falso negativo?
c) Se realiza la reacción de Biuret en una muestra problema y los resultados son los
siguientes: agua destilada: (-) muestra: (-) solución de caseína al 1%: (+) Explique los
resultados obtenidos

5. a) Explique el efecto del (NH4)2SO4 sobre las proteínas.

b)¿Qué información aporta el conocer el valor de la actividad enzimática a diferentes
valores de pH?
c) ¿Usted piensa que el desprendimiento de burbujas a partir de agua oxigenada se
puede producir con una enzima que no sea la catalasa?

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