Manual de Prácticas de Bioquímica

PRACTICA N° 4 y 5

CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS

Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras
formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y
combinaciones que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el
número posible de proteínas es realmente muy grande.

Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan
como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como
enzimas, hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de
energía, etc.

Muchas proteínas son lábiles y fácilmente modificables por una serie de agentes:
variaciones del pH, radiaciones ultravioleta, calentamiento en solución acuosa, solventes
orgánicos, etc., que determinan cambios dentro de su molécula (alteraciones de la disposición
de las cadenas peptídicas) y modificaciones en sus propiedades, constituyendo la llamada
“desnaturalización”.

Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de

proteínas para su caracterización y cuantificación posterior.

I. PRECIPITACION DE PROTEINAS
Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan estabilizadas
por ambas cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de estas influencias
estabilizadoras es removida, la proteína precipita algunas veces; cuando ambas de estas
influencias son eliminadas, la proteína siempre precipita.

1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico. Las proteínas, como los aminoácidos, son
menos solubles en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas
ajustando el pH de la solución al punto isoeléctrico de la proteína.

1.2. Precipitación por Sales. La adición de una sal neutra causa la precipitación de las
proteínas. Las diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto
ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. El efecto de la sal es eliminar el
agua de solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la interacción
proteína-proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente usada para este
tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble.

1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. La adición de ciertos solventes orgánicos,

como etanol y acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más
fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan
agua, así disminuyen la interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo
a 0°C, de otro modo puede ocurrir desnaturalización.

1.4. Precipitación por Aniones Complejos. Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico,
pícrico, tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación
probablemente se debe a la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre.
Este tipo de precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que
se le lleva a la proteína.

1.5. Precipitación por Metales Pesados. Los cationes de metales pesados como mercurio,
plomo, cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El
catón libre disminuye la carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos

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iones algunas veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para
formar sulfuros.

II. DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS

Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier
fuerza que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace
peptídico causa desnaturalización. Las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades
diferentes a las proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la
desnaturalización disminuye la solubilidad de las proteínas en agua, porque el arreglo de los
grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie, está destruido. Son comunes agentes
desnaturalizantes, el calor, pH extremo, oxidación y reducción los cuales afectan el enlace
disulfuro, agitación, radiación y urea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades
para cada agente desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso reversible.
Algunas veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la urea, a proteína nativa es
restaurada.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE

LA CASEINA.

FUNDAMENTO
El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es
eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de
cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y
precipitan, pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga
neta de todos los grupos disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual
a cero. La superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de
los electrolitos presentes y del solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos;
pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para
el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este
momento el número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa
es mínimo o nulo. Como las cargas del mismo signo se rechazan, en estas condiciones
algunas moléculas pueden formar agregados en lugar de rechazarse. Pero a ambos lados del
punto isoeléctrico, todas las moléculas tienen una carga neta positiva o negativa; estas
moléculas se rechazan, y es mínima la tendencia a la agregación y precipitación. Por tanto, en
general, el pH coincide con la solubilidad mínima de las proteínas.

Los solventes orgánicos como el etanol, también causan precipitación de proteínas de

un proceso que puede ser atribuido generalmente a la acción deshidratante.

Cada proteína tiene un determinado punto isoeléctrico (Tabla 1) que puede ser
determinado aprovechando algunas propiedades de las proteínas que están comprometidas,
utilizando por lo general efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas. Algunas proteínas,
como la caseína de la leche son fácilmente precipitables, ajustando el pH de la solución a su
pI, por lo cual este procedimiento se describe como “precipitación isoeléctrica”.

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Tabla 1. Punto Isoeléctrico de algunas proteínas

PROTEÍNA pI
Ovoalbúmina 4.6
Tiroglobulina 4.6
Caseína 4.7
Gelatina 4.7
Seroalbúmina 4.8
(humana)
Fibrinógeno 5.5
Seroglobulinas 6.4 – 7.2
Homoglobulina 6.9
(caballo)
Mioglobina (caballo) 7.0

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N
Acido acético 1 N
Acido acético 0.1 N
Acido acético 0.01 N
NaOH al 10%

METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua destilada 8.38 7.15 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Ac. Acético 0.01 N 0.62 1.75 - - - - - - -
Ac. Acético 0.1 N - - 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
Ac. Acético 1.0 N - - - - - 1.6
Caseína 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

DATOS EXPERIMENTALES
Agitar los tubos antes y después de agregar la solución de caseína. Haga el cálculo del
pH teórico para cada uno de los tubos. Anote los resultados, marcando la falta de turbidez con
0, los grados de la misma con signos + (emplee hasta ++++ con la máxima turbidez), según
corresponda para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el
máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto
isoeléctrico y al de solubilidad mínima de la caseína. Observar a los 10 minutos y 20 minutos,
anote los cambios. Seguidamente calentar los tubos en baño maría a 37 °C y anote sus
apreciaciones. Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe los cambios.

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH teórico
Turbidez inmediata
Turbidez a los 10 min
Turbidez a los 20 min
Turbidez y precipitado
después de calentar
NaOH 0.1 N

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RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Presente fotos y explique los resultados.

EXPERIMENTO N° 2. DESNATURALIZACION DE PROTEINAS

FUNDAMENTO
Una proteína está en su estado nativo cuando existe en su forma natural dentro de las
células. El aislamiento de proteínas tiene por objeto no alterar este estado nativo y si este se
altera se dice que la proteína se ha desnaturalizado. La desnaturalización proteica se debe a
la ruptura de los enlaces secundarios, como puentes de hidrógeno y enlaces de tipo iónico, lo
que hace que la estructura globular de la proteína se altere desenrollándose la molécula,
ocurriendo la precipitación. En el estado desnaturalizado, las proteínas se vuelven menos
solubles. Esta solubilidad puede ser restablecida por acción de álcalis o bases.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de albúmina da huevo al 1%
Acido acético
Acido clorhídrico
Nitrato de plata
Nitrato de potasio

METODO DE TRABAJO
a) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH:
En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo
1 agregue 10 gotas de HCl concentrado, al tubo 2 agregue 10 gotas de ácido acético glacial
y al tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de
Biuret a cada tubo.

DATOS EXPERIMENTALES
Anote sus observaciones.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + HCl
2 Albúmina + CH3COOH
3 Albúmina + Agua destilada

b) Desnaturalización de las proteínas por acción de los metales pesados:

En 3 tubos de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina a cada uno de ellos. Al tubo
1 agregue 10 gotas de nitrato de plata, al tubo 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y al
tubo 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret
a cada tubo.

DATOS EXPERIMENTALES
Anote sus observaciones.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + Nitrato de plata
2 Albúmina + Nitrato de potasio
3 Albúmina + Agua destilada

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c) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura:

En un tubo de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina. Lleve el tubo al calor
(llama de mechero). Luego realice la prueba de Biuret.

DATOS EXPERIMENTALES
Anote sus observaciones.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + Calor

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Presente fotos, analice los resultados anote sus conclusiones

EXPERIMENTO N° 3. PRECIPITACION POR SALES DE METALES PESADOS Y IONES

NEGATIVOS.

FUNDAMENTO
Las proteínas pueden ser precipitadas de una solución con varios iones positivos o
negativos.

Los iones positivos comúnmente usados son aquellos de metales pesados, tales como
el zinc, cadmio, mercurio, fierro, cobre y plomo. Estos iones precipitan las proteínas de
soluciones alcalinas, porque a este pH la proteína está disociada como proteína- (anión), la
cual se combina con los iones metálicos positivos para dar un precipitado insoluble de
proteinato de metal. Estos iones metálicos pueden ser removidos del proteinato de metal por
acidificación, lo cual convierte a la proteína negativa en proteína positiva.

Los iones negativos (aniones) más usados son el tungstato, fosfotungstato,

tricloroacetato, picrato, tanato, ferrocianato y sulfosalicilato. Estos precipitan proteínas de
soluciones ácidas, es decir, cuando la proteína está carada positivamente (catión), formando
sales de proteínas. Muchas de estas sales son insolubles y son la base de los métodos de
desproteinización.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 1%
Solución de ovoalbúmina al 1%
Cloruro de mercurio al 5%
Acetato de plomo al 10%
Ácido acético al 5%
Ferrocianuro de potasio al 10%
Ac. Tricloroacético al 10%

METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:

TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caseina 0.5% 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 - - - - -
Ovoalmúmina 1% - - - - - 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Cloruro de mercurio 5% 0.5 - - - - 0.5 - - - -
Acetato de plomo 10% - 0.5 - - - - 0.5 - - -

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Ac. Acético 5% - - 0.5 - - - - 0.5 - -

Ferrocianuro de potasio 10% - - - 0.5 - - - - 0.5 -
Ac. Tricloroacético 10% - - - - 0.5 - - - - 0.5

DATOS EXPERIMENTALES
Anote los resultados en la tabla. Luego a los tubo 3, 4, 7 y 9 agregue NaOH 10% gota a
gota y observe los resultados.

Caseina Ovoalmúmina NaOH

Cloruro de mercurio
Acetato de plomo
Ferrocianuro de potasio
Ac. Acético
Ac. Tricloroacético

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Presente fotos, analice los resultados anote sus conclusiones.

EXPERIMENTO N° 4. ESTIMACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTEINAS.

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BIURET

FUNDAMENTO
Este método colorimétrico es una prueba confiable para determinar la concentración de
proteínas, pero requiere cantidades relativamente grandes de proteínas.

El reactivo de Biuret es sulfato de cobre diluido en una solución alcalina. Los compuestos que
tienen dos o más enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos para dar un complejo
que tiene un característico color púrpura o violáceo. No está demás recalcar, que la proteínas
dan un color violeta intenso, las proteosas y peptonas (que son productos de la hidrólisis de
las proteínas solubles en agua y no coagulables por el calor) dan color rosado intenso y los
péptidos dan un color rosado claro. La gelatina da un color azul, y; de los aminoácidos, la
histidina es el único que da positiva la reacción de biuret.

MATERIALES
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Espectrofotómetro
Estándar de proteínas (Albúmina de suero Bovino) 10 mg/ml en NaOH 1 N
NaOH 1 N
Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de Tartrato de sodio y potasio
en 500 ml de agua destilada. Añadir agitando constantemente 300 ml de NaOH al 10%.
Completar a 1000 ml con agua destilada

PROCEDIMENTO
a) Determinación cualitativa de proteínas. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la
solución a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret. Se
mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Si la prueba es positiva se desarrollará un
color violeta.

b) Curva Estándar para proteínas. A una cantidad de proteína en un rango comprendido

entre 2 a 10 mg se le adiciona NaOH para obtener un volumen final de 1.0 ml. Luego se le
agrega 4.0 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C.
Transcurrido este tiempo se lee en el fotocolorímetro frente a un blanco apropiado (1.0 ml
de NaOH más 4.0 ml de Biuret). Anote sus resultados. Determinar el factor de calibración.

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DATOS EXPERIMENTALES

Tubo [Proteína]
Ab Fc
N mg/ml
Bl -
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10

Para obtener la curva de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores de
absorbancia en las ordenadas y la concentración de proteína en las abscisas.

c) Determinación cuantitativa de proteínas. Se toma 1.0 ml de suero diluido 10 veces

(1:10). Se añade 4.0 ml del reactivo de Biuret, se agita y se deja en reposo durante 30
minutos a 37 °C. Transcurrido este tiempo se lee en espectrofotómetro a 540 nm frente a
un blanco apropiado.

Determinar la cantidad de proteína en mg/ml teniendo en cuenta el factor de

calibración determinado anteriormente.

*En los cálculos no se olvide de la dilución realizada*

CUESTIONARIO
1. Al titular 2.0 ml de una solución de proteína al 7% entre pH 11.5 y 13.5, se gastaron 1.8
ml de NaOH 0.001N. Estimar el número de residuos de arginina que tiene dicha proteína,
sabiendo que su peso molecular es de 93.330.

2. Qué pH eligiría para separar mediante electroforesis una mezcla de las siguientes
proteínas:
Mezcla A: Ureasa (pI = 5.0) y Seroalbúmina (pI = 4.9)
Mezcla B: Mioglobina (pI = 7.0) y Citocromo C (pI = 10.6)

3. La insulina es sintetizada en las células ß del páncreas a partir de la proinsulina, que es un

polipéptido de una sola cadena. Señale los métodos que Ud. utilizaría para realizar la
separación de ambas proteínas, teniendo en cuenta los siguientes datos fisico-químicos.
Indique los resultados que esperaría encontrar al usar cada uno de los métodos que
propone. Proinsulina: PM = 6000, pI = 5.3; Insulina: PM = 9000, pI = 6.4.

4. Una muestra de suero sanguíneo tiene 6.7 g de proteínas totales. Mediante la electroforesis
en papel se analizan sus fracciones proteicas y se encuentran los siguientes porcentajes:
Albúmina 55%, -1-Globulina 6%, -2-Globulina 9%, -Globulina 11% y -Globulina 19%.
Encontrar el contenido de cada fracción proteica en g%. Determine si existe alteración en la
concentración de cada una de estas proteínas.

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