INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Departamento de Bioqumica
Dr. Guillermo Carvajal Sandoval

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

REPORTE DE PRCTICA
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS
DE JUGOS DE FRUTOS POR CROMATOGRAFA
BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA.

Profesora: Acua Gonzlez Carolina.

Grupo: 5QM2
Seccin: 2

OBJETIVOS
Separar e identificar los aminocidos presentes en jugos de frutos por cromatografa
bidimensional en capa fina, comparando sus valores de Rf con los de soluciones tipo de
aminocidos.
 Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con el de la
unidimensional.
Identificar las posibles fuentes de errores que afectan a la tcnica.

FUNDAMENTO
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se
distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra
se mueve (fase mvil) en una direccin definida.
El proceso cromatogrfico se da como resultado de la mayor o menor capacidad para ser retenidos los
diferentes componentes de una muestra por la fase estacionaria, es decir, se basa en los repetidos
procesos de interaccin durante el movimiento de los componentes de una mezcla arrastrados por la
fase mvil a lo largo de la fase estacionaria, producindose la separacin debido a las diferencias en
las constantes de distribucin de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la mvil.
La cromatografa bidimensional se refiere al proceso cromatogrfico en el que se utilizan dos fases
mviles sobre la misma fase estacionaria, se realiza el desarrollo en direccin ascendente con el
primer solvente, posteriormente se elimina este por evaporacin, y se gira la placa 90 grados,
realizando ahora el desarrollo ascendente con el segundo solvente. Tras la eliminacin del segundo
solvente, se determina la posicin de los componentes con un reactivo de revelado generalmente
ninhidrina, y las manchas originadas se identifican comparando sus posiciones con las de los
estndares.

RESULTADOS

7
10
6 7
4 9 10
3 8 2
2 3 9
8
1 5 1 6
4 5
MP MP
A) B)
Fig.1Cromatogramas unidimensionales en capa fina de algunos aminocidos. A) Cromatofolio
desarrollado con la primera fase mvil cloroformo-metanol-amoniaco (2:2:1) y B) Cromatofolio
desarrollado con la segunda fase mvil butanol-cido actico-agua (3:1:1). Aminocidos
empleados para ambas cromatografas: 1) Alanina, 2) Acido Glutmico, 3) Glicina, 4) Histidina, 5)
Lisina, 6) Metionina, 7) Fenilalanina, 8) Prolina, 9) Treonina y 10) Tirosina. Muestra Problema:
Jugo de mandarina. Reveladas con ninhidrina al 2% y etanol al 96%.

Laboratorio de Mtodos Analticos. Separacin e identificacin de aminocidos de jugos de frutos por cromatografa
bidimensional en capa fina.
2
 C) D)

Fig 2. Cromatogramas bidimensionales en capa fina empleando dos fases mviles cloroformo-
metanol-amoniaco (2:2:1) y butanol-cido actico-agua (3:1:1). C) Cromatoplaca con soluciones tipo
de aminocidos. D) Cromatoplaca con muestra problema (jugo de mandarina).

CLCULO DE LOS VALORES DE RF

Frente del soluto

Rf =
Frente deldisolvente

Aminocido Alanina
1.1
Rf =
8.6

Rf =0.12

Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales de aminocidos tipo desarrollados en las dos

fases mviles.
Aminocido 1 Fase mvil 2 Fase mvil

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bidimensional en capa fina.
3
 Frente de Frente de Frente de Frente de
Rf Rf
soluto disolvente soluto disolvente
Alanina 1,1 8,6 0,1279 1,1 7,6 0,1447
Lisina 1,2 8,4 0,1429 0,8 7,6 0,10526316
cido
3,1 8,6 0,3605 2,7 7,6 0,3553
Glutmico
Glicina 3,2 8,5 0,3765 2,3 7,6 0,3026
Prolina 3,3 8,4 0,3929 2,1 7,6 0,2763
Histidina 4,1 8,4 0,4881 0,85 7,6 0,1118
Treonina 4,2 8,4 0,5000 2,6 7,6 0,3421
Metionina 4,6 8,4 0,5476 1,5 7,6 0,1974
Tirosina 4,9 8,4 0,5833 4,4 7,6 0,5789
Fenilalanina 5,6 8,4 0,6667 4,6 7,6 0,6053
Problema
9 manchas 9 manchas
(Mandarina)

Tabla 2. Cromatograma bidimensional de aminocidos tipo desarrollado en las 2 fases

mviles.
1 Fase mvil 2 Fase mvil Aminocido
No. De
Frente de Frente de Frente de Frente de correspondient
Mancha Rf Rf
soluto disolvente soluto disolvente e
1 1,3 7,9 0,1646 0,6 7,8 0,0769 Alanina
2 1,4 7,9 0,1772 1 7,7 0,1299 Lisina
4 3,2 7,9 0,4051 2,4 7,6 0,3158 Glicina
3 3,3 7,9 0,4177 1,9 7,6 0,2500 . Glutmico
5 3,6 7,9 0,4557 2,1 7,6 0,2763 Prolina
7 4,6 7,7 0,5974 2,5 7,7 0,3247 Histidina
6 4,8 7,7 0,6234 1,5 7,7 0,1948 Tirosina
8 4,8 7,7 0,6234 2,3 7,7 0,2987 Treonina
9 4,9 7,7 0,6364 4,4 7,7 0,5714 Metionina
10 6,1 7,7 0,7922 4,6 7,7 0,5974 Fenilalanina

Tabla 3. Cromatograma Bidimensional de Jugo de Mandarina desarrollado en las 2 Fases

mviles.
1 Fase mvil 2 Fase mvil
No. De
Frente de Frente de Frente de Frente de
Mancha Rf Rf
soluto disolvente soluto disolvente
2 0,8 8,6 0,0930 1,2 7,7 0,1558
1 0,9 8,5 0,1059 0,9 7,7 0,1169
4 1,5 8,5 0,1765 2,2 7,7 0,2857
7 1,7 8,4 0,2024 3,2 7,7 0,4156
3 2,1 8,5 0,2471 2,4 7,8 0,3077
5 3 8,5 0,3529 2,6 7,8 0,3333
8 4,5 8,4 0,5357 4,5 8 0,5625
6 4,6 8,4 0,5476 3,9 8 0,4875

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bidimensional en capa fina.
4
 9 4,9 8,3 0,5904 4,7 8,1 0,5802

Tabla 4. Cromatograma Bidimensional de Jugo de Mandarina desarrollado en las 2 Fases

mviles.
Aminocido
No. De Mancha 1 Fase mvil 2 Fase mvil
correspondiente
2 0,0930 0,1558 Alanina
1 0,1059 0,1169 Lisina
4 0,1765 0,2857 Glicina
7 0,2024 0,4156 Tirosina
3 0,2471 0,3077 Prolina
5 0,3529 0,3333 Treonina
8 0,5357 0,5625 Metionina
6 0,5476 0,4875 A. Glutmico

PREGUNTAS EXTRAS
1. Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado
como problema.
cido asprtico, cido glutmico, Alanina, Fenilalanina, Glicina, Hidroxiprolina,
Isoleucina, Lisina, Metionina, Prolina, Serina, Tirosina, Treonina, Triptofano, y Valina.

2. Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un

aminocido.

3. Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Explique su respuesta.

Si, se pueden cambiar el orden de los solventes y obtener los resultados. Pero por lo
general en este tipo de tcnicas se busca que el primer solvente sea ms fcil de
eliminar que el segundo.

4. Indique las posibles fuentes de error de esta tcnica.

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bidimensional en capa fina.
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 -No colocar la cromatofolio correctamente en la cmara. Si esta no es colocada de
manera correcta el solvente pude ascender por las paredes ms rpido.
-No utilizar guantes durante la prctica. Al no utilizar guantes la grasa de los dedos
puede dejar huellas sobre la cromatofolio y al ser reveladas pueden dar falsos
positivos.
-El nivel del solvente en la cmara se alto. Si el nivel del solvente sobrepasa los puntos
de aplicacin de la mezcla, esta no se podr separar correctamente.
5. Tres aplicaciones de cromatografa en capa fina.
Industria farmacutica, separacin y cuantificacin de ingredientes activos.
Industria alimenticia, cuantificacin de edulcorantes y vitaminas.
Materias primas, cuantificacin de pureza.

DISCUSIN
Entre las tecnicas ms poderosas que dispone un analista para la separacin de mezclas
complejas como aminocidos o lpidos, existe un grupo de mtodos altamente eficaz
denominados cromatografas (escritura por color) [1]. Para llevar a cabo la separacin de una
mezcla de aminocidos en jugo de mandarina en el laboratorio, realizamos una cromatografa
unidimensional y una bidimensional en capa fina, esta ltima tcnica tiene la particularidad de
utilizar dos fases mviles sobre la misma fase estacionar lo cual la hace ser ms sensible
para la separacin de compuestos. Durante la cromatografa se utiliz como fase estacionaria
slica gel y dos fases mviles, la primer fase mvil contena cloroformo-metanol-amoniaco (2:2:1)
y la segunda butanol-cido actico-agua (3:1:1).
Para el desarrollo de la cromatografa unidimensional se utilizaron dos cromatofolios. En el primero se
aplic 10 diferente aminocidos tipo y la muestra problema que fue jugo de mandarina, para
posteriormente desarrollarla slo con la primer fase mvil. En el segundo cromatofolio se volvi aplicar
nuevamente los 10 diferentes aminocidos tipo y la muestra problema, con la diferencia de que esta
fue desarrollada solamente con la segunda fase mvil (Fig 1). Una vez que se efectuaron se marcaron
los frentes del disolvente y se dej eliminarlos, a continuacin se revelaron por aspersin con
ninhidrina al 0,2% y etanol al 96%, aplicando aire caliente para acelerar la reaccin hasta observar la
aparicin de manchas.
En el desarrollo de la cromatografa bidimensional tambin se ocuparon dos cromatofolios. El primer
cromatofolio se coloc los 10 aminocidos tipo sobre el mismo punto de aplicacin y en el segundo
cromatofolio sobre el punto de aplicacin se coloc slo la muestra problema, posteriormente las dos
fueron desarrolladas con la primer fase mvil, una vez que estas desarrollaron se marc el frente de
disolvente, se dejaron secar para as eliminar la primer fase y poder pasarlas a la segunda fase
mvil. Una vez que secaron se giraron en ngulo recto quedando la lnea de aplicacin de manera
paralela a la fase despus de que se efectuaron se volvi a marcar el segundo frente de disolvente y
dejaron secar para eliminarlo, finalmente se revelaron por aspersin como en la unidimensionales
(figura 2).

Al observar la aparicin de manchas en las cuatro cromatogramas, se marcaron cada una de

ellas con lpiz. Por ser un mtodo cualitativo se observ que cada una de ellas tena una
tonalidad de morado distinto, la cual es proporcional a la cantidad de aminocido presente,
tambin se observ en las placas unidimensionales una mancha que presento color amarillo,

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bidimensional en capa fina.
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 este color es producido por aminocido prolina, debido a que este y la hidroxiprolina no posee
estructuralmente un grupo amino libre, sino un grupo mino, la coloracin final es amarilla. Por lo que
en las cromatogramas bidimensionales rpidamente la mancha amarilla observada se dedujo que era
prolina.

Para identificar cada una de los aminocidos se calcul el valor de factor de retardo (Rf) en los
cromatogramas unidimensionales para las dos fases mviles enlistndolos de manera creciente de Rf
de la primera fase mvil (tabla 1).
Por lo que se observa que el aminocido con el valor de Rf ms bajo es la alanina esto debido a que la
fase estacionaria es muy polar, por lo que interacciona con los aminocidos que sean muy polares, y
cuanto ms interacciona, menos migran. Por el contrario como la fenilalanina es un aminocido no
polar y es menos retenido, migrando junto con la fase mvil y por lo tanto su valor de Rf es ms alto.
Para los cromatogramas bidimensional de aminocidos tipo y la muestra problema, se emplearon los
clculos de Rf para los dos solventes, enlistados de igual manera de forma creciente de la primer fase
mvil, el valor ms bajo en el cromatograma de aminocidos tipo fue nuevamente la alanina (tabla 2),
y al comparar este valor con la tabla 3 se observa que corresponde a este aminocido. Lo mismo
sucede con la fenilalanina siendo este el valor ms alto se identifica tambin en el cromatograma de
jugo de mandarina (tabla 4).
La referencia consultada menciona que los aminocidos en mayor cantidad que contiene el jugo de
mandarina son el cido glutmico y la glicina, esto coincide con la mancha que se observa en el
cromatograma bidimensional problema, la mancha es muy grande y de color morado muy intenso
(mayor concentracin), la concentracin es tan grande de estos dos compuestos que no se logran
separa bien.

CONCLUSIONES
Separaron los aminocidos presentes en jugo de mandarina por cromatografa
bidimensional en capa fina, la cual muestra mejor resolucin y separacin en
comparacin con una unidimensional.
Los aminocidos tipo comparados e identificados en el jugo de mandarina fueron
cido glutmico, glicina, histidina, fenilalanina, entre otros.
Los aminocidos identificados en mayor cantidad en el jugo fueron cido glutmico y
glicina, los cuales coinciden con la bibliografa.
Se deben tomar en cuenta todas las posibles fuentes de error durante la tcnica,
para no cometerlas y tener los mejores resultados posibles.

REFERENCIAS
Fieser L.F; Fieser M; Qumica Orgnica Fundamental, (1985) Espaa; Editorial REVERT;
Pp. Consultadas 318-319.

Laboratorio de Mtodos Analticos. Separacin e identificacin de aminocidos de jugos de frutos por cromatografa
bidimensional en capa fina.
7
 Gennaro, Alfonso R., Remington farmacia, (2003) Buenos Aires 20 ed. Editorial
Medica Panamericana. Pp. Consultadas 685-688. [1]
Harper; Bioqumica Ilustrada; (2003); China; 29 Edicin, Editorial Mc Graw Hill; Pp (29).

. Aminocidos de la mandarina. http://alimentos.org.es/aminoacidos-mandarina.

Consultada el 05/03/17 a la 1:53 am.

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bidimensional en capa fina.
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